表1(Table 1)
2. 610083 成都，中国人民解放军西部战区总医院检验科;
3. 850000 拉萨，中国人民解放军西藏军区总医院儿科;
4. 610072 成都，四川省人民医院消化内镜中心;
5. 400037 重庆，陆军军医大学(第三军医大学)第二附属医院：野战内科研究所;
6. 400037 重庆，陆军军医大学(第三军医大学)第二附属医院：呼吸科
2. Department of Clinical Laboratory, General Hospital of Western Theater Command, Chengdu, Sichuan Province, 610083;
3. Department of Pediatrics, General Hospital of Xizang Command, Lasha, Xizang Autonomous Region, 850000;
4. Digestive Endoscopy Center, Sichuan Provincial People's Hospital, Chengdu, Sichuan Province, 610072, China;
5. Institute of Field Internal Medicine, Second Affiliated Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400037;
6. Department of Respiratory Diseases, Second Affiliated Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400037
肺腺癌(lung adenocarcinoma, LUAD)是肺癌的一种主要类型，占所有肺癌患者的40%以上，并且发病率逐年上升，给国民的生命健康带来严重威胁[1]。新近研究对LUAD的病因、发展机制、诊断以及治疗有了较多突破性进展，如高分辨率计算机断层扫描(CT)及新型生物标志物检测的应用等，使LUAD的早期诊断能有进一步的实现[2]。LUAD的手术、化疗和靶向治疗等方面也取得诸多进展，但由于LUAD显著的异质性，每个患者的肿瘤具有不同的生物学特征，对于治疗的反应也各不相同，LUAD的早期诊断和预后仍然面临着诸多挑战[3]。因此，LUAD早期诊断标志物和治疗靶点的研究对LUAD的早期诊断和提升LUAD患者的生存率具有重要的临床意义。
PSMA4 (prostate-specific membrane antigen 4) 在维持细胞正常生物学功能中扮演着重要角色，并且与肿瘤的发生发展密切相关。PSMA4最重要的功能是参与蛋白质降解过程，尤其是通过蛋白酶体途径[4]。蛋白酶体是一种多亚基的蛋白质复合物，负责降解细胞内不再需要的蛋白质，从而维持细胞内环境的稳定[5]。PSMA4作为蛋白酶体的一个组成部分，对于其正常功能的发挥至关重要。既往研究发现，PSMA4的表达水平在多种肿瘤中显著升高，提示它在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。研究发现，在胰腺癌中，PSMA4的表达水平增加，已成为前列腺癌诊断和治疗的潜在靶点[6]。另有研究发现，PSMA4在乳腺癌中的表达也显著增加，其与这些癌症的进展和转移密切相关[7]。机制研究发现，PSMA4可能通过调节细胞周期、促进细胞增殖和抑制细胞凋亡等途径参与肿瘤的发生发展。此外，PSMA4还可能影响肿瘤细胞的侵袭和转移能力，进一步加速肿瘤的进展[8]。对PSMA4的深入研究有助于进一步揭示其在肿瘤中的作用机制，并为肿瘤的诊断和治疗提供新的思路和方法。尽管既往研究对PSMA4进行了广泛的研究，但其与LUAD的预后和免疫浸润的关系尚少见报道。
本研究旨在深入探索PSMA4在LUAD中的转录表达及其潜在的预后意义。通过应用生物信息学技术，分析PSMA4表达水平与LUAD患者的临床病理特征、疾病进展以及免疫细胞浸润之间的关系。有助于增进对PSMA4在LUAD中角色的理解，进而为临床医生提供改善LUAD患者治疗策略和总体预后的新见解，并通过揭示PSMA4在LUAD中的具体作用机制，为LUAD的精准治疗提供新的靶点和方法。
1 材料与方法 1.1 数据来源本研究纳入的LUAD组和正常组的mRNA表达数据和临床数据来源于TCGA (the cancer genome atlas, https://portal.gdc.cancer.gov)数据库和GTEx (genotype-tissue expression, https://gtexportal.org/home)数据库，其中非配对的表达数据中正常组59例，LUAD组539例，配对的表达数据中正常组和LUAD组分别为58例。验证数据集来源于通过GEO (gene expression omnibus database) 数据库下载的GSE40791和GSE10072 LUAD数据集。GSE40791数据集中LUAD组100例，正常组97例，GSE10072数据集中LUAD组49例，正常组62例。
1.2 PSMA4在泛癌和LUAD中的表达分析从TCGA数据库下载并整理33种肿瘤的mRNA表达数据，从GTEx数据库下载正常组mRNA表达数据，通过Wilcoxon秩和检验比较PSMA4基因在正常组和LUAD组中的表达差异，用R语言中的ggplot2包对数据进行可视化。
1.3 LUAD中PSMA4中的诊断价值从TCGA数据库下载并整理TCGA-LUAD项目STAR流程的RNAseq数据并提取TPM格式的数据，用R语言中的pROC包分析数据，并对PSMA4基因进行ROC分析，结果用ggplot2进行可视化。
1.4 人类蛋白图谱数据库分析PSMA4的表达差异人类蛋白图谱(https://www.proteinatlas.org)包含了超过1 000万个由免疫细胞化学和免疫组织化学生成的单细胞蛋白表达谱，用于鉴定正常组和LUAD组之间蛋白表达的差异，并检索相关文献。基于人类蛋白图谱中的免疫组织化学图像分析比较了PSMA4在LUAD组和正常组中的蛋白质表达水平。
1.5 细胞培养正常肺上皮细胞株BEAS-2B、LUAD细胞株A549、NCI-H1975、201T均购自中国科学院上海细胞库。BEAS-2B细胞采用含10%胎牛血清的DMEM培养基，A549、NCI-H1975、201T LUAD细胞株采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，所有细胞在5%CO2、37 ℃恒温的细胞培养箱中培养，当细胞贴壁融合至80%以上用0.25%胰酶进行消化并传代。
1.6 资料收集收集10对2023年1-12月在陆军军医大学第二附属医院呼吸科进行纤维支气管镜肺活检术的LUAD患者的肿瘤和癌旁组织样本。纳入标准：①年龄18~80岁；②符合支气管镜肺活检术的适应证；③无麻醉手术禁忌证；④患者或其法定代理人已签署知情同意书，同意将其组织样本用于科学研究。排除标准：①严重心肺功能不全；②凝血功能障碍。本研究经陆军军医大学第二附属医院医学伦理委员会批准(2023-研第076-02)，患者术前均签署知情同意书。
1.7 RT-qPCR检测各组细胞中PSMA4基因的表达使用SPARKeasy改良组织/细胞RNA试剂盒(Sparkjade，中国山东)提取10对LUAD组织和邻近正常组织样本和各组细胞的总RNA。然后使用SPARKscript Ⅱ All-in-one RT SuperMix(Sparkjade，中国山东)进行反转录，将RNA转化为互补DNA。在RT-qPCR过程中，使用SYBR Green Master Mix(Sparkjade，中国山东)扩增基因。2-ΔΔCt 方法用于量化PSMA4的相对表达。本研究使用的RT-qPCR引物序列如下所示，PSMA4：上游引物AGTGTGGCAGGCAT-AACTTCT，下游引物TCACAAGGTATTGGCTCCTGA；β-actin：上游引物CATGTACGTTGCTATCCAGGC，下游引物CTCCTTAATGTCACGCACGAT。
1.8 PSMA4高低表达组的临床信息分析分析TCGA数据库的患者临床信息，根据PSMA4在LUAD患者中表达的中位数水平，将LUAD癌症分为2组：PSMA4高表达组(高于中位数表达水平)和PSMA4低表达组(低于中位数表达水平)，分析比较2组患者的年龄、性别、吸烟史等基线临床资料。并进一步比较分析2组患者的主要治疗结局的情况，包括疾病进展(progressive disease，PD)、疾病稳定(stable disease，SD)、部分缓解(partial response，PR)、完全缓解(complete response，CR)的比例。
1.9 PSMA4高低表达组的差异表达分析进一步分析TCGA数据库的LUAD基因表达数据，为了进一步研究2组之间基因表达的差异，使用R语言的DESeq2包，将差异表达基因(differently expressed genes, DEGs)的阈值设置为调整后的P < 0.05，且|Log2 fold change (FC)|>2。火山图通过ggplot2包对差异分析结果进行可视化展示，并通过Spearman相关系数分析评估前10个DEGs的表达(5个显著升高和5个显著降低)与PSMA4之间的相关性。采用基于基因本体(gene ontology, GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)数据库的联合分析方法，探究DEGs富集的信号通路和功能，通过ggplot2包进行可视化展示联合分析的弦图。
1.10 PSMA4高低表达组的生存曲线分析从TCGA数据库下载并整理LUAD组的基因表达数据库和生存资料，采用Kaplan-Meier(KM)法和对数秩检验，针对PSMA4高低表达组使用R语言的survival包进行比例风险假设检验并进行拟合生存回归，分析PSMA4高低表达对LUAD总体生存率(overall survival, OS)、疾病特异性存活率(disease specific survival, DSS)、无进展生存期(progress free interval, PFI)的差异，结果用survminer包以及ggplot2包进行可视化。
1.11 免疫浸润分析分析TCGA数据库的LUAD基因表达数据，进一步分析免疫细胞浸润水平，使用单样本基因集富集分析方法测量这些免疫细胞在LUAD中的相对富集分数，该方法使用R包GSVA进行。此外，利用Spearman相关系数分析探讨了PSMA4水平与24种免疫细胞的关系，通过ggplot2包进行可视化展示。
1.12 PSMA4高低表达组的预后分析针对PSMA4高低表达组LUAD患者的临床资料，对LUAD进行了单因素和多因素Cox回归分析。在单变量Cox回归分析中，将年龄、性别、吸烟史、主要治疗结局确定了一个显著性水平为P < 0.05的预后变量并纳入多变量Cox分析中进一步分析该变量。使用R软件包ggplot2生成森林图，展示了单变量、多变量Cox回归结果。为了预测总体生存概率，根据多变量Cox回归分析结果确立独立预后因素，并建立列线图，直观地表示这些因素与生存概率之间的关系，并使用校准图来评估列线图的性能。
1.13 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行数据分析。采用Wilcoxon符号秩检验分析PSMA4在LUAD组与正常组的表达差异，2组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 PSMA4在LUAD中高表达泛癌分析显示，PSMA4在大多数肿瘤中的表达水平均高于正常组，如LUAD、膀胱尿路上皮癌、胆管癌等(图 1A)。PSMA4在LUAD组中的表达水平明显高于正常组(P＜0.01，图 1B)，此外，在58例LUAD组中，其表达量显著高于配对相邻组织(P＜0.01，图 1C)。通过分析GSE40791和GSE10072 2个LUAD数据集发现，PSMA4在LUAD组的表达显著增加(图 1D、E)。受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线分析表明，PSMA4基因在LUAD组中的表达对预测该疾病的存在具有很高的准确性。ROC曲线的曲线下面积(area under the curve, AUC)值确定为0.672(图 1F)，表明PSMA4或许可以作为LUAD早期诊断的生物标志物。
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a：P＜0.05, b：P＜0.01, 与正常组比较 A: PSMA4泛癌表达水平比较；B: TCGA数据库分析PSMA4在肿瘤组和正常组中的表达；C: TCGA数据库分析PSMA4在配对LUAD组和正常组中的表达; D: 火山图分析PSMA4在GSE40791数据集LUAD组和正常组中的表达; E: 火山图分析PSMA4在GSE10072数据集LUAD组和正常组中的表达; F: PSMA4在LUAD中的诊断ROC曲线 图 1 PSMA4在泛癌和LUAD中的表达情况及PSMA4诊断LUAD的效能分析 |
2.2 人类蛋白图谱数据库和RT-qPCR验证PSMA4的表达
利用人类蛋白图谱数据库，分析PSMA4在LUAD组和正常组中的表达。免疫组化结果显示，PSMA4在LUAD组中的表达显著高于正常组(图 2A)。与对照肺上皮细胞系BEAS-2B比较，PSMA4基因在LUAD细胞系A549、NCI-1975、201T中的表达显著升高(图 2B)。并且，进一步通过RT-qPCR评估PSMA4在LUAD组织中的表达水平。结果发现，与癌旁组织比较，LUAD组织中PSMA4基因的表达显著增加(图 2C)。
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| A: 人类蛋白图谱数据库中PSMA4在LUAD组和正常组中的免疫组化染色；B: RT-qPCR检测PSMA4在BEAS-2B、A549、NCI-H1975、201T各细胞系中的表达 a：P＜0.01，与BEAS-2B比较；C: RT-qPCR检测PSMA4在LUAD组织和癌旁组织中的表达b：P＜0.01，与正常组比较 图 2 人类蛋白图谱数据库和RT-qPCR验证PSMA4的表达 |
2.3 PSMA4在LUAD中的预后价值
为了探究PSMA4在LUAD中的预后价值，进一步分析比较PSMA4高表达组和低表达组的临床信息。分析发现，2组患者的年龄、性别、吸烟史等基线临床资料差异无统计学意义。进一步分析发现，PSMA4高表达组PD的比例显著高于PSMA4低表达组(P＜0.05)，而SD、PR、CR的比例显著低于PSMA4低表达组(P＜0.05，表 1)。采用KM法评估PSMA4水平与LUAD预后的相关性。结果发现，PSMA4高表达组患者的OS、DSS、PFI预后较低表达组患者差(图 3)，提示PSMA4的高表达是LUAD不良预后的危险因素。
| 临床信息 | PSMA4低表达组(n=269) | PSMA4高表达组(n=270) | P |
| 年龄/岁 | 0.429 | ||
| ≤65 | 134 | 123 | |
| >65 | 128 | 135 | |
| 未知 | 7 | 12 | |
| 性别 | 0.092 | ||
| 女 | 154 | 135 | |
| 男 | 115 | 135 | |
| 吸烟史/年 | 0.323 | ||
| < 40 | 99 | 89 | |
| ≥40 | 86 | 95 | |
| 未知 | 84 | 86 | |
| 主要治疗结局 | ＜0.05 | ||
| PD | 24 | 47 | |
| SD | 26 | 12 | |
| PR | 5 | 1 | |
| CR | 179 | 155 | |
| 未知 | 35 | 55 | |
| “未知”为统计缺失值 | |||
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| A: OS; B: DSS; C: PFI 图 3 PSMA4水平与LUAD预后的相关性分析 |
2.4 LUAD的Cox回归分析和列线图分析
为进一步明确PSMA4的表达与LUAD的预后关系，采用单因素和多因素Cox回归分析构建LUAD风险模型，通过对肺癌的单因素Cox回归分析发现，T2、T3+T4、N1、N2+N3、M1、PSMA4高表达是LUAD的潜在危险因素(图 4A)。进一步通过多因素Cox回归发现，T2、T3+T4、N1、N2+N3、PSMA4高表达是LUAD的独立危险因素(图 4B)。为了预测LUAD患者的预后，对各种独立因素进行了单因素回归分析，以P＜0.05为检验水准，筛选出独立危险因素，并得出一个综合的列线图(图 4C)。结果发现，随着图表上总点数的增加，表明存在的不良因素越多，总分越高，LUAD患者的预后越差。
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| A: LUAD的单因素Cox回归分析森林图; B: LUAD的多因素Cox回归分析森林图; C: LUAD的多因素Cox回归分析的列线图分析 图 4 LUAD的Cox回归分析和列线图分析 |
2.5 PSMA相关DEGs功能富集分析
PSMA4高表达组和低表达组之间共有162个差异表达编码基因。其中上调基因49个，占30.2%，下调基因113个，占69.8%(调整后P < 0.05，且|Log2 FC|>2，图 5A)。研究集中在显著上调或下调差异的各前5个基因(10个基因)及其与PSMA4的关系上。这些基因包括H4C6、PRB4、H4C13、MAB21L2、IFNK、NTS、DEFA5、DPPA2、CGA、TM4SF20，进一步分析它们与PSMA4的关联(图 5B)。对所有DEGs进行GO和KEGG富集分析。生物学过程(BP)主要富集了核小体组织装配、染色质组等。细胞组分(CC)主要富集于核小体、蛋白质-DNA复合体、DNA组装复合体。分子功能(MF)富集项为蛋白质异二聚化活性、染色质DNA结合、核小体DNA结合等。在KEGG通路分析中，显著富集的通路是中性粒细胞胞外陷阱的形成、癌症中的转录失调等(图 5C)。
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| A: PSMA4高表达组和低表达组差异基因的火山图分析; B: 前10关键基因与PSMA4高表达组和低表达组的相关性热图分析; C: 弦图展示PSMA4高表达组和低表达组差异基因的GO、KEGG联合分析 图 5 PSMA相关差异表达基因(DEGs)功能富集分析 |
2.6 PSMA4与LUAD免疫浸润的关系
为探究PSMA4与LUAD中免疫细胞浸润的关系，分析TCGA数据库的LUAD基因表达数据，进一步分析免疫细胞浸润水平，对PSMA4和免疫浸润矩阵数据之间的相关性进行分析，结果显示，PSMA4水平与免疫细胞浸润数量呈明显负相关(图 6)，PSMA4高表达组与效应记忆性T细胞、滤泡辅助性T细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、中央记忆性T细胞、肥大细胞、巨噬细胞等的水平降低相关。
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| a：P＜0.05, b：P＜0.01 图 6 棒棒糖图展示PSMA4和LUAD免疫浸润之间的相关性 |
3 讨论
LUAD作为一种常见的非小细胞肺癌类型，其发生发展呈现出显著的异质性[9]。由于LUAD早期症状不明显，很多患者在确诊时已经是中晚期，错过了最佳治疗时机。目前，尽管临床上已经采用了一些病理指标如病理分级、EGFR突变状态、ALK重排、KRAS突变以及PD-L1表达等来进行预后预测和个性化治疗方案的制定，但这些指标在预测LUAD患者的预后方面仍存在一定的局限性[10]。LUAD的异质性不仅体现在不同患者之间的生物学行为差异，还体现在同一患者肿瘤内部不同区域的细胞遗传学、分子表达等方面的差异，这种异质性导致了临床治疗的复杂性和挑战性，使得单一的治疗策略往往难以取得理想的疗效。并且，部分LUAD患者在接受靶向治疗等治疗方法后，可能会出现耐药现象，导致治疗效果不佳[11]。因此，针对LUAD的早期诊断、个性化靶向治疗、减少耐药LUAD的发生是目前临床需要解决的问题。
本研究中使用TCGA数据库的数据分析了PSMA4在LUAD中的表达。研究发现，相较于正常组织，PSMA4多种肿瘤组织中的表达显著升高，其中包括了LUAD。并且，通过RT-qPCR实验和调研人类蛋白图谱数据库，明确了PSMA4在LUAD细胞、组织中的表达显著高于正常肺上皮细胞和癌旁组织。进一步通过诊断ROC曲线分析发现，PSMA4基因表达在预测LUAD方面具有较高的准确性。既往多项研究证实，PSMA4在多种肿瘤组织中的表达显著增加，例如，在乳腺癌[7]、胃癌[12]、胰腺癌[6]等。并且，进一步研究发现，PSMA4的高表达状态与肿瘤的恶性程度、侵袭性、转移能力等呈正相关，提示PSMA4的高表达在肿瘤的发生发展过程中起到了关键作用[13]。机制研究明确，PSMA4能够通过调节细胞内蛋白质降解过程，影响肿瘤细胞的增殖、凋亡等生物学行为。并且，PSMA4还能够与多种肿瘤相关蛋白相互作用，促进肿瘤细胞的侵袭、转移。PSMA4的高表达还与肿瘤细胞的耐药性有关，导致肿瘤细胞对化疗药物的敏感性降低，影响肿瘤患者的预后[14]。在本研究中，PSMA4高表达组和低表达组的差异表达编码基因通过GO-BP主要富集到核小体组织装配、染色质组等生物学过程，核小体是染色体的基本结构单位，由DNA和组蛋白组成。核小体的装配过程直接影响了DNA的可接近性，进而影响转录因子和RNA聚合酶等调控元件与DNA的结合，从而调控基因的表达[15]。这提示PSMA4可能通过影响核小体装配和染色质组学异常，改变关键基因的表达模式，导致LUAD相关基因(如癌基因、抑癌基因等)的失调，进而促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移，发挥促癌作用。
许多研究已经提供证据证明肿瘤微环境对肿瘤进展的影响。研究发现，肿瘤细胞与微环境之间的相互作用对肿瘤的生长、侵袭和对治疗的反应有很大的影响[16]，此外，滤泡辅助性T细胞[17]、B淋巴细胞[18]、自然杀伤细胞[19]、巨噬细胞[20]等免疫细胞在肿瘤微环境中机体对肿瘤的免疫应答中起重要肿瘤监视的作用，进而抑制肿瘤的发生发展。另有研究发现，肿瘤微环境中免疫细胞的类型、密度和位置会影响患者的预后[21]。在本研究中，发现与LUAD相关的基因PSMA4的表达与TFH细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞浸润的数量呈负相关，提示PSMA4高表达可通过调节浸润免疫细胞的数量和类型，影响LUAD肿瘤免疫内环境，进而导致LUAD的发生发展，影响LUAD的预后。
虽然本研究为PSMA4水平与LUAD患者诊断、预后及免疫浸润的相关性提供了新的视角，但仍有局限性。首先，本研究只涉及了少量数据集，包括TCGA数据库、GTEx数据库、GSE40791和GSE10072 LUAD数据集，这也可能限制了患者群体的多样性，并导致选择偏倚。其次，大部分数据从网上数据库下载，未开展前瞻性RCT研究评估治疗前后与PSMA4表达的变化情况。在后续的研究中，还需要设计前瞻性的实验来验证本研究的结果，研究和探讨PSMA4的表达与LUAD治疗效果的关联。
综上所述，本研究提供的证据表明PSMA4的表达与LUAD患者预后较差有关，提示PSMA4可能作为一种新的LUAD预后生物标志物。然而，值得注意的是，PSMA4影响LUAD发生发展的确切生物学机制尚不清楚，需要进一步的研究来揭示PSMA4发挥其作用的复杂生物学途径。PSMA4基因可能是LUAD一个潜在的促癌基因。PSMA4基因的高表达与LUAD的发生发展、肿瘤免疫内环境以及预后均有着非常密切的相关性，通过进一步的研究，将来PSMA4基因可作为LUAD一个重要的诊断和预后相关的生物学标志物。
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