表1(Table 1)
2. 400037 重庆，陆军军医大学(第三军医大学)第二附属医院：药剂科
2. Department of Pharmacy, Second Affiliated Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400037, China
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是引起医院内获得性感染常见的G-条件致病菌。患有严重基础疾病、免疫功能低下、手术介入或肺囊性纤维化患者尤易感染[1]。长期抗生素治疗极易诱发PA耐药，而多重耐药、泛耐药菌株的出现，大大加剧了PA感染的防治难度[2]。尽管PA被广泛认为是一种胞外菌，但实际上其同样可侵袭并长期定植于被感染的角膜、支气管和肺等上皮细胞内部[3]。PA侵袭并定植于上皮细胞内可逃逸部分抗生素的杀伤以及免疫细胞的清除，这也是导致PA持续性感染及感染复发的关键因素之一。Ⅲ型分泌型系统(type three secretion system，T3SS)是与PA急性感染密切相关的毒力调控系统，可通过复杂的针状分泌装置，将毒性效应蛋白(如ExoS/ExoT/ExoY/ExoU)直接注入真核宿主细胞内致病。研究发现，T3SS与PA侵袭及定植上皮细胞密切相关。KROKEN等[4]报道，Caspase-4介导炎性小体活化是上皮细胞抵抗胞内PA感染的关键防御机制。然而，ExoS可通过抑制Caspase-4介导的炎性小体活化，干扰上皮细胞对入侵PA的清除，以利于细菌在胞内的复制。此外，有研究指出，ExoS具有ADP-核糖基转移酶活性，可通过抑制ExoS和ExoT的Rho GAP功能域介导的抗吞噬作用，促进PA侵袭上皮细胞[5]。尽管T3SS调控PA侵袭上皮细胞的机制已有部分揭示，然而T3SS结构复杂，调控元件众多，致病环节多样，其相关研究仍有待进一步深入。因此，本研究利用exsA(编码T3SS激活关键转录因子ExsA)[6]、pscJ(T3SS蛋白分泌相关)[7]基因敲除菌株以及T3SS基因高表达菌株，进一步探究T3SS调控PA侵袭肺上皮细胞的潜在机制，相关研究可为PA感染的防治提供新思路。
1 材料与方法 1.1 菌株和细胞PA实验室标准菌株PAO1保存于陆军军医大学第二附属医院临床医学研究中心实验室。PAO1基因敲除菌株△exsA和△pscJ为前期实验构建[8]。人非小细胞肺癌A549细胞购自武汉普诺赛生物科技有限公司。
1.2 主要试剂小鼠胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；CAT# E510002)和DMEM(CAT# E600003)购自中国生工生物工程(上海)有限公司；胰酶(CAT# 25300054)购自美国Hyclone公司；PA筛选平板(CAT# HB5183)购自中国海博生物公司；乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(glycol ether diamine tetraacetic acid，EGTA；CAT# A600077)购自中国生工生物工程(上海)有限公司；RNAiso Plus(CAT# 9109)、反转录试剂盒(CAT# RR047A)和荧光定量PCR试剂盒(CAT# RR820A)购自中国宝生物工程(大连)有限公司；细菌核酸荧光染料SYTO9(CAT# S34854)购自美国Invitrogen公司；ROS清除剂NAC(N-acetyl-L-cysteine；CAT# HY-B0215)、NADPH氧化酶(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase, Nox)抑制剂香草乙酮(apocynin，APO；CAT# HY-N0088)以及ROS检测荧光探针2′, 7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(H2DCFDA；CAT# HY-D0940)购自美国MCE公司；ERK抑制剂U0126(CAT# S1102)购自美国Selleck公司；BCA蛋白定量试剂盒(CAT#P0012S)和Western及IP细胞裂解液(CAT# P0013)购自中国碧云天生物技术有限公司；兔抗ERK抗体(CAT# 4695)和兔抗磷酸化的ERK抗体(p-ERK；CAT# 4370)购自美国CST公司；兔抗GAPDH内参抗体(CAT# 10494-1-AP)购自中国武汉三鹰生物技术有限公司；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的羊抗兔(CAT# ZB-2301)或小鼠(CAT# ZB-2305)抗体购自中杉金桥公司；小鼠抗ExoS和ExoT抗体为本实验室制备。实验所需引物由中国生工生物工程(上海)有限公司合成。
1.3 实验分组采用PA菌株感染A549细胞，分为未处理(CTR)组、PAO1(PA实验室标准菌株)组、△exsA(缺失与T3SS转录激活相关的关键基因exsA)组、△pscJ(缺失与T3SS蛋白分泌相关基因pscJ)组和PAO1-E(经EGTA诱导后高表达T3SS基因)感染组。采用U0126抑制A549细胞ERK活性并随后感染PAO1，分为未处理(CTR)组、PAO1感染组、U0126处理组和U0126联合PAO1(U0126+PAO1)感染组。采用APO或NAC抑制A549细胞ROS产生并随后感染PAO1或PAO1-E菌株，分为未处理(CTR)组、PAO1或PAO1-E感染组、APO/NAC剂联合PAO1(PAO1+APO或PAO1+NAC)处理组以及NAC联合PAO1-E(PAO1-E+NAC)处理组。
1.4 肺上皮细胞的培养采用人非小细胞肺癌细胞A549作为PAO1感染的肺上皮细胞株。A549细胞采用含10%FBS的DMEM(10%FBS/DMEM)完全培养基于37 ℃、5%CO2培养。待细胞生长汇合度达到80%时，采用无菌PBS清洗后加入0.25%胰酶37 ℃消化1 min，立即加入完全培养基终止消化。室温200×g离心5 min，弃去上清，细胞沉淀加入10%FBS/DMEM重悬。采用细胞计数器计算细胞浓度，并按照1×105细胞/孔将细胞铺入12孔细胞培养板。
1.5 PAO1基因敲除菌株鉴定提取前期实验中已通过Red同源重组方法构建的△exsA和△pscJ基因敲除菌株基因组DNA[8]。通过交叉PCR方法鉴定，即PCR扩增基因组DNA打靶片段区域的前臂-四环素抗性(TetR)基因片段(FA-TetR)或TetR基因-打靶片段后臂(TetR-RA)基因片段(表 1)。取上述PCR产物5 μL与等体积溴酚蓝混合，通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
| 菌株 | 扩增片段 | 引物序列(5’→3’) |
| ΔexsA | FA-TetR | 上游：CCCGGAAGAAAGATCTGGC |
| 下游：ACCGGGCTTTCAAAAAACGTCAGGTCGAGGTGGCCCG | ||
| TetR-RA | 上游：ACGGGAAGTGTTGGGGTTCTTTCTCATGTTTGACAGCTT | |
| 下游：AGGAGAATCTGCCGCACCT | ||
| ΔpscJ | FA-TetR | 上游：ACAGCCACAAACTCGACCTG |
| 下游：CAACTGGTAGGCCGTCAATGTTCCATTCAGGTCGAGGTG | ||
| TetR-RA | 上游：GAAACCCTGATGAAGACCCATTCTCATGTTTGACAGCTTATCAT | |
| 下游：ATGAGCAGGTCGAGCTGCT |
1.6 T3SS基因表达的诱导
挑取PAO1单菌落接种于LB培养基中，37 ℃、200 r/min振荡培养过夜。取活化细菌以体积比1∶50稀释度接种于含5 mmol/L EGTA和20 mmol/L MgCl2的新鲜LB培养基中，37 ℃、200 r/min振荡培养12 h，即为T3SS基因高表达的PAO1菌株(PAO1-E)[8]。
1.7 细菌培养及预处理挑取PAO1野生型、△exsA、△pscJ或PAO1-E单菌落接种于LB培养基中，37 ℃、200 r/min振荡培养过夜。取活化细菌以体积比1:50稀释度接种于新鲜LB培养基，37 ℃、200 r/min振荡培养至对数生长期。菌液以13 800×g室温离心5 min，收集细菌沉淀，测定细菌吸光度值[OD(600)]，并用无菌PBS将其浓度调整为5倍OD(600)以用于后续感染。细菌荧光标记组：取上述PBS调整后的5倍OD(600)菌液200 μL，室温13 800×g离心5 min后取沉淀，加入200 μL经PBS配置的10 μmol/L SYTO9荧光染料溶液于室温避光染色20 min。PBS洗涤2次后，细菌沉淀加入等体积PBS重悬以用于后续感染。
1.8 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测基因表达收集细菌或细胞样本加入RNAiso Plus(TRIzol)以提取总RNA。采用微量核酸蛋白浓度检测仪测定RNA浓度。采用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，通过qPCR检测细菌T3SS关键基因(exsA、exoS、exoT和exoY)表达水平，并以rplU为内参基因。此外，通过qPCR检测细胞样本中与ROS合成相关的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1-5(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NADPH oxidases，Nox 1-5)和双加氧酶1-2(dual oxidases，Duox1-2)的基因表达水平，并采用gapdh为内参基因。具体实验方法参照试剂盒说明书进行。荧光定量PCR反应体系：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，40个循环，熔解曲线95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。采用2-△△Ct法计算基因的相对表达量，引物序列见表 2。
| 基因 | 引物序列(5’→3’) |
| rplU | 上游：CGCAGTGATTGTTACCGGTG |
| 下游：GGTAACCTTCGCACCTTCGA | |
| exsA | 上游：GATGCTCGCCTGCCTGAA |
| 下游：CGAACTCGCGGGAGAAG | |
| exoS | 上游：GACGCAAGCCCGGAACT |
| 下游：CAGGCTGTCTGCCCAGGTAC | |
| exoT | 上游：TCGAGGCTTCCCGTACCCA |
| 下游：CAGGGCGACCTTGTCCATT | |
| exoY | 上游：TGGTGGACGCCCTCAATG |
| 下游：GACTCTTCTCCGACCCGATG | |
| gapdh | 上游：CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG |
| 下游：CGTCAAAGGTGGAGGAGTGG | |
| Nox1 | 上游：GCACACCTGTTTAACTTTGACTG |
| 下游：GGACTGGATGGGATTTAGCCA | |
| Nox2 | 上游：AACGAATTGTACGTGGGCAGA |
| 下游：GAGGGTTTCCAGCAAACTGAG | |
| Nox3 | 上游：CGTGGCGCATTTCTTCAACC |
| 下游：GCTCTCGTTAGGGGTGTTGC | |
| Nox4 | 上游：TGACGTTGCATGTTTCAGGAG |
| 下游：AGCTGGTTCGGTTAAGACTGAT | |
| Nox5 | 上游：CTATTGGACTCACCTGTCCTACC |
| 下游：GGAAAAACAAGATTCCAGGCAC | |
| Duox1 | 上游：GCAGCGATTTGATGGGTGGTA |
| 下游：AGGTGGGGTTCTCCCAAGG | |
| Duox2 | 上游：CTGGGTCCATCGGGCAATC |
| 下游：GTCGGCGTAATTGGCTGGTA |
1.9 荧光标记细菌感染及显微镜观察
A549细胞生长汇合度达到80%时，弃去完全培养基，加入1 mL DMEM培养基。取上述经SYTO9荧光染料标记的5倍OD(600)的PAO1野生型、△exsA、△pscJ或PAO1-E菌液5 μL加入到已含有1 mL DMEM培养基的孔板中，并于37℃感染3 h(MOI=10)。采用无菌PBS洗涤细胞1次后，每孔细胞加入1 mL含300 μg/mL庆大霉素抗生素的DMEM培养基，37 ℃处理1 h，以杀伤胞外细菌。将细胞置于倒置荧光显微镜下观察并拍照，激发波长480 nm。
1.10 细菌感染及细胞内细菌量测定待A549细胞生长汇合度达到80%时，取未经SYTO9标记的PAO1野生型、△exsA、△pscJ或PAO1-E菌液感染A549细胞3 h。弃去上清，加入含庆大霉素抗生素的DMEM培养基于37 ℃处理1 h以杀伤胞外细菌。具体细菌感染量及抗生素处理方法参照上述SYTO9荧光染料标记细菌进行。取细菌感染后细胞，PBS洗涤2次，加入200 μL含0.5%Triton X-100的无菌PBS于冰上裂解细胞5 min。取10 μL细胞裂解液以100倍稀释，取100 μL稀释液涂布PA筛选平板，37 ℃培养至细菌单菌落形成。通过计算细菌菌落形成单位(CFUs)进行测定。
1.11 ERK通路抑制待A549细胞生长汇合度达到80%时，采用经完全培养基稀释的U0126 5 μmol/L预处理A549细胞2 h后，弃去培养基，加入DMEM稀释的PAO1于37 ℃感染3 h。
1.12 细胞内ROS清除及检测采用ROS清除剂NAC 10 mmol/L或Nox抑制剂APO 50 μmol/L预处理A549细胞2 h，随后加入PAO1或PAO1-E于37 ℃感染3 h。将上述细胞采用PBS洗涤2次，加入0.25%胰酶于37 ℃消化1 min，加入完全培养基终止胰酶反应。细胞悬液以200×g室温离心5 min，采用PBS洗涤1次，加入经PBS配制的5 μmol/L H2DCFDA，37 ℃避光孵育30 min。细胞悬液经200×g室温离心5 min，PBS洗涤1次，采用流式细胞仪检测。
1.13 Western blot检测蛋白及磷酸化水平为考察PAO1感染不同时间对A549细胞ERK通路的活化情况，于PAO1感染后1、2和3 h收集细胞样本。未特别说明的其他实验则在细菌感染3 h后收集细胞样本用于Western blot检测。样本加入Western/IP裂解液裂解细胞，采用BCA法进行蛋白定量，并取等量蛋白进行SDS-PAGE分离。采用湿转印方法将胶上蛋白转印至0.22 μm PVDF膜上。采用5%脱脂奶粉/TBST溶液室温封闭1 h，加入一抗(兔抗ERK抗体、兔抗p-ERK抗体或兔抗GAPDH抗体)，4 ℃孵育过夜。采用含0.1% Tween20的TBST溶液洗涤3次，加入HRP标记的羊抗兔抗体，室温孵育1 h。洗涤后，ECL化学发光法曝光显影。采用Image J软件计算蛋白条带的灰度值。
1.14 统计学分析各组数据以x±s表示。两样本间的比较采用配对样本t检验。多样本间的比较采用one-way ANOVA进行，并使用GraphPad Prism 5.0软件作图。P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 T3SS相关基因敲除及高表达菌株的鉴定为考察T3SS在PA侵袭肺上皮细胞中的作用，采用交叉PCR鉴定前期实验中构建的△exsA和△pscJ菌株。由电泳结果可见，从△exsA和△pscJ菌株的基因组DNA上均能扩增出约1 600 bp的FA-TetR或TetR-RA DNA片段(图 1A、B)，证实上述菌株确实是前期构建的相应基因敲除菌株。此外，因EGTA可显著诱导PA T3SS基因表达，采用EGTA处理PAO1并通过RT-qPCR检测T3SS基因表达，结果也证实，与PAO1组相比，PAO1-E组的exsA、exoS、exoT、exoY和pscJ基因表达显著增加(P＜0.01，图 1C)，表明EGTA可诱导PA T3SS基因表达。通过蛋白电泳及Western blot检测也发现，在总蛋白水平无差异的条件下(图 1D)，PAO1-E组的ExoS和ExoT蛋白表达水平明显高于未处理的PAO1组(图 1E)。
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| A：△exsA/△pscJ基因组DNA打靶区示意图；B：交叉PCR鉴定基因敲除菌株；C：RT-qPCR检测T3SS基因表达(n=3) a：P＜0.01，与PAO1组比较；D：SDS-PAGE电泳检测细菌总蛋白；E：Western blot检测T3SS效应蛋白水平 图 1 PA T3SS关键基因敲除及高表达菌株鉴定 |
2.2 T3SS促进PA对肺上皮细胞的侵袭
为考察T3SS在PA侵袭肺上皮细胞中的作用，采用PAO1、△exsA或△pscJ感染A549细胞，通过倒置荧光显微镜观察未标记荧光或经SYTO9荧光染料标记后的PAO1及突变株感染后的细胞情况。由图 2A可见，在未经SYTO9荧光染料标记的各组细菌感染后，其细胞区域及间隙均可见明显细菌颗粒；而经SYTO9绿色荧光染料标记的细菌，其感染的细胞则呈现明显的绿色荧光，且PAO1-E感染组最强，PAO1感染组次之，△exsA和△pscJ感染组较弱(图 2A)。此外，通过细菌感染及采用庆大霉素杀伤胞外细菌，并涂布PA筛选平板，结果发现，相较PAO1感染组，△exsA特别是△pscJ感染组细胞内的细菌量明显减少(P＜0.05，P＜0.01，图 2B、C)。相较PAO1感染组，PAO1-E感染组细胞内的细菌量明显增加(P＜0.01，图 2D、E)。上述结果提示，T3SS可促进PA侵袭肺上皮细胞。
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a：P＜0.01，b：P＜0.05，与PAO1感染组比较
A：倒置荧光显微镜观察细菌感染情况；B、C：PAO1、△exsA和△pscJ感染后肺上皮细胞内细菌的定量分析(n=3)；D、E：PA和PA-E感染后肺上皮细胞内细菌的定量分析(n=3) 图 2 T3SS对PA侵袭肺上皮细胞作用的检测 |
2.3 T3SS可增强PA感染诱导的肺上皮细胞ROS产生
为考察T3SS在PA影响肺上皮细胞ROS产生中的作用，采用PAO1、△exsA或△pscJ感染A549细胞，并通过H2DCFDA荧光探针标记，检测了细胞内ROS水平。结果发现，相较CTR组，PAO1感染组的ROS水平明显增加(P＜0.01)；与PAO1感染组相比，△exsA或△pscJ感染组的ROS水平明显降低(P＜0.01，图 3A、B)，而PAO1-E感染组的ROS产生增加(P＜0.01，图 3C、D)。另外，通过RT-qPCR检测ROS合成的关键酶Nox1-5和Duox1-2的基因表达发现，相较CTR组，PAO1感染组的Nox1、Nox3、Nox4、Duox1和Duox2基因表达上调(P＜0.05)，而Nox2和Nox5基因表达未有明显改变；与PAO1感染组相比，PAO1-E感染组的Duox1和Duox2基因表达水平进一步上调，而Duox1和Duox2表达水平在△exsA或△pscJ感染组中则明显降低(P＜0.05，图 3E)。上述结果提示，T3SS是PA感染诱导肺上皮细胞ROS产生的关键因素，且其调控ROS的产生可能通过Duox1和Duox2实现。
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a：P＜0.01，b：P＜0.05，与CTR组比较；c：P＜0.01，d：P＜0.05，与PAO1感染组比较
A~D：流式细胞术检测PA感染后肺上皮细胞ROS水平；E：RT-qPCR检测Nox和Duox相对基因表达 图 3 T3SS可增强PA感染诱导的肺上皮细胞ROS产生(n=3) |
2.4 抑制ROS产生可减弱T3SS介导的PA对肺上皮细胞的侵袭
为考察ROS在PA侵袭肺上皮细胞中的作用，采用ROS清除剂NAC或Nox抑制剂APO处理A549并联合PAO1感染。通过倒置荧光显微镜观察PAO1及突变株感染情况，由图 4A可见，细胞感染后，其未标记荧光组其细胞区域及间隙均可见明显细菌颗粒；而经SYTO9标记的PAO1或PAO1-E感染组其细胞内的绿色荧光明显高于PAO1或PAO1-E感染联合APO或NAC处理组。另外，采用H2DCFDA荧光探针标记细菌感染后细胞内ROS结果证实，相较PAO1感染组，PAO1感染联合NAC或APO处理组其ROS的产生明显减少(P＜0.01，图 4B、C)，提示NAC或APO能抑制PA感染诱导的ROS产生。进一步通过庆大霉素杀伤胞外感染的PAO1并涂布PIA平板，结果发现，与PAO1感染组相比，PAO1感染联合NAC或APO处理组其感染肺上皮细胞内的细菌量减少(P＜0.01，图 4D、E)。此外，采用EGTA诱导PAO1的T3SS基因表达(PAO1-E菌株)并联合NAC处理，结果发现，PAO1-E联合NAC处理组细胞内的细菌量明显低于PAO1-E感染组(P＜0.01，图 4F、G)，提示T3SS可通过ROS促进PA侵袭肺上皮细胞。
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a：P＜0.01，与PAO1感染组比较；b：P＜0.01，与PAO1-E感染组比较
A：倒置荧光显微镜观察细菌感染情况；B、C：流式细胞术检测PA感染后肺上皮细胞ROS水平(n=3) Blank为未经H2DCFDA染色的空白细胞对照 D~G：PA感染后肺上皮细胞内细菌的定量(n=3) 图 4 ROS在T3SS介导的PA对肺上皮细胞侵袭作用的检测 |
2.5 T3SS可抑制PA感染后肺上皮细胞ERK通路活化
为考察ERK信号通路是否在T3SS介导PA侵袭肺上皮细胞以及ROS产生中发挥作用，采用PAO1、△exsA或△pscJ感染A549细胞，并通过Western blot检测PA感染后不同时间点ERK的磷酸化水平。结果发现，与未处理组(1 h)相比，PAO1感染早期(1 h)可增加ERK的磷酸化(P＜0.01)，而随着感染时间延长反而抑制ERK通路活化。与未处理组(3 h)相比，在PAO1感染3 h时显著抑制A549细胞的ERK磷酸化(P＜0.05)，而对其总蛋白水平没有显著影响(图 5A、B)。相较PAO1感染组，△exsA或△pscJ感染组ERK磷酸化增加(P＜0.01，图 5C、D)。另外，采用EGTA诱导PAO1的T3SS基因表达并通过Western blot检测发现，相较PAO1感染组，PAO1-E感染组ERK磷酸化水平减弱(P＜0.01，图 5E、F)，提示T3SS可抑制PA感染后A549细胞的ERK信号通路活化。
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a：P＜0.01，b：P＜0.05，与CTR组比较；c：P＜0.01，d：P＜0.05，与PAO1感染组比较
A、B：Western blot检测PA感染不同时间点肺上皮细胞ERK的磷酸化水平；C、D：Western blot检测PA及突变体感染后肺上皮细胞ERK的磷酸化水平；E、F：Western blot检测NAC处理后PA及PA-E感染后肺上皮细胞ERK的磷酸化水平 图 5 PA感染肺上皮细胞后ERK通路活化的检测 |
为探讨ROS是否通过调控ERK发挥效应，进一步通过NAC处理并观察了PA感染后ERK的活化情况。然而，结果却发现，PAO1+NAC处理组的ERK磷酸化水平下降明显低于PAO1感染组(P＜0.05，图 5E、F)，提示ROS并不参与T3SS介导的对ERK信号通路的抑制。
2.6 ERK通路抑制可增加ROS产生以及PA对肺上皮细胞的侵袭为考察ERK通路在PA侵袭肺上皮细胞及ROS产生中的可能作用，采用ERK抑制剂U0126预处理A549细胞，并随后感染PAO1菌株。通过倒置荧光显微镜观察发现，未标记SYTO9荧光染料的细菌，其感染后细胞区域及间隙均可见明显细菌颗粒；而经SYTO9标记的PAO1感染组其细胞内的绿色荧光明显低于PAO1联合U0126处理组(图 6A)。通过Western blot检测U0126处理后ERK的磷酸化发现，在感染或未感染情况下，U0126处理组ERK的磷酸化水平均低于未处理组(P＜0.05，图 6B)，证实U0126确实可抑制ERK的活化。进一步在上述处理后，通过H2DCFDA荧光探针检测A549细胞ROS水平，结果发现，相较PAO1感染组，PAO1感染联合U0126处理组的ROS产生增加(P＜0.01，图 6C)。通过检测抑制剂处理后PAO1于A549细胞内定植的细菌量，结果显示，PAO1联合U0126处理组细胞内的细菌量明显高于PAO1感染组(P＜0.01，图 6D、E)。上述结果提示，ERK通路抑制可增加PA感染诱导的肺上皮细胞ROS产生以及细菌的侵袭能力。结果提示，PA感染时T3SS介导ERK通路抑制可能通过增加肺上皮细胞ROS产生，促进PA对肺上皮细胞的侵袭作用。
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a：P＜0.01，与CTR组比较；b：P＜0.05，c：P＜0.01，与PAO1感染组比较 A：倒置荧光显微镜观察细菌感染情况 B：Western blot检测ERK磷酸化；C：流式细胞术检测PA感染后肺上皮细胞ROS水平 Blank为未经H2DCFDA染色的空白细胞对照；D、E：PA感染后肺上皮细胞内细菌的定量 图 6 ERK在ROS产生及PA对肺上皮细胞的侵袭作用的检测 |
3 讨论 3.1 T3SS及其效应蛋白诱导ROS产生及调控PA侵袭肺上皮细胞
T3SS作为PA关键的毒力调控系统，可通过针状结构装置介导的细胞膜通透性改变或通过毒力效应蛋白直接注入宿主细胞内等多种方式发挥致病作用[9]。研究发现，T3SS除参与对PA毒力以及宿主致病性调控外，在PA对上皮细胞的侵袭中也发挥至关重要的作用。T3SS效应蛋白ExoS抑制非典型的Caspase-4炎症小体活化，可抑制结膜上皮细胞裂解，继而有利于PA在上皮细胞内的存活及复制[4]。ExoS促进PA于感染上皮细胞内的侵袭与抑制囊泡酸化，进而逃脱囊泡包裹以及干扰自噬等密切相关，且其相关效应依赖于ExoS的ADP-核糖基转移酶活性[10]。此外，PA的T3SS结构蛋白PscF和PscI可通过促进巨噬细胞炎症小体活化和焦亡，增加细胞膜通透性，诱导细胞程序性死亡，抑制巨噬细胞对其杀伤[11-12]。本研究发现，T3SS对于促进PA感染后肺上皮细胞ROS产生以及细菌对肺上皮细胞的侵袭起到关键作用，且相较△exsA组，△pscJ感染后肺上皮细胞ROS产生以及PA于肺上皮细胞内的定植量减少更为明显，其推测的可能影响因素如下：尽管ExsA是转录激活T3SS基因的关键转录因子，调控了包括编码T3SS的结构蛋白、调节因子、分子伴侣以及4种效应蛋白的5个操纵子[13]。然而，T3SS基因的转录也同样受到其它转录因子，如ExsC、ExsD和ExsE的共同调节，且ExsA/ExsC/ExsD/ExsE这4个转录因子间也存在相互影响[13]。敲除exsA基因是否可能通过激活其它转录因子，上调部分T3SS基因，继而部分逆转因exsA基因敲除导致的PA感染后肺上皮ROS产生及侵袭能力的下降，其相关研究仍有待进一步验证。BURNS等[7]发现，PscJ与PscC和PscD共同组成了T3SS针状结构装置的环状结构。PscJ的E26、K52、E105、A107、G126、H133和V189位点突变会导致T3SS蛋白分泌的缺失，上述结果提示，T3SS分泌蛋白可能在诱导肺上皮细胞ROS产生以及增加PA侵袭能力中发挥关键作用。
3.2 T3SS介导ROS产生加剧PA对肺上皮细胞的侵袭作用JABIR等[14]发现，PA可通过T3SS促进巨噬细胞线粒体损伤，进而增加ROS产生以及线粒体DNA释放，加剧NLRC4炎性小体的活化。尽管如此，VAREECHON等[15]报道，PA感染中性粒细胞时，其效应蛋白ExoS可ADP-核糖化Ras，进而抑制Ras与PI3K结合以及Nox氧化酶介导的ROS产生。上述结果提示，T3SS在PA感染诱导ROS产生中具有的正向或负向的调控作用，其相关效应可能与PA感染的细胞类型以及T3SS的不同组分相关。尽管ROS对清除入侵病原体起到重要作用，但研究也指出，过度的ROS产生可破坏免疫系统并加速微生物的侵袭。OBERLEY-DEEGAN等[16]报道，氧化环境促进脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)在巨噬细胞内的生长。LIU等[17]发现，PA分泌的毒性因子绿脓素，可促进A549细胞ROS产生，以及JNK和ERK MAPKs通路活化，导致肌动蛋白表达和细胞骨架重排，继而有利于PA对上皮细胞的侵袭。鉴于在急性期感染时，T3SS基因表达显著激活；而长期性感染时，T3SS基因表达受到明显抑制[18]，提示T3SS诱导ROS产生是促进PA急性期感染并侵袭上皮细胞的一种重要机制。
3.3 ERK信号通路在T3SS介导ROS产生中的调控效应ERK是有丝分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)家族重要成员，其与调控细胞增殖、分化、凋亡以及炎症等重要生命活动相关[19-20]。此外，ERK通路在调节细菌与宿主相互作用中也发挥着重要作用[21-22]。采用PD-184161抑制ERK活性可明显促进鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)于HeLa细胞中的存活[23]。JEON等[19]报道，PA分泌蛋白DnaK(热休克蛋白HSP70同源类似物)可通过TLR4介导ERK通路活化，上调模式识别受体PTX3表达，增加巨噬细胞对PA的清除。本研究发现，在感染早期，PA可通过T3SS促进ERK通路活化；而随着感染时间延长，ERK通路受到抑制。ERK通路抑制可诱导ROS产生，促进PA对上皮细胞的侵袭。研究发现，抑制ERK通路活化可通过诱导自噬促进结肠癌细胞ROS产生[24]，其相关研究与本研究结果相似。然而，在肝癌或视网膜病变等研究中发现，ERK通路活化可促进肝癌细胞或视网膜色素上皮细胞ROS产生[25-26]。尽管上述报道揭示ROS可位于ERK下游发挥相关效应，多项研究也指出，ROS同样可位于ERK上游并调控其活性。HAN等[22]发现，PA感染可通过抑制ROS介导的ERK通路活化诱导巨噬细胞自噬以抵御细胞凋亡。在肺癌A549或NCL-H292细胞的研究中发现，采用NAC清除Bruceine D诱导的细胞ROS水平可抑制ERK通路活化[20]。尽管本研究证实，抑制ERK通路活化促进了ROS产生。然而，在PA感染时采用NAC清除ROS产生却发现ERK磷酸化进一步下降，提示T3SS主要是通过抑制ERK促进ROS产生并调控PA对肺上皮细胞的侵袭，而并非通过ROS介导的对ERK调控发挥效应。同时，在PA感染时抑制ROS可进一步减弱ERK通路活化也提示，ROS诱导ERK活化可反馈性削弱ERK/ROS通路介导的PA对肺上皮细胞的侵袭。
综上所述，本研究揭示了T3SS通过抑制ERK通路活化促进ROS产生增强PA对肺上皮细胞侵袭的分子机制，其相关研究可为进一步了解PA与宿主间相互作用，以利于其在宿主体内的存活或定植提供新思路，并为PA的感染防治提供新靶标。
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