心肌胰岛素抵抗及葡萄糖代谢紊乱是糖尿病心肌病变的共同特征和主要发病机制。所以寻求既能降低血糖，又能改善心肌能量代谢的药物，对心脏病合并糖尿病患者临床治疗意义重大。有研究表明胰岛素除降糖作用外对心脏也有保护作用，其机制可能与增加心肌细胞葡萄糖摄取，改善心肌能量代谢有关[1, 2]。同时有研究显示：胰岛素可以通过PI3K-AKT信号通路对氧化应激心肌细胞有保护作用，但其具体作用机制尚不清楚[3]。
本研究拟采用免疫荧光、流式细胞、激光共聚焦显微镜成像等技术探讨胰岛素对H9c2心肌细胞葡萄糖摄取的影响以及PI3K-AKT信号通路与其的关系。探索胰岛素对心肌细胞葡萄糖摄取的促进能力及其机制，尝试对糖尿病合并心脏病的治疗提供新思路。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 材料及仪器
胰岛素(普通胰岛素，购于华西药业)；DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清(HyClone)；PI3K-AKT抑制剂LY294002及p38MAPK抑制剂BIRB796 (Selleck,America)； 荧光标记2-脱氧葡萄糖(Invitrogen)；FITC标记羊抗兔二抗、Cy3标记 羊抗兔二抗(北京中杉金桥)。Anti-GLUT1、Anti-GLUT-4 (北京博奥森)。 荧光酶标仪(MD，America)；流式细胞仪(BD，America)；激光共聚焦显微镜 (Leica，Germany)；KRB溶液：NaCl 129 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，KH2PO4 1.2 mmol/L，CaCl2 1.0 mmol/L，MgSO 41.2 mmol/L，NaHCO3 5.0 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，pH 7.4。 1.1.2 细胞培养
H9c2心肌细胞(一种具有心肌功能的特异心肌细胞株)，购自中科院上海细胞生物学研究所。我们使用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养H9c2心肌细胞，放置于37 ℃恒温培养箱中生长，每瓶细胞长至80%~90%时可用于实验。常规用浓度为0.25%胰蛋白酶消化培养瓶中细胞，并传代接种于6、24孔板或96孔板，根据实验需要选择不同孔板的细胞进行实验。 1.2 方法 1.2.1 激光共聚焦显微镜显示H9c2心肌细胞摄取2-NBDG的能力
将培养于24孔板的H9c2心肌细 胞分为2组，每组10个孔。第1组为空白对照组，加入200 μL KRB孵育30 min，第2组为荧光葡萄糖摄取组(2-NBDG孵育组)，加入200 μL 2-NBDG(100 μmol/L) 孵育30 min。取出培养板后每孔用KRB洗3次，然后在每组中加入100 μL KRB维持液，对2组细胞用共聚焦显微镜观察并拍摄。 1.2.2 检测胰岛素孵育H9c2细胞最佳时间
将96孔板里每孔长至90%的H9c2心肌用于实验。将实验分为6个组，选用胰岛素为100 μmol/L处理H9c2心肌细胞，胰岛素孵育时间分别为0、10、20、30、40、50 min，然后用KRB溶液冲洗2次，运用荧光酶标仪检测不同组间H9c2心肌细胞内荧光强度，并记录实验数据；我们通过每组加入CCK-8 10 μL孵育4 h后再次读数来校正因细胞数量差异而导致的误差。每次实验重复3次。 1.2.3 检测胰岛素孵育H9c2细胞最佳浓度
用同样的方法检测Insulin孵育H9c2心肌细胞的最佳浓度，将实验分为不同浓度胰岛素处理的6个组：0、50、100、200、400、800 μmol/L，每组内均加入2-NBDG(100 μmol/L，200 μL)，于37 ℃培养箱中孵育20 min后用KRB洗2次，使用荧光酶标仪检测细胞内荧光强度变化。通过每组加入CCK-8 10 μL孵育4 h后再次读数来校正因细胞数量差异而导致的误差。每次实验重复3次。 1.2.4 运用流式细胞仪检测H9c2心肌细胞对葡萄糖的摄取
将培养于6孔板的H9c2心肌细胞分为 5组：第1组为空白对照组(NC组)，第2组为2-NBDG组，第3组为Insulin组，第4组为Insulin+PI3K-AKT信号通路抑制剂组(LY294002组)，第5组为 Insulin+p38MAPK通路抑制剂BIRB796处理组(BIRB796组)。各组2-NBDG浓度为100 μmol/L，Insulin 浓度为200 μmol/L，p38MAPK抑制剂BIRB76浓度为1 μmol/L。 各组均于37 ℃培养箱内孵育30 min，然后取出用KRB溶液洗2次。0.25%胰蛋白酶消化每组细胞后收集，运用流式细胞技术检测每组细胞内平均荧光强度，并记录实验数据。每组实验重复3次。 1.2.5 不同处理条件下H9c2心肌细胞葡萄糖转运体-1(glucose tansporter-1，GLUT-1)、葡萄糖转运体-4(glucose tansporter-4，GLUT-4)的表达
H9c2心肌细胞接种于每孔预置盖玻片的24孔板内，细胞长至玻片面积的50%～60%时分为2组，1组为GLUT-1组，2组为GLUT-4组，每组加入胰岛素200 μmol/L处理30 min。两组细胞均用4%多聚甲醛固定20 min，然后5% BSA封闭60 min；第1组加入GLUT-1抗体(1 ∶100稀释)，第2组加入GLUT-4抗体(1 ∶100稀释)，4 ℃湿盒过夜；次日再用PBS漂洗2次。在GLUT-1组加入FITC标记羊抗兔IgG二抗(1 ∶50稀释)，GLUT-4组加入Cy3标记羊抗兔IgG二抗(1 ∶50稀释)，37 ℃水箱中孵育1 h；最后用防荧光淬灭剂封片，激光共聚焦显微镜下成像。 1.3 统计学分析
采用SPSS 18.0软件进行数据分析，计量资料以x±s 表示，多组间比较应用单因素方差分析。 2 结果 2.1 H9c2心肌细胞能有效摄取2-NBDG
第1组为空白对照组，共聚焦显微镜无荧光表达(图 1 A、B)；第2组为2-NBDG孵育组，共聚焦显微镜下可见细胞膜和细胞质中强荧光表达 (图 1C、D)。运用激光共聚焦成像技术显示2-NBDG可以被H9c2细胞所摄取。
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| A：空白对照组荧光成像；B: 空白对照组可见光成像； C: 2-NBDG孵育组荧光成像；D: 2-NBDG孵育组可见光成像 图 1 共聚焦显微镜成像显示H9c2心肌细胞能摄取2-NBDG |
用浓度为200 μmol/L的Insulin与2-NBDG同时孵育H9c2心肌细胞，荧光酶标仪结果显示对照组细胞内荧光强度为(373.24±41.42)，30 min组为(527.11± 41.01)，30 min组H9c2心肌细胞摄取2-NBDG荧光强度最强，与对照组相比有显著增高P<0.05 (图 2)，故后续实验选择30 min为胰岛素处理时间。
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| a：P<0.05，与NC组比较 图 2 Insulin处理不同时间下H9c2细胞摄取2-NBDG的能力 |
6个不同浓度的Insulin (0、50、100、200、400、800 μmol/L) 处理H9c2心肌细胞，100、200 μmol/L组与对照组相比细胞内荧光强度值增高(P<0.05)，此 2组无统计学差异(P>0.05，图 3)。因200 μmol/L组效果更佳，故选其为处理H9c2心肌细胞的最佳浓度，用于后续实验。
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| a：P<0.05，与NC组比较 图 3 不同浓度Insulin处理后H9c2心肌细胞摄取 葡萄糖能力(x±s，n=6) |
间接免疫荧光法检测结果显示：正常H9c2心肌细胞细胞膜表达GLUT1(图 4 A)和GLUT4(图 4 C)。激光共聚焦扫描成像显示胰岛素处理前细胞内绿色荧光信号(96.78±8.40)，胰岛素处理前细胞内红色荧光信号(72.31±5.13)，胰岛素处理后细胞内绿色荧光信号(119.34±7.61)，胰岛素处理后细胞内红色荧光信号(137.45±7.14)。Insulin (200 μmol/L)处理H9c2心肌细胞30 min后经激光共聚焦扫描成像显示H9c2心肌细胞膜表达GLUT1(图 4B)和GLUT4(图 4D)增加(P<0.05，图 4)。 表明Insulin可能通过增加H9c2心肌细胞膜GLUT1、GLUT4表达而促进细胞葡萄糖摄取。
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| 图 4 激光共聚焦扫描成像显示胰岛素处理前后GLUT-1和GLUT-4在H9c2细胞的表达的变化 |
空白对照组细胞内荧光强度为(10.88±1.20)，2-NBDG 对照组细胞内荧光强度为(35.80±0.87)，Insulin 组为(75.30±8.93)，两组间比较有统计学差异(P<0.05，图 5)，提示Insulin可促进心肌细胞葡萄糖摄取。
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| A: 空白对照组(NC组)；B: 2-NBDG组；C: Insulin组；D: Insulin+ PI3K-AKT信号通路抑制剂组(LY294002组)；E: Insulin+ p38MAPK通路抑制剂BIRB796处理组(BIRB796组)； F:细胞荧光强度定量结果(x±s，n=5) a：P<0.05，与NC组比较；b：P<0.05，与INS组比较 图 5 流式细胞仪检测H9c2心肌细胞对葡萄糖的摄取 |
Insulin (200 μmol/L)与PI3K-AKT通路抑制剂LY294002同时处理H9c2心肌细胞后，细胞内荧光强度为(45.27±6.05)，LY294002抑制剂组与Insulin组相比细胞葡萄糖摄取能力下降，两组间差异明显(P<0.05，图 5)，提示PI3K-AKT通路抑制剂可抑制Insulin促进心肌细胞葡萄糖摄取。Insulin (200 μmol/L)与p38MAPK抑制剂BIRB796处理组细胞内荧光强度为(70.24±8.08)，BIRB796组与Insulin组比较无统计学差异(P>0.05，图 5)，提示BIRB796不能抑制Insulin促进H9c2细胞摄取葡萄糖。Insulin促进H9c2心肌细胞葡萄糖摄取的作用可能与PI3K-AKT通路相关，与p38MAPK通路不相关。 3 讨论
我们证实了2-NBDG可用于研究H9c2心肌细胞的葡萄糖摄取，是一个方便可能的方法。2-脱氧葡萄 糖(2-deoxy-D-glucose，2-DG)是天然D型葡萄糖衍生 物，通过葡萄糖转运体蛋白进入细胞[4]。我们也证实了H9c2心肌细胞膜有葡萄糖转运体的表达，故其具有摄取2-NBDG的能力，为后续检测细胞葡萄糖摄取奠定了基础。
通过本研究我们证实了胰岛素可以促进H9c2心肌细胞葡萄糖摄取增加，此作用可能被PI3K-AKT通路抑制剂LY294002阻断，而p38α/β/γ/δMAPK抑制剂BIRB796不能抑制此作用。多项研究表明胰岛素调节细胞葡萄糖的摄取依靠复杂的信号级联反应，包括一系列的磷酸化及激酶的激活，如PI3K-AKT、蛋白激酶B的激活[5]。Osorio-Fuentealba等[6]运用骨骼肌细胞研究发现通过激活PI3K-AKT信号通路可促进细胞葡萄糖摄取；Somwar等[7]运用3T3-L1A脂肪细胞研究证实胰岛素促进细胞葡萄糖摄取不依赖p38MAPK通路。我们的实验结果与上述研究结果一致，证实了胰岛素可以促进H9c2心肌细胞葡萄糖摄取，且可能与PI3K-AKT信号通路激活有关，与p38α/β/γ/δMAPK通路不相关。
PI3K-AKT信号通路是胰岛素的主要下游分子通路，胰岛素与胰岛素受体相结合后使胰岛素受体底物-1/2( IRS-1/2)酪氨酸位点磷酸化后激活，进而激活PI3K，激活后的PI3K可以催化二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2) 生成PIP3，其作为第二信使激活Akt，活化的Akt可以通过调节包括GSK3 、FoxO1在内的一系列下游分子，PI3Ks在细胞生长、分化及葡萄糖转运和机体代谢过程中起重要的作用[8]。
本研究结果显示：胰岛素主要通过激活PI3K-AKT信号通路促进心肌细胞内GLUT-1及GLUT-4表达增加而使心肌细胞葡糖摄取增加。葡萄糖转运体(GLUTs) 是细胞膜上的一种跨膜糖蛋白，负责将葡萄糖分子从高浓度向低浓度运载。有研究表明人类心肌细胞高表达GLUT1和GLUT4，并被认为主要负责心肌葡萄糖的摄取及转运[9, 10]。 Contreras-Ferrat等[11]证实胰岛素可能通过 途径促进心肌细胞GLUT4易位而使细胞葡萄糖摄取增加。Garrido等[12]运用MCF-7细胞也证实激活PI3K-AKT通路可使GLUT4易位增加，从而使细胞葡糖摄取增加。但 等运用caPI3K(心脏特异性表达PI3K增加)转基因小鼠作为研究对象，结果显示过表达的PI3K和Akt可以减少细胞葡萄糖摄取，其机制是使GLUT4易位减少[8]。目前相关报道不一，而本实验证实胰岛素可激活PI3K-AKT通路，促进心肌细胞GLUT-1及GLUT-4表达增加而使心肌细胞葡糖摄取增加。
综上所述，胰岛素可促进H9c2心肌细胞葡萄糖摄取，此作用可能与PI3K-AKT通路相关，与p38MAPK通路不相关，胰岛素激活PI3K-AKT信号通路后促进H9c2心肌细胞GLUT-1及GLUT-4表达增加，从而使H9c2心肌细胞对葡萄糖摄取增加。PI3K-Akt 信号通路下游分子如FoxO1和GSK3，对葡萄糖转运也具有重要的调控作用，PI3K-Akt信号通路可能是包括心脏病、糖尿病在内的多种疾病的潜在干预靶点，可以进一步深入研究。
| [1] | 霍建华, 张航向, 苏慧, 等. 葡萄糖-胰岛素-钾液对缺血/再灌注心肌的保护作用[J]. 心脏杂志, 2005, 17(4): 345-348, 352. |
| [2] | Yao H, Han X, Han X. The cardioprotection of the insulin-mediated PI3K/Akt/mTOR signaling pathway[J]. Am J Cardiovasc Drugs, 2014, 14(6): 433-442. |
| [3] | Aikawa R, Nawano M, Gu Y, et al. Insulin prevents cardiomyocytes from oxidative stress-induced apoptosis through activation of PI3 kinase/Akt[J]. Circulation, 2000, 102(23): 2873-2879. |
| [4] | O'Neil R G, Wu L, Mullani N. Uptake of a fluorescent deoxyglucose analog (2-NBDG) in tumor cells[J]. Mol Imaging Biol, 2005, 7(6): 388-392. |
| [5] | Chang L, Chiang S H, Saltiel A R. Insulin signaling and the regulation of glucose transport[J]. Mol Med, 2004, 10(7/12): 65-71. |
| [6] | Osorio-Fuentealba C, Contreras-Ferrat A E, Altamirano F, et al. Electrical stimuli release ATP to increase GLUT4 translocation and glucose uptake via PI3Kγ-Akt-AS160 in skeletal muscle cells[J]. Diabetes, 2013, 62(5): 1519-1526. |
| [7] | Somwar R, Koterski S, Sweeney G, et al. A dominant-negative p38 MAPK mutant and novel selective inhibitors of p38 MAPK reduce insulin-stimulated glucose uptake in 3T3-L1 adipocytes without affecting GLUT4 translocation[J]. J Biol Chem, 2002, 277(52): 50386-50395. |
| [8] | Zhu Y, Pereira R O, O’Neill B T, et al. Cardiac PI3K-Akt impairs insulin-stimulated glucose uptake independent of mTORC1 and GLUT4 translocation[J]. Mol Endocrinol, 2013, 27(1): 172-184. |
| [9] | Schwenk R W, Luiken J J, Bonen A, et al. Regulation of sarcolemmal glucose and fatty acid transporters in cardiac disease[J]. Cardiovasc Res, 2008, 79(2): 249-258. |
| [10] | Abel E D. Glucose transport in the heart[J]. Front Biosci, 2004, 9: 201-215. |
| [11] | Contreras-Ferrat A E, Toro B, Bravo R, et al. An inositol 1, 4, 5-triphosphate (IP3)-IP3 receptor pathway is required for insulin-stimulated glucose transporter 4 translocation and glucose uptake in cardiomyocytes[J]. Endocrinology, 2010, 151(10): 4665-4677. |
| [12] | Garrido P, Moran J, Alonso A, et al. 17β-estradiol activates glucose uptake via GLUT4 translocation and PI3K/Akt signaling pathway in MCF-7 cells[J]. Endocrinology, 2013, 154(6): 1979-1989. |
