表1(Table 1)
2. 400038 重庆，陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院老年心脑血管疾病教育部重点实验室;
3. 400016 重庆，重庆医科大学基础医学院;
4. 400038 重庆，陆军军医大学(第三军医大学)高原军事医学系病理生理学教研室;
5. 400038 重庆，陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院全科医学科
2. Key Laboratory of Geriatric Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases of Ministry of Education, First Affiliated Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400038;
3. College of Basic Medical Sciences, Chongqing Medical University, Chongqing, 400016;
4. Department of Pathophysiology, Faculty of High Altitude Military Medicine, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400038, China;
5. Department of General Practice, First Affiliated Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400038
CGI-58又称含有α/β-水解酶结构域的蛋白5(abhydrolase domain containing 5，ABHD5)，在体内各种组织和细胞中广泛表达。CGI-58是脂肪分解的重要调节因子，能在体外和体内与脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)相结合，显著增强其甘油三酯水解酶活性[1-2]。人类CGI-58基因突变会导致钱林-多尔夫曼综合征(Chanarin-Dorfman syndrome，CDS)，这是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病。自1985年首次发现以来[3]，超过150例患者被报道[4-6]。约60%的CDS患者集中在地中海沿岸，土耳其占据其中绝大部分[4]，在中国[5]和日本[7]也偶有报道。目前对CDS尚无有效的治疗方法。
CDS是一组临床表现具有异质性的遗传疾病，病理特征为脂滴(lipid droplet，LD)在大多数组织的细胞质中异常蓄积，临床表现包括肝肿大(肝脂肪变性和脂肪性肝炎)、鱼鳞病、肌病、听力损失、共济失调、智力低下等[5, 8]。据统计，在122例CDS合并肝脏受累的患者的肝脏活检中，15%的患者肝脏病理切片中发现微泡型脂肪变性，而CDS合并肝硬化的患者病理切片均提示小结节性肝硬化的发生[5]。脂肪肝的病理特征包括大泡型脂肪变性和微泡型脂肪变性。肝脏微泡型脂肪变性的出现被认为与基因突变或酗酒引起的线粒体功能障碍或脂质过氧化有关[9]，提示更严重的脂肪变性，往往代表更高的非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)活动度评分和更易进展为脂肪性肝炎和肝硬化[10-11]。在肝脏CGI-58特异性敲除的小鼠模型中观察到肝脏微泡型脂肪变性的发生[12]。
本课题组前期通过基于腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体的microRNA递送系统，发现靶向肝细胞Plin3可减轻肝脏CGI-58特异性敲除所致雌鼠肝脏的脂肪变性和脂肪性肝炎，表明脂肪分解和脂质蓄积之间的平衡在肝脏CGI-58特异性敲除所致肝脏病变发生发展中至关重要，并为CDS提供了潜在的治疗方法[13]。这种作用仅限于Plin3还是与脂滴的生成有关，干预脂滴的生成是否能缓解CDS仍有待进一步探讨。Plin2和Plin3是肝细胞中主要的脂滴包被蛋白，在脂滴的生成中具有不同的功能。前期研究表明，在肝脏CGI-58特异性敲除的小鼠中，Plin2和Plin3的表达均显著上调[14]，干预Plin2是否也可以缓解CDS有待进一步探究。
Plin2是Plin3的一个同源基因，在肝细胞中大量表达，受细胞内脂肪酸信号的调节，Plin2随着脂滴的生成而堆积[15]，在脂肪分解过程中被伴侣介导的自噬作用降解[16]。Plin3在脂滴生成的早期过程中至关重要，当脂滴体积逐渐增大时，包被脂滴的Plin3被Plin2取代[17-19]。虽然Plin2和Plin3都能参与肝细胞脂滴的生成[20]，但对脂滴生成及脂质代谢的调节效应仍未明确。本研究试图探讨Plin2在肝脏CGI-58特异性敲除的小鼠肝脂肪变性中的作用，并比较Plin2和Plin3对肝细胞脂滴生成和脂质蓄积的作用。
1 材料与方法 1.1 动物实验动物实验均通过陆军军医大学实验动物福利与伦理委员会批准(批准文号：AMUWEC2019474)。CGI-58Flox/Flox基因小鼠的构建如前文所述，其CGI-58基因第3号外显子两侧插入loxP位点[21]。小鼠在陆军军医大学的无特定病原体动物房中适应1周，动物房开关灯时间为8:00至20:00，12 h光/暗循环。相同性别的小鼠被分成2组，分别用同时表达Cre重组酶和靶向Plin2的microRNA(Mi-KD)或表达Cre重组酶和对照序列(NC)的不同腺相关病毒载体进行转染。在小鼠(区分雄鼠和雌鼠)7周龄时通过尾静脉注射1×1012 V.G.的AAV，病毒注射给予60%的高脂饮食喂养(HFD，Research Diets #D12492)(n=5)。每周记录1次体质量，禁食6 h(3:00至9:00)后，小鼠被安乐死，随后收集肝脏、脂肪组织和血清样本，液氮快速冷冻后保存在-80 ℃冰箱中。
1.2 腺相关病毒载体将预先筛选的靶向Plin2的Pre-miRNA序列(ACCGATGAGTCCCACTGTGTT)或阴性对照(NC)序列(GTCTCCACGCGCAGTACATTT)连接到载体pAAV2-hTBG-MasterRNAi155(MCS)-Cre-eGFP-WPRE-pA(中国泰儿图生物科技有限公司)中。用AAV8载体包装并纯化，病毒滴度≥1.3×1013 V.G./mL。
1.3 代谢表型葡萄糖耐量试验(glucose tolerance test，GTT)：小鼠高脂饮食喂养3周后，禁食8 h(9:00至17:00)，测量0点血糖，随后按2 g/kg的剂量腹腔注射20%葡萄糖(MACKLIN#G6172)，在注射后的15、30、45、60、90和120 min用血糖仪(Contour TS#1816)测量血糖。胰岛素耐受试验(insulin tolerance test，ITT)：小鼠在高脂饮食喂养4周后，禁食6 h(9:00至15:00)，测量0点血糖，随后按雄鼠0.5 U/kg、雌鼠0.4 U/kg的剂量腹腔注射重组人胰岛素溶液(Procell#PB180432)，在注射胰岛素后的15、30、45、60、90和120 min测量血糖。
1.4 组织学和血液化学测试小鼠肝脏组织用多聚甲醛(Boster#AR1068)固定，完成肝脏苏木精-伊红染色(HE)后，通过正置光学显微镜获得图像。应用NAFLD活动度评分(NAFLD activity score，NAS)分析肝脏病理，该系统的描述略有改动[22-23]：肝脏脂肪变性(脂肪变性面积 < 5%，0分；5%~33%，1分；>33%~66%，2分；>66%，3分；微泡型脂肪变性，1分)，小叶内/门静脉炎症(无，0分；< 2个点，1分；2~4个点，2分；>4个点，3分)，肝细胞气球样变性(无，0分；少量气球样细胞，1分；大量细胞/明显气球样变，2分)，每个HE切片分析5张图像。按照油红试剂(Sigma O0625)的说明，10 μm的肝脏冷冻切片完成油红O染色。心脏穿刺取血，室温放置20 min后，4 ℃、3 000 r/min离心5 min，分离血清。小鼠血清用0.9%的预冷生理盐水稀释5倍，按500 μL体积血清稀释液送至陆军军医大学第一附属医院检验科进行血液生化检验。血液生化结果数据见表 1。
| 基因 | 序列 | 基因 | 序列 | |
| Plin2 | 正义链：5′-GGAGGAAAGACTGCCTATTCTGA-3′ 反义链：3′-CATCCTTCGCCCCAGTTACG-5′ |
Srebp2 | 正义链：5′-GCAGCAACGGGACCATTCT-3′ 反义链：3′-CCCCATGACTAAGTCCTTCAACT-5′ |
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| Plin3 | 正义链：5′-ATGTCTAGCAATGGTACAGATGC-3′ 反义链：3′-CGTGGAACTGATAAGAGGCAGG-5′ |
Insig2 | 正义链：5′-GGAGTCACCTCGGCCTAAAAA-3′ 反义链：3′-CAAGTTCAACACTAATGCCAGGA-5′ |
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| Plin5 | 正义链：5′-TGTCCAGTGCTTACAACTCGG-3′ 反义链：3′-CAGGGCACAGGTAGTCACAC-5′ |
Hmgcr | 正义链：5′-TGTTCACCGGCAACAACAAGA-3′ 反义链：3′-CCGCGTTATCGTCAGGATGA-5′ |
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| Cgi-58 | 正义链：5′-TGGTGTCCCACATCTACATCA-3′ 反义链：3′-CAGCGTCCATATTCTGTTTCCA-5′ |
Pnpla7 | 正义链：5′-TGGAGGCTGCATTTCATGGAG-3′ 反义链：3′-ACCAACGAAGGCTAGGGTAAG-5′ |
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| Srebp1 | 正义链：5′-AACGTCACTTCCAGCTAGAC-3′ 反义链：3′-CCACTAAGGTGCCTACAGAGC-5′ |
ApoB | 正义链：5′-CCAGAGTGTGGAGCTGAATGT-3′ 反义链：3′-TTGCTTTTTAGGGAGCCTAGC-5′ |
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| Chrebp | 正义链：5′-CTGGGGACCTAAACAGGAGC-3′ 反义链：3′-GAAGCCACCCTATAGCTCCC-5′ |
Mttp | 正义链：5′-CTCCACAGTGCAGTTCTCACA-3′ 反义链：3′-AGAGACATATCCCCTGCCTGT-5′ |
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| Fasn | 正义链：5′-TTGACGGCTCACACACCTAC-3′ 反义链：3′-CGATCTTCCAGGCTCTTCAG-5′ |
Tmem41b | 正义链：5′-GATATGGATGACGCCAAGGCT-3′ 反义链：3′-CAAACAAACAAGGAATAAGGCAAG-5′ |
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| Scd1 | 正义链：5′-AGGTGCCTCTTAGCCACTGA-3′ 反义链：3′-CCAGGAGTTTCTTGGGTTGA-5′ |
Sar1b | 正义链：5′-TTCCTTGGATTGGATAATGCCG-3′ 反义链：3′-GCCAGCAATAGTAAGCTCTTCTG-5′ |
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| Dgat1 | 正义链：5′-CGTGGTATCCTGAATTGGTG-3′ 反义链：3′-GGCGCTTCTCAATCTGAAAT-5′ |
Surf4 | 正义链：5′-GAGTCACCAAGCAGTACCTG-3′ 反义链：3′-GGTTGAGGAACACGAAGG-5′ |
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| Cd36 | 正义链：5′-ATGGGCTGTGATCGGAACTG-3′ 反义链：3′-GTCTTCCCAATAAGCATGTCTCC-5′ |
Abcg5 | 正义链：5′-AGGGCCTCACATCAACAGAG-3′ 反义链：3′-GCTGACGCTGTAGGACACAT-5′ |
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| Fatp1 | 正义链：5′-GCTTCAACAGCCGTATCCTC-3′ 反义链：3′-TCTTCTTGTTGGTGGCACTG-5′ |
Abcg8 | 正义链：5′-CTGTGGAATGGGACTGTACTTC-3′ 反义链：3′-GTTGGACTGACCACTGTAGGT-5′ |
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| Pnpla2 | 正义链：5′-TCCGTGGCTGTCTACTAAAGA-3′ 反义链：3′-TGGGATATGATGACGTTCTCTCC-5′ |
Ldlr | 正义链：5′-CCATATGCATCCCCAGTCTT-3′ 反义链：3′-GCGATGGATACACTCACTGC-5′ |
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| Pnpla3 | 正义链：5′-AGGTCATTTCTGGCAAGGTTC-3′ 反义链：3′-TCCACGACTTCGTCTTTGGAA-5′ |
u36b4 | 正义链：5′-AGATGCAGCAGATCCGCAT-3′ 反义链：3′-GTTCTTGCCCATCAGCACC-5′ |
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| Ppara | 正义链：5′-TACTGCCGTTTTCACAAGTGC-3′ 反义链：3′-AGGTCGTGTTCACAGGTAAGA-5′ |
1.5 肝脏甘油三酯和胆固醇定量
室温条件50 mg肝脏用5 mL氯仿/甲醇体积比为2∶1的混合溶剂萃取过夜。将溶剂在真空干燥器(HENGZWELL HZK-55)中65 ℃干燥后，用3 mL氯仿/甲醇体积比为2∶1重新溶解。将未溶解的固体物离心分离，1N的NaOH溶解后BCA法进行蛋白定量。重新溶解的提取液加入600 μL H2SO4溶液，涡旋后离心。取出100 μL的底相，真空干燥器中干燥后加入含1% TritonX-100的氯仿，蒸发溶剂。加入0.9% NaCl并涡旋至溶液变清。分别使用甘油三酯检测试剂盒(Abcam#ab65336)和胆固醇检测试剂盒(Abcam #ab65390)对甘油三酯和胆固醇含量进行检测，测量结束后使用蛋白质的含量进行量化(mg/g)。
1.6 细胞培养和Bodipy染色AML-12细胞在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养液中培养，加入适量的胰岛素、转铁蛋白、硒、地塞米松和青霉素/链霉素(Procell#CM-0602)，在含5%CO2的37 ℃培养箱中培养。细胞在12孔板上生长，并以5×104个细胞接种到每个孔中。接种12 h后，50 nmol/L Plin2 siRNA用Lipofectamine 3000(Invitrogen #L3000008)混合后转染细胞[中国擎科生物技术有限公司；靶向序列：GGAAGGATTTGATAT；正义链(5′→3′)：GGAAGGATTTGATGATGGTT，反义链(3′→5′)：GGAAGGAUUUGAUAUGGUU]；对照siRNA正义链(5′→3′)：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT；反义链(3′→5′)：ACGUGACACGUUCGGAGAATT。转染36 h后，200 μmol/L油酸(Sigma#O1008)和DMSO载体(Boster#PYG0040)处理细胞12 h，然后收集细胞分别进行RNA、蛋白质和Bodipy染色(所有实验：n=3，重复2次)。在进行Bodipy染色时，用4%多聚甲醛固定细胞15 min，10 nmol/L Bodipy 493/503溶液(Invitrogen #D3922)染色10 min，DAPI(Beyotime#C1005)染色5 min。用荧光显微镜(尼康Ni-U)观察细胞并拍照。
1.7 细胞甘油三酯定量PBS冲洗细胞后，含用除垢剂CA-630(Sigma #MKCL4156)的PBS溶解。然后进行脂肪酶孵育，将甘油三酯分解为脂肪酸和甘油。甘油三酯检测试剂盒(Abcam#ab65336)用于测量细胞内甘油三酯含量，以10-3 μmol/百万细胞为单位。
1.8 实时定量PCR使用TRIzol试剂(Invitrogen#CA92008)或Eastep Super Total RNA Extraction试剂盒(Promega#LS1040)提取约40 mg肝组织或AML-12细胞的RNA。使用GoScript逆转录试剂和引物(Promega)从1 000 ng RNA样品中转录出互补DNA(cDNA)。使用iTaq Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad #1725124)和PCR热循环仪(Bio-Rad C1000)在10 μL体积(10 ng总RNA)的反应体系中反应。程序为95 ℃ 3 min，然后进行40个循环：95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s。使用u36b4基因作为内参或标准曲线法对数据进行定量[24]。引物序列见表 1。
1.9 SDS-PAGE和Western blot在含有蛋白酶抑制剂(Roche#COUEDTAF-RO)和蛋白磷酸酶抑制剂(Roche#PHOSS-RO)的RIPA缓冲液中制备肝组织匀浆或AML-12细胞裂解液。总共30 μg组织匀浆蛋白或20 μg细胞裂解蛋白在80 V电压下进行SDS-PAGE分离，然后湿转法将蛋白转移到PVDF膜(Bio-Rad#1620177)上。用5%脱脂牛奶封闭1 h后，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温下孵育1 h后用含0.05% Tween20的Tris-HCl缓冲盐水洗涤3次，在Azure C500成像系统中使用ECL化学发光底物(Bio-Rad#1705062)进行显影。洗膜：使用抗体去除液(Beyotime#P0025B)清洗PVDF膜20 min，用含0.05% Tween20的Tris-HCl缓冲盐水洗涤3次，重新开始封闭和孵育一抗、二抗并显影。Western blot实验至少重复2次。
1.10 抗体PLIN2抗体(#15294-1-AP)、PLIN3抗体(#10694-1-AP)和PLIN5抗体(#26951-1-AP)购自ProteinTech公司；CGI-58抗体(#H00051099-M01)购自Novus公司；β-actin抗体(#AC026)购自Abclonal公司；HSP90抗体(#E20-53596)购自EnoGene公司；HSP60抗体(#12165)、HSP70抗体(#46477)、HRP结合物抗兔IgG(#7074)和HRP结合物抗鼠IgG(#7076)抗体购自Cell Signaling Technology公司。
1.11 统计学分析以x±s表示正态分布且方差齐的定量资料；多组间比较采用单因素方差分析，采用Bonferrinoi校正进行组间两两比较；两组间重复测量数据及不同干预数据采用双因素方差分析，采用Bonferrinoi校正进行多重比较，两组间数据比较采用Student-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。所有数据的统计分析由Prism(GraphPad，V8.0.1)完成。
2 结果 2.1 肝脏CGI-58特异性敲除和Plin2敲低小鼠模型的构建为了研究Plin2在肝脏CGI-58特异性敲除小鼠肝脏脂肪变性中的作用，构建肝脏CGI-58特异性敲除和肝脏Plin2敲低的双敲小鼠模型。1×1012 V.G.的AAV转染7周龄大的CGI-58Flox/Flox小鼠，该病毒在源自人甲状腺素结合球蛋白(human thyroxine-binding globulin，hTBG，肝细胞特异性启动子)基因的作用下表达Cre重组酶和靶向Plin2的microRNA(Mi-KD)或Cre重组酶和对照microRNA序列(NC)(图 1A)。选择AAV2/8的血清型和hTBG启动子分别是为了实现靶向肝细胞和肝细胞特异性基因表达。上述小鼠用高脂肪饮食(high fat diet，HFD)饲养5周。
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a：P < 0.05，b: P < 0.01 A：肝脏CGI-58敲除和/或Plin2敲低小鼠模型构建的模式图；B: CGI-58在小鼠肝脏中的转录水平(n=5)；C: 小鼠肝脏中CGI-58蛋白水平；D: 雄鼠肝脏中主要PAT家族基因的表达(n=5)和蛋白水平(n=3)；E: 雌鼠肝脏中主要PAT家族基因的表达(n=5)和蛋白水平(n=3) 图 1 肝脏CGI-58特异性敲除和Plin2敲低小鼠模型的构建 |
为了验证CGI-58的敲除，比较野生型(WT)和AAV-Cre转导组(Mi-KD和NC)肝脏样本中CGI-58的转录水平。小鼠肝脏实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)结果表明，CGI-58在WT组和AAV-Cre转导组之间显著下降(P < 0.01，图 1B)。免疫印迹结果显示，AAV-Cre转导组小鼠肝脏中CGI-58蛋白含量低于野生型小鼠(图 1C)。
为了验证Plin2基因的敲低效率，分别检测NC小鼠和Mi-KD小鼠肝脏中PAT家族蛋白Plin2的转录水平和蛋白水平。与NC相比，雄鼠的Plin2转录水平下降了80%以上(P=0.012 9)。与此同时，Plin3和Plin5转录水平呈上升趋势，且Plin5转录显著增加(P=0.041 9)。Western blot分析表明，Mi-KD使雄鼠的PLIN2蛋白减少了99%(P < 0.01)，但未改变PLIN3和PLIN5的水平(图 1D)。与NC相比，雌鼠的Plin2转录水平下降了80%(P=0.000 7)，Plin3转录水平也显著降低(P=0.032 1)，但Plin5转录水平呈上升趋势。Western blot分析表明，Mi-KD使雌鼠PLIN2蛋白减少了99%(P < 0.01)，未改变PLIN3的水平，但PLIN5蛋白水平呈上升趋势(图 1E)。
2.2 肝脏Plin2敲低可改善CGI-58特异性敲除小鼠的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性注射AAV后，对小鼠进行了为期5周的高脂饮食喂养，每周监测小鼠的体质量变化。发现Mi-KD组小鼠和NC组小鼠在体质量上未出现显著差异(图 2A、B)。在高脂饮食的第3周和第4周，分别对小鼠进行葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验，使用双因素方差分析分别比较了雌鼠和雄鼠的Mi-KD组和NC组注射葡萄糖或胰岛素后小鼠血糖水平，发现相同性别的两组小鼠均出现显著差异，表明Mi-KD组小鼠具有更好的葡萄糖耐量(P < 0.01，图 2C、D)和胰岛素敏感性(P < 0.01，图 2E、F)。
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a: P < 0.05，b: P < 0.01 A: 雄性小鼠体质量(n=5)；B: 雌性小鼠体质量(n=5)；C: 雄性小鼠葡萄糖耐量试验(n=4)；D: 雌性小鼠葡萄糖耐量试验(n=4)；E: 雌性小鼠胰岛素耐受测试(n=4)；F: 雌性小鼠胰岛素耐受测试(n=5) 图 2 肝脏Plin2敲低可改善CGI-58特异性敲除小鼠的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性 |
2.3 肝脏Plin2敲低可以缓解高脂饮食喂养的小鼠肝脏CGI-58特异性敲除小鼠的肝肿大和肝细胞损伤
从肝脏大体形态学上看，Mi-KD可减少肝脏CGI-58特异性敲除雌鼠的肝脏肥大(肝肿大)(图 3A)，Mi-KD使雌鼠的肝脏湿质量减少了33.4%(图 3B)，并使雌鼠肝脏质量/体质量(肝体比)降低了34.7%(P=0.003 4，图 3C)，在雄鼠上仅发现肝脏湿质量和肝体比下降的趋势。Mi-KD未能改变肝脏CGI-58特异性敲除小鼠性腺周围白色脂肪组织(pgWAT)的质量(图 3D)。血清生化分析表明，Mi-KD使雄鼠和雌鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平分别降低了35.3%(P=0.037 5)和32.4%(图 3D)，并使雄鼠和雌鼠血清天门冬氨酸转氨酶(AST)血清水平分别降低了53.2%(P=0.001 2)和53.3%(P=0.000 4)(图 3E)。
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a: P < 0.05，b: P < 0.01 A: 肝脏大体解剖；B: 肝脏质量；C: 肝体比值；D：性腺旁脂肪组织质量；E: 血清丙氨酸氨基转移酶；F：天门冬氨酸转氨酶 图 3 肝脏Plin2敲低可以缓解高脂饮食喂养的肝脏CGI-58特异性敲除小鼠的肝肿大和肝细胞损伤 |
2.4 肝脏Plin2敲低可以改善高脂饮食喂养的肝脏CGI-58特异性敲除小鼠的肝脏微泡型脂肪变性
考虑雌鼠肝脏Plin2敲低相较于雄鼠更能够显著减轻肝脏CGI-58特异性敲除所致的肝肿大和肝细胞损伤，重点对雌鼠的肝脏进行深入研究。肝脏组织病理学显示，Mi-KD几乎使肝脏CGI-58特异性敲除小鼠肝细胞中存在的小而多的脂滴(微泡型脂肪变性)消失(图 4A)。采用非酒精性脂肪肝活动评分(NAS)对肝脏病理进行了半定量分析(微泡型脂肪变性的样本在脂肪变性类别中得1分)，在Mi-KD小鼠的NAS评分中，脂肪变性和肝细胞气球样变2种病理特征评分显著降低(P < 0.01)，而炎症评分在两组间无显著差异，Mi-KD组的NAS总分比NC组降低了3.8分(P=0.000 2，图 4B)。肝脏冰冻切片的油红O染色表明Mi-KD减少了肝脏CGI-58特异性敲除所致的肝脏脂质蓄积(图 4C)，用酶比色法检测小鼠肝脏甘油三酯的结果显示，Mi-KD使肝脏CGI-58特异性敲除小鼠肝脏中的甘油三酯含量下降了46%(P=0.016 6，图 4D)，但肝脏胆固醇含量呈现上升的趋势(P=0.080 0，图 4E)，这可能与血清中低密度脂蛋白胆固醇水平显著降低有关(P=0.031 1，表 2)。
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a: P < 0.05，b: P < 0.01 A: 肝脏病理HE染色黑色箭头：大泡型脂肪变性；白色箭头：微泡型脂肪变性；红色箭头：气球样变；B: 肝脏病理NAS评分(脂肪变、炎症、气球样变和NAS评分的单个和整体分数，n=5)；C: 肝脏油红O染色；D：甘油三酯含量(n=5)；E: 胆固醇含量(n=5) 图 4 肝脏Plin2敲低可以改善高脂饮食喂养的肝脏CGI-58特异性敲除小鼠的肝脏微泡型脂肪变性 |
| 组别 | 总胆红素/(μmol/L) | 直接胆红素/(μmol/L) | 间接胆红素/(μmol/L) | 总蛋白/(g/L) | 白蛋白/(g/L) |
| NC组 | 4.50±1.67 | 3.05±1.05 | 2.75±0.91 | 61.20±1.24 | 28.30±0.41 |
| Mi-KD组 | 3.63±0.80 | 1.85±0.84 | 1.78±0.11 | 58.40±2.31 | 30.20±0.98 |
| P | 0.657 2 | 0.407 0 | 0.329 9 | 0.316 7 | 0.111 7 |
| 组别 | 球蛋白/(g/L) | 总胆固醇/(mmol/L) | 甘油三酯/(mmol/L) | 低密度脂蛋白胆固醇/(mmol/L) | 血糖/(mmol/L) |
| NC组 | 32.90±0.91 | 3.23±0.51 | 0.92±0.08 | 1.01±0.07 | 8.24±1.06 |
| Mi-KD组 | 28.20±1.91 | 3.04±0.46 | 0.84±0.07 | 0.71±0.09 | 8.70±0.59 |
| P | 0.057 6 | 0.789 0 | 0.477 0 | 0.031 1 | 0.714 5 |
2.5 肝脏Plin2敲低后高脂饮食喂养的肝脏CGI-58特异性敲除小鼠脂肪代谢相关的基因表达
RT-qPCR检测显示，Mi-KD没有改变小鼠肝脏中Cd36或Fatp1的转录水平(图 5A)，但是使脂质合成相关基因包括Chrebp和Scd1(P < 0.05)、Fasn和Dgat1(P < 0.01)基因表达显著上调。考虑到Mi-KD肝脏胆固醇含量的增加，通过RT-qPCR分析测定部分参与胆固醇代谢基因的表达，结果发现Mi-KD增加了小鼠肝脏中胆固醇从头合成相关基因包括Srebp2和Insig2(P < 0.05)和脂蛋白分泌相关的关键基因Pnpla7(P < 0.05)、Mttp和Sar1b(P < 0.01)的表达(图 5B)。
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a: P < 0.05，b: P < 0.01 A: 小鼠肝脏脂质代谢相关基因的RT-qPCR分析；B: 小鼠肝脏中胆固醇代谢相关基因的RT-qPCR分析 图 5 肝脏Plin2敲低后高脂饮食喂养的肝脏CGI-58特异性敲除小鼠脂肪代谢相关基因的表达(n=5) |
2.6 肝细胞Plin2的敲低减少了AML-12细胞脂滴的生成
油酸(Oil Acid，OA)处理使AML-12细胞Plin2的转录水平提高了42%，但没有改变AML-12肝细胞中Plin3和Plin5的水平(图 6A)。用小干扰RNA(siRNA)靶向敲低Plin2，使Plin2的mRNA水平降低85%以上(P < 0.01)，不改变Plin3的转录水平，但使Plin5的mRNA水平升高50%(图 6A)。Western blot结果显示，OA处理使PLIN2的蛋白水平增加了6.6倍(P < 0.01)，而对照干预和OA干预分别对比转染Plin2 siRNA后PLIN2的蛋白水平，发现其分别降低了82%和86%(P < 0.01，图 6B)。鉴于之前关于Plin3敲低后AML-12细胞中脂滴生成的研究，分别敲低Plin2或Plin3以评估Plin2对脂滴生成和脂质蓄积的影响，并比较Plin2和Plin3的效应。Bodipy染色和细胞甘油三酯的定量分析显示，与基础状态(NC)和Plin2敲低相比，Plin3敲低分别显著降低了甘油三酯的含量，而Plin2敲低与NC相比只是呈下降趋势(P=0.137 9，图 6C)。然后用OA处理AML-12细胞，Plin2或Plin3敲低可减少OA在AML-12肝细胞中的脂滴沉积，甘油三酯的定量分析显示，Plin2(P=0.042 8)或Plin3(P=0.013 3)敲低均显著降低了甘油三酯的含量。发现OA诱导下相较于Plin2的敲低，Plin3敲低后肝细胞的甘油三酯含量呈下降趋势(图 6D)。这些发现证实，Plin2是肝细胞中脂滴生成的重要因子，Plin3在调节肝细胞脂滴生成和脂质代谢中的作用比Plin2更强。
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a: P < 0.05，b: P < 0.01 A: 在有或没有OA的AML-12肝细胞中Plin2、Plin3和Plin5的基因表达(n=3)；B: AML-12肝细胞的免疫印迹和相对灰度值分析(n=3)；C：对照干预下Bodipy染色和甘油三酯含量(n=4)；D: OA干预下Bodipy染色和甘油三酯含量(n=4) 图 6 肝细胞Plin2的敲低减少了AML-12细胞脂滴的生成 |
3 讨论
本研究表明脂滴包被蛋白PLIN2可改善高脂饮食喂养的肝脏CGI-58特异性敲除小鼠的肝脏脂肪变性、葡萄糖耐量降低和胰岛素抵抗，研究还观察到肝脏Plin2敲低显著改善肝脏CGI-58敲除引起的肝脏微泡型脂肪变性。在AML-12细胞模型中，通过siRNA靶向敲除Plin2/Plin3表明Plin2和Plin3都参与了AML-12细胞的脂质积累，而且Plin3在脂滴生成和脂质蓄积的作用强于Plin2。这可能与脂滴的生物发生过程中脂滴包被蛋白家族包被脂滴的顺序有关[25]。
人类CGI-58基因突变引起的CDS伴随着严重的肝脏脂肪变性并伴有微泡型脂肪变性[4]，在肝脏CGI-58基因特异性敲除的小鼠脂肪肝模型中也观察到了这种情况[14, 21]。本研究结果表明，PLIN2参与了肝脏微泡型脂肪变性的形成，靶向Plin2可以显著改善肝脏微泡型脂肪变性，与前期国外研究结果相一致[26]。本研究进一步将该结果在肝脏CGI-58特异性敲除所致的肝脏微泡型脂肪变性这一动物模型上加以验证，为肝脏微泡型脂肪变性的预防和治疗提供了验证，并为CDS的治疗提供Plin3[13]之外的另一个可能的治疗靶点。
前期研究中探究了肝脏Plin3在肝脏CGI-58特异性敲除所致小鼠肝脂肪变性和脂肪性肝炎中的发生发展的作用及机制，表明靶向肝脏Plin3可以降低肝脏甘油三酯含量，改善肝脏脂肪变性和脂肪性肝炎的发展，缓解肝脏CGI-58特异性敲除所致的坏死性凋亡[13]。在Plin2和Plin3敲低两者的改善效果方面，靶向Plin3可使肝脏质量减轻38.6%，而Plin2则减轻33.4%；Plin3可使血清ALT和AST分别降低62.0%和47.3%，而Plin2则分别降低32.4%和53.3%[13]。综合对比评估发现，靶向Plin3在缓解肝脏CGI-58特异性敲除所致肝脏病变的效果略强于Plin2，在AML-12细胞中敲低Plin2/Plin3对AML-12细胞脂滴生成和脂质蓄积的研究结果也证实，Plin3在调节脂滴生成和脂质代谢方面的效果强于Plin2。结合在脂滴的生成过程中，Plin3先于Plin2包被脂滴，因此认为在脂滴的生成过程中，包被蛋白出现在脂滴表面的顺序可能与脂滴的调控作用大小相关。这一猜想还需要进一步的实验验证。
既往对Plin2的研究集中其对肝脏脂肪变性和肥胖的调节，肝脏中Plin2的量与肝细胞甘油三酯的含量呈正相关[27-28]。进一步研究表明Plin2参与肝脏自噬的调节[29]，且其通过调节自噬及其自身的泛素化修饰参与了多种疾病的发生发展[30-31]。近年来更多研究关注Plin2作为生物标记物指示相关疾病尤其是癌症的进展[32-33]。最新在牛脂肪细胞研究中发现PLIN2与CGI-58存在直接相互作用，且Plin2中第315位的精氨酸是Plin2-CGI-58直接作用的调节位点，参与体内脂质代谢的调节[34]。这一研究为我们探寻改善肝脏CGI-58特异性敲除所致的肝脏脂肪变性和微泡型脂肪变性提供了新的潜在靶点。
总之，本研究发现肝脏Plin2是肝脏CGI-58特异性敲除所致肝脏微泡型脂肪变性的关键蛋白，靶向Plin2可以显著改善肝脏CGI-58特异性敲除所致肝脏肿大和肝细胞损伤，为治疗CDS相关脂肪肝提供了潜在的治疗方向，以Plin2为靶点可能是治疗CDS的一种方法。同时本研究表明在肝细胞脂滴生成和脂质蓄积中Plin3发挥的作用比Plin2更强。
致谢 AML-12细胞系由杨永军教授提供；感谢余立清教授提供的技术支持和修改建议| [1] |
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