当归多糖(angelica polysaccharide，APS)是从植物当归中提取的一种水溶性成分。它是由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖和半乳糖醛酸等组成的多糖。APS具有支持造血、保肝、抗肿瘤、抗炎、免疫调节等多种功能[1]。研究表明，APS是通过与细胞表面的受体结合从而激活多种免疫细胞发挥免疫调节作用[2]。APS能够促进淋巴细胞增殖，增强淋巴细胞的抗肿瘤活性。同时，可以激活自然杀伤细胞(natural killer cell, NK)和自然杀伤性T细胞(natural killer T cell，NKT)进而发挥免疫应答作用[3]。APS可以促进巨噬细胞增殖，激活巨噬细胞的免疫功能[4]。
巨噬细胞主要来源于骨髓细胞中循环的单核细胞，具有高度的可塑性[5-6]。在不同微环境的作用下，巨噬细胞会分化为不同的表型，主要分为经典途径活化的M1型巨噬细胞和替代途径活化的M2型巨噬细胞[7]。脂多糖和干扰素γ刺激巨噬细胞可以诱导其产生M1型巨噬细胞，主要表达主要组织相容复合物Ⅱ(major histocompatibility complex，MHC-Ⅱ)、CD68、CD86等标志物，能够分泌肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和诱导型一氧化氮合酶等细胞因子，从而发挥抗肿瘤、清除病原微生物的作用[8-9]。另一方面，白细胞介素4和白细胞介素13可以诱导M2型巨噬细胞的产生，主要表达CD163、甘露糖受体(mannose receptor，MR/CD206)、CD200受体(CD200 receptor，CD200R)等，通过分泌白细胞介素10、精氨酸酶1(arginase 1，ARG-1)和转化生长因子β来抑制炎症反应，发挥抗炎作用[9-10]。
甘露糖受体(mannose receptor，MR)是一种模式识别受体，主要表达在巨噬细胞表面，其本质是一种跨膜蛋白，由一个富含半胱氨酸的结构域和多个C型凝集素结构域等成分组成。它参与先天性免疫应答，能够特异性地识别以甘露糖、岩藻糖或N-乙酰葡糖胺为末端的配体结合，从而发挥免疫调节的作用[11-12]。研究表明，APS可以与Kupffer细胞的MR结合产生靶向肝脏的作用，对急性肝损伤有保护作用[13]。我们前期研究发现，APS能够促进髓系来源的抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)的增殖、分化和免疫抑制功能，并与MR的表达水平呈正相关[14]。这些结果提示APS能够与MR相互作用而影响细胞的增殖、分化和功能。然而，APS是否对MR的表达具有调控作用，并对M2型巨噬细胞的分化和功能是否能起到调控作用目前尚不清楚。因此，本研究利用体内、体外试验，检测了APS对M2型巨噬细胞表达MR的影响，以及APS对M2型巨噬细胞凋亡、分化和功能的影响，并探究了其分子机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物70只6~8周SPF级C57BL/6雌性小鼠，体质量20~22 g，购于山东第二医科大学实验动物繁育中心。所有实验步骤经过山东第二医科大学实验动物伦理委员会审核(2022SDL229)，符合动物伦理要求。
1.2 实验材料APS购自中国山东优科生物科技公司，重组小鼠IL-4、M-CSF购自美国PeproTech公司，荧光微球购自美国Polysciences公司，抗鼠CD16/32抗体、抗鼠CD11b-FITC抗体、抗鼠CD206(MR)-percp5.5抗体、抗鼠CD163-PE-CY7抗体、Cell Activation Cocktail刺激剂购自美国Biolegend公司，抗鼠F4/80-PE抗体、抗鼠CD206(MR)-AF647抗体购自美国BD公司，抗鼠ARG-1-APC抗体、山羊抗兔抗体购自美国Invitrogen公司，抗兔p-STAT6抗体购自美国CST公司，Alexa Fluor® 647荧光Anti-F4/80抗体购自英国Abcam公司，抗荧光淬灭封片剂购自上海翌圣生物科技，山羊血清购自北京中衫金桥公司，FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD购自美国Biolegend公司，巯基乙酸盐购自中国上海Sigma-Aldrich公司，DMEM培养基购自美国Gibco公司，RPMI Medium 1640培养基购自美国Gibco公司，Fixation Buffer、Perm Wash Buffer(10×)购自美国Biolegend公司。
1.3 方法 1.3.1 诱导骨髓源性的M2型巨噬细胞诱导骨髓源性巨噬细胞(bone marrow derived macrophage，BMDM)：CO2吸入法处死C57BL/6小鼠，随后分离出股骨和胫骨，用PBS将骨髓细胞冲洗到培养皿中，并用红细胞裂解缓冲液裂解红细胞。用含10%胎牛血清的DMEM培养基将细胞的浓度调整为3×106个细胞/mL。在12孔板的每孔加入1 mL的细胞悬液，并且每孔补充终浓度为20 ng/mL的重组小鼠M-CSF，在CO2培养箱中培养6 d，每隔2天半量换液。
诱导BMDM分化为M2型巨噬细胞：以上体外诱导的BMDM，在第6天半量换液时，加入终浓度为20 ng/mL IL-4以诱导其分化为M2型巨噬细胞，并同时加入不同浓度的APS(0、80、160、320 μg/mL)，孵育16 h。
1.3.2 获取小鼠的腹腔巨噬细胞给小鼠腹腔注射2 mL巯基乙酸盐。3 d后采用CO2吸入法处死小鼠，在小鼠腹部中央剪开一小口，撕开皮肤，暴露小鼠的腹腔。向腹腔内注射3 mL预冷的PBS，同时用手指从两侧轻轻揉压腹壁2~3 min，回收灌洗液。离心后弃去上清液。用含10%胎牛血清的RPMI Medium 1640培养基将细胞接种在12孔板中，2 h后弃去培养上清，用PBS洗去未贴壁的细胞，重复2次，得到腹腔巨噬细胞。加入不同浓度的APS(0、160 μg/mL)，孵育16 h。
1.3.3 巨噬细胞MR的检测APS处理的BMDM诱导分化的M2型巨噬细胞和腹腔巨噬细胞分别收集于流式管中，加入抗鼠CD16/32抗体封闭15 min，随后加入抗鼠CD11b-FITC抗体、抗鼠F4/80-PE抗体进行表面标记染色，随后固定透膜：加入Fixation Buffer，每管加入250 μL，混匀后在室温下避光静置20 min，室温350×g，离心5 min弃去上清液。用超纯水将Perm Wash Buffer(10×)稀释至1×，每管加入500 μL稀释后的Perm Wash Buffer(1×)，室温350×g，离心10 min，弃去上清液，重复2次。加入抗鼠CD16/32抗体封闭15 min后，加入抗鼠CD206(MR)-AF647抗体，4 ℃避光孵育30 min，流式细胞仪(美国BD公司)检测CD11b、F4/80、CD206(MR)标记物的表达，用FlowJo 7.6软件进行分析。
1.3.4 检测巨噬细胞CD163的表达APS处理的BMDM诱导分化的M2型巨噬细胞同时加入不同浓度的APS(0、80、160、320 μg/mL)处理，培养16 h。收集细胞于流式管中，加入抗鼠CD16/32抗体封闭，混匀后放置在4 ℃冰箱，15 min后加入抗鼠CD11b-FITC抗体、抗鼠F4/80-PE抗体、抗鼠CD163-PE-CY7抗体表染，4 ℃避光孵育30 min，用流式细胞仪检测CD11b、F4/80、CD163标记物的表达，用FlowJo 7.6软件进行分析。
1.3.5 观察APS对巨噬细胞形态的影响APS处理的BMDM诱导分化的M2型巨噬细胞加入不同浓度的APS(0、160、320 μg/mL)，孵育16 h。弃去培养基，每孔加入1 mL的PBS，置于倒置荧光显微镜下观察细胞形态并拍照记录。每孔在显微镜下随机选取5个视野。
1.3.6 流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测APS对M2型巨噬细胞的凋亡APS处理的BMDM诱导分化的M2型巨噬细胞加入不同浓度的APS(0、160、320 μg/mL)，孵育16 h。收集细胞于流式管中。每个流式管加入1 mL PBS，离心弃去上清液，重复2次。加入100 μL AnnexinV结合缓冲液重悬细胞，随后加入5 μL AnnexinV和5 μL 7-AAD，轻轻混匀，室温下避光放置15 min，用流式细胞仪检测AnnexinV和7-AAD标记物的表达，用FlowJo 7.6软件进行分析。
1.3.7 M2型巨噬细胞功能的测定APS处理的BMDM诱导分化的M2型巨噬细胞加入不同浓度的APS(0、160 μg/mL)，孵育16 h。收集细胞于流式管中，加入抗鼠CD11b-FITC抗体、抗鼠F4/80-PE抗体进行表面标记染色，如上1.3.3固定透膜，加入抗鼠CD16/32抗体封闭15 min，随后加入抗鼠ARG-1-APC抗体，4 ℃避光孵育30 min，流式细胞仪检测CD11b、F4/80、ARG-1标记物的表达，用FlowJo 7.6软件进行分析。
APS处理的BMDM诱导分化的M2型巨噬细胞加入不同浓度的APS(0、160 μg/mL)，孵育12 h。随后每孔加入FITC标记的荧光微球，置于37 ℃避光孵育2 h。收集细胞于流式管中，再用PBS洗涤3次，流式细胞仪检测FITC标记的荧光微球的荧光强度，用FlowJo 7.6软件进行分析。
1.3.8 荧光定量PCR检测M2型巨噬细胞MR、ARG-1 mRNA的表达APS处理的BMDM诱导分化的M2型巨噬细胞加入不同浓度的APS(0、160 μg/mL)，孵育16 h。使用TRIzol法提取细胞RNA，按照反转录试剂盒进行反转录，将RNA反转录为cDNA，然后进行PCR扩增反应。选用GAPDH作为内参基因，根据2-ΔΔCt方法进行计算。GAPDH：(上游引物)5′-TGTC-TCCTGCGACTTCAACA-3′，(下游引物)5′-GGTGGTC-CAGGGTTTCTTACT-3′；MR：(上游引物)5′-CTCTGT-TCAGCTATTGGACGC-3′，(下游引物)5′-CGGAATTT-CTGGGATTCAGCTTC-3′；ARG-1：(上游引物)5′-TGTC-CCTAATGACAGCTCCTT-3′，(下游引物)5′-GCATCCA-CCCAAATGACACAT-3′。
1.3.9 免疫荧光标记检测M2型巨噬细胞p-STAT6的表达将无菌爬片贴于12孔细胞培养板的底部，每孔加入小鼠骨髓细胞悬液并按上述1.3.1方法，诱导M2型巨噬细胞分化，同时加入不同浓度的APS(0、160 μg/mL)处理，培养16 h。向12孔板中加入多聚甲醛固定15 min，PBS缓冲液洗3次，每次5 min；加入甲醇于-20 ℃孵育10 min，PBS缓冲液洗5 min；封闭缓冲液室温封闭1 h，加入抗p-STAT6抗体，4 ℃过夜。第2天拿出复温30 min，PBS缓冲液洗3次，每次5 min；分别加入AF488偶联的山羊抗兔抗体，F4/80-AF647荧光抗体，室温孵育1 h，PBS缓冲液洗3次，每次5 min；将爬片取出盖在滴加了含DAPI的抗荧光淬灭封片剂的载玻片上，荧光显微镜下观察并拍照记录，用Image J软件进行分析。
1.3.10 小鼠灌胃处理适应性喂养小鼠1周后，按随机数字法将其分为APS组、对照组，每组5只。APS组小鼠给予250 μL APS(200 mg/kg)灌胃，对照组给予等体积的去离子水灌胃，每天1次，持续8周。
1.3.11 体内巨噬细胞MR表达的检测小鼠经灌胃给药8周后，CO2窒息法处死小鼠，采集小鼠的心脏外周血，注入含柠檬酸钠流式管中。分离小鼠的脾脏组织，将其剪碎并研磨，用40 μm的细胞过滤网研磨过滤，制备脾脏单个细胞悬液。将外周血和脾脏单个细胞悬液分别裂解红细胞，调整细胞浓度为1×106个/mL，向每个流式管中加入100 μL细胞悬液。按照上述1.3.3的方法染色，流式细胞仪检测CD11b、F4/80、CD206(MR)标记物的表达，用FlowJo 7.6软件进行分析。
1.4 统计学分析所有数据使用GraphPad Prism 8.0.2软件进行统计学分析和图表绘制，符合正态分布数据2组样本间均数差异比较采用配对t检验，数据以x±s表示，不符合正态分布采用Kruskal-Wallis检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 体外APS抑制巨噬细胞MR的表达结果显示，与0 μg/mL APS组相比，160 μg/mL APS组可降低腹腔巨噬细胞表面MR的表达水平(P＜0.01，图 1A、B)。表明APS可以抑制巨噬细胞MR的表达。
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a：P＜0.01，b：P＜0.05，与0 μg/mL APS组比较 A：腹腔巨噬细胞MR最具代表的流式图；B：腹腔巨噬细胞中MR细胞的百分比(n=5，x±s)；C：BMDM分化的M2型巨噬细胞MR最具代表的流式图；D：BMDM分化的M2型巨噬细胞中MR细胞的百分比(n=5，x±s)；E：BMDM分化的M2型巨噬细胞MR的mRNA表达水平(n=6，x±s) 图 1 APS对巨噬细胞MR的影响 |
MR是M2型巨噬细胞的主要标志物，因此接下来检测了APS对BMDM诱导分化的M2型巨噬细胞MR表达的影响。如图 1C、D所示，在加入重组小鼠IL-4诱导BMDM分化为M2型巨噬细胞的过程中，随着APS浓度的升高(80~320 μg/mL)，M2型巨噬细胞表面MR表达呈剂量依赖性降低(P＜0.01)。同样地，与0 μg/mL APS组相比，160 μg/mL APS组的BMDM分化的M2型巨噬细胞MR mRNA表达水平也下降(P＜0.05，图 1E)。表明APS也可抑制M2型巨噬细胞MR的表达。
2.2 APS抑制小鼠体内巨噬细胞MR的表达为了进一步验证在体外实验中发现的APS对巨噬细胞MR表达影响的结果，随后又检测了APS在体内对小鼠巨噬细胞MR表达的影响。如图 2所示，与对照组相比，APS处理组的小鼠外周血和脾脏中巨噬细胞MR的表达均明显下降(P＜0.05)。表明与体外实验一致，APS在小鼠体内也能够降低巨噬细胞MR的表达。
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a：P＜0.05，与对照组比较
A：小鼠外周血中巨噬细胞MR最具代表的流式图；B：MR细胞在外周血巨噬细胞中的比例；C：小鼠脾脏中巨噬细胞MR的典型流式代表图；D：MR细胞在脾脏巨噬细胞中的比例 图 2 APS在体内对小鼠巨噬细胞MR表达的影响(n=10，x±s) |
2.3 APS升高M2型巨噬细胞CD163的表达
如图 3A、C所示，FSC-A和FSC-H去除细胞黏连体，CD11bF4/80设门选定BMDM，BMDM门内由CD163选定为M2型巨噬细胞。与0 μg/mL APS组相比，80、160、320 μg/mL APS组CD11bF4/80巨噬细胞的百分比显著增加(P＜0.01)。同时，如图 3B、D所示，APS组CD11bF4/80巨噬细胞的CD163表达水平与0 μg/mL APS组相比也显著升高(P＜0.01)。表明APS可升高M2型巨噬细胞CD163的表达。
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a：P＜0.01，与0 μg/mL APS组比较
A：BMDM最具代表的流式图；B：BMDM分化的M2型巨噬细胞最具代表的流式图 ISO: 同型对照抗体；C：骨髓细胞中分化为巨噬细胞的比例(n=7，x±s)；D：BMDM分化的M2型巨噬细胞中CD163细胞的比例(n=5，x±s) 图 3 APS对M2型巨噬细胞CD163表达的影响 |
2.4 APS改变巨噬细胞的形态
因有研究发现，APS对细胞生物学功能的影响可能与其对细胞形态的影响相关，因此在诱导BMDM分化为M2型巨噬细胞的过程中，用显微镜观察了APS对巨噬细胞形态的影响。镜下观察了BMDM的形态，如图 4A所示，细胞呈扁平状，有较多突起。M2型巨噬细胞形态特点为细胞呈长索状，有细长伪足。镜下观察0 μg/mL APS组细胞大多呈梭形，并且具有较长的伪足，边界较为清楚；160 μg/mL APS组细胞大多为类圆形或不规则，少数细胞具有伪足，部分细胞边界不清；320 μg/mL APS组细胞形态大多数不规则并且边界不清，并且可以观察到细胞数量明显减少。并且对视野下的梭形细胞进行统计，与0 μg/mL APS组相比较，160、320 μg/mL APS组视野中梭形细胞所占总细胞比例明显降低(P＜0.05，图 4B)。表明APS可以影响巨噬细胞的形态，使其M2型巨噬细胞的比例减少。
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a：P＜0.01，b：P＜0.05，与0 μg/mL APS组比较；c：P＜0.05，与BMDM组比较
A：BMDM、0 μg/mL APS组、160 μg/mL APS组、320 μg/mL APS组细胞的形态；B：梭形细胞的百分比(n=5，x±s) 图 4 APS对巨噬细胞形态的影响 |
2.5 高浓度的APS促进M2型巨噬细胞凋亡
因上述显微镜下观察发现320 μg/mL APS组巨噬细胞数量明显减少，所以接下来检测了APS对BMDM分化的M2型巨噬细胞凋亡的影响。如图 5A、B所示，与0 μg/mL APS组相比，160 μg/mL APS组M2型巨噬细胞晚期凋亡没有显著变化，但320 μg/mL APS组M2型巨噬细胞晚期凋亡明显升高(P＜0.01)；与0 μg/mL APS组相比，160、320 μg/mL APS组M2型巨噬细胞早期凋亡均升高(P＜0.05，图 5A、C)；与0 μg/mL APS组相比，160、320 μg/mL APS组M2型巨噬细胞总凋亡比例也均升高(P＜0.05，图 5A、D)。表明APS可以诱导M2型巨噬细胞凋亡，并呈浓度依赖性。因160 μg/mL APS组细胞凋亡比例相对较少，为避免细胞凋亡情况会影响检测结果，后续APS对M2型巨噬细胞功能和分子机制的实验只选用了160 μg/mL的APS进行处理。
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a：P＜0.01，b：P＜0.05，与0 μg/mL APS组比较
A：最具代表的流式图；B：M2型巨噬细胞晚期凋亡的比例；C：M2型巨噬细胞早期凋亡的比例；D：M2型巨噬细胞总凋亡比例 图 5 APS对M2型巨噬细胞凋亡的影响(n=6，x±s) |
2.6 APS对M2型巨噬细胞功能的影响
与0 μg/mL APS组相比，160 μg/mL APS组的M2型巨噬细胞ARG-1的表达水平明显下降(P＜0.01，图 6A、B)，同样地，ARG-1的mRNA表达水平也明显下降(P＜0.05，图 6C)。
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a：P＜0.01，b：P＜0.05, 与0 μg/mL APS组比较
A：M2型巨噬细胞分泌ARG-1最具代表的流式图；B：M2型巨噬细胞中ARG-1细胞的比例(n=8，x±s)；C：M2型巨噬细胞ARG-1 mRNA的表达水平(n=3，x±s)；D：M2型巨噬细胞吞噬荧光微球最具代表的流式图；E：M2型巨噬细胞吞噬荧光微球的平均荧光强度(n=5，x±s) 图 6 APS对M2型巨噬细胞功能的影响 |
因表达MR，吞噬功能也是M2型巨噬细胞的主要功能之一，并且上述研究发现APS可以抑制M2型巨噬细胞MR的表达，因此又检测了APS对M2型巨噬细胞吞噬荧光微球的影响。如图 6D、E所示，与0 μg/mL APS组相比，APS处理组M2型巨噬细胞吞噬荧光微球的平均荧光强度显著增加(P＜0.01)。
这些结果表明APS对M2型巨噬细胞的功能可起到双向调控作用，即一方面可抑制其ARG-1的表达水平，另一方面又可增强其吞噬颗粒的能力。
2.7 APS抑制M2型巨噬细胞STAT6信号通路的磷酸化水平如图 7所示，DAPI染色标记细胞核，F4/80阳性细胞质为红色，磷酸化的信号转导子和转录激活子6(phosphate acidified-signal transducers and activators of transcription 6, p-STAT6)阳性显示绿色荧光。与0 μg/mL APS组相比，160 μg/mL APS组的p-STAT6的阳性信号平均荧光强度明显减低(P＜0.01)。表明APS可抑制M2型巨噬细胞信号转导子和转录激活子6(signal transducers and activators of transcription 6, STAT6)的磷酸化。
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| A：最具代表的流式图；B：p-STAT6阳性信号的平均荧光强度(n=6，x±s) a：P＜0.05，与0 μg/mL APS组比较 图 7 APS对M2型巨噬细胞STAT6信号通路的影响 |
3 讨论 3.1 APS对M2型巨噬细胞分化的影响
MR是巨噬细胞表面表达的主要模式识别受体之一，它能够与甘露糖、岩藻糖或N-乙酰葡糖胺为末端的配体结合，促进巨噬细胞活化、抗原递呈和免疫反应。大部分MR分布在胞内内吞途径上，大约10%的MR分布于细胞表面。MR与配体结合后可被内吞到被膜小泡，内吞后的MR在内体酸性环境中释放出配体后，MR重新回到胞膜。因此，MR是循环于胞膜和初级内体之间的，并可继续参与配体的内吞[15]。研究发现，大黄多糖可以升高小鼠腹腔巨噬细胞表面MR的活性，黑灵芝多糖可以升高小鼠腹腔巨噬细胞表面MR的表达[16]。因研究发现APS可以与Kupffer细胞的MR结合，MR的表达水平与APS对MDSCs生物学功能的调控呈正相关，因此本研究首先检测了APS对腹腔巨噬细胞MR表达的影响。结果显示APS体外、体内均可降低巨噬细胞、M2型巨噬细胞MR的表达和MR mRNA水平，推测APS可能通过与MR结合后，下调巨噬细胞MR的表达，其详细机制将进一步探讨。
巨噬细胞具有显著的异质性，具有动态的功能和表型[6]。巨噬细胞在受到环境信号、细胞因子等刺激时，会产生特定的表型[17]。APS能够将RAW264.7细胞系分化的M1型巨噬细胞重新极化为M2型巨噬细胞。APS可以抑制LPS诱导的M1型巨噬细胞释放白细胞介素6、肿瘤坏死因子-α等促炎因子，同时上调M2型巨噬细胞抗炎因子IL-10、ARG-1的表达[18-19]。前期研究发现APS对MDSCs分化和功能的调控作用与其细胞表面MR的表达水平成正相关[14]，这可推测APS与MR结合后，可能对巨噬细胞分化和功能也具有调控作用。除MR外，CD163也是M2型巨噬细胞膜表面的主要标志物之一，它可参与巨噬细胞对病原体的结合和吞噬，并参与抗炎、抗氧化和免疫调节[20]。本研究发现，在体外诱导BMDM往M2型巨噬细胞分化的过程中，APS虽然可抑制M2型巨噬细胞标志物MR的表达水平，但是可升高其另一标志物CD163的表达水平，同时CD11b和F4/80的表达水平也升高。这些结果可推测APS对M2型巨噬细胞的分化具有双向调控作用，其详细机制和APS对M2型巨噬细胞的其他表面标志物，如CD200R的影响，还需要继续探讨。
3.2 APS对巨噬细胞形态的影响研究表明，中药多糖可以通过影响巨噬细胞的形态而发挥免疫调节功能[21]。猪苓多糖处理后，巨噬细胞的形态发生显著的改变，细胞体积由小变大，细胞形态由长梭形变成椭圆形，细胞贴壁能力减弱[22]。木犀草素可以使RAW264.7极化的M1型巨噬细胞体积变小[20]。APS可以使RAW264.7系分化的M1型巨噬细胞的伪足减少，细胞呈现多角形[19]。本研究发现APS使M2型巨噬细胞由大多呈梭形且有伪足变为大多为类圆形或不规则且少数细胞有伪足。这些结果可表明APS可影响巨噬细胞的形态，但其详细机制需要进一步探讨。
3.3 APS诱导M2型巨噬细胞凋亡植物多糖是天然植物的提取物，具有一定的生物相容性以及较低的毒副作用[23]。植物多糖对细胞的毒性一般取决于多糖的种类、浓度以及作用时间等。研究表明，木犀草素浓度达到一定值时，巨噬细胞收缩缓慢，并出现凋亡小体[20]。硒化当归多糖对腹腔巨噬细胞的安全浓度范围是3.125~250.000 μg/mL [24]。本研究发现160 μg/mL APS仅对M2型巨噬细胞的早期凋亡有上调作用，而320 μg/mL APS对M2型巨噬细胞的早期凋亡和晚期凋亡均有促进作用。另外，在APS改变M2型巨噬细胞形态的研究中也发现APS高浓度(320 μg/mL)组的M2型巨噬细胞数量明显减少。这些结果意味着APS可以诱导M2型巨噬细胞凋亡并呈浓度依赖性，可提示APS的使用需要控制在一定安全浓度范围内，其详细机制将继续探究。
3.4 APS对M2型巨噬细胞功能的影响巨噬细胞活化最显著的特征之一是吞噬活性的增加[25]。巨噬细胞的吞噬作用与多种受体有关，包括MR、Dectin-1以及清道夫受体等[26]。M2型巨噬细胞可以通过增强吞噬作用发挥抗炎功能[27]。MR参与先天免疫应答，能够识别具有共同特征的聚糖，参与病原体的吞噬作用，如HIV的包膜糖蛋白、酵母甘露聚糖、细菌荚膜等[28-29]。MR与多糖结合后，可以增加巨噬细胞的吞噬活性[30]。研究表明，芦荟多糖与MR结合后，增加巨噬细胞的吞噬能力和内吞作用。芦荟多糖可以上调巨噬细胞表面MHC-Ⅱ分子以及IgGFc段受体，从而增强巨噬细胞的抗原呈递能力以及清除抗体-抗原或抗体-肿瘤细胞复合体的能力[31]。研究表明，APS增强了库普弗细胞的中性红吞噬作用，激活了库普弗细胞的免疫功能[4]。APS增强了腹腔巨噬细胞对FITC-大肠杆菌的吞噬作用。本研究结果表明APS可以升高巨噬细胞吞噬微球的能力，这与其它研究证明APS可以升高巨噬细胞吞噬能力的结果相一致[24]。但是有研究表明APS与MR结合后，降低了腹腔巨噬细胞对甘露糖化的牛血清白蛋白的吞噬作用，且呈剂量依赖性，这与APS和MR的结合有关，APS结合了MR与聚糖结合的结构域，从而降低了MR与甘露糖化牛血清白蛋白的结合[32]。考虑到本研究发现APS可以抑制M2型巨噬细胞表达MR，因此可推测APS可抑制M2型巨噬细胞吞噬具有糖基结构物质的能力，但对其吞噬颗粒性物质的能力具有上调作用，其详细机制需要进一步探讨。
M2型巨噬细胞发挥抗炎作用的主要方式之一是通过分泌ARG-1。ARG-1是尿素循环的一种酶，能够降解L-精氨酸，产生L-鸟氨酸和尿素。研究表明，ARG-1消耗L-精氨酸可以抑制T细胞增殖。同时，研究发现产生的L-鸟氨酸能够促进组织愈合[33]。在巨噬细胞中，ARG-1的表达和功能受到多种因素的调节。有研究表明，巨噬细胞的形态会影响ARG-1的分泌。巨噬细胞的伪足伸展越长，ARG-1的分泌水平则越高[34]。本研究发现APS可使M2型巨噬细胞ARG-1表达水平下降，加之APS也可使M2型巨噬细胞的形态大多变为类圆形且伪足变短，因此可推测APS下调M2型巨噬细胞ARG-1的表达与APS影响巨噬细胞的形态相关。由于M2型巨噬细胞能够分泌多种细胞因子，比如白细胞介素10、转化生长因子β等，而本研究只检测了APS对M2型巨噬细胞分泌ARG-1的影响，也没有探究其可能涉及的分子机制，这些都将继续进行相关探究。
3.5 APS下调M2型巨噬细胞STAT6信号通路STAT6是转录因子家族的一员，STAT6通路的信号级联反应开始于细胞因子受体的参与[35]。STAT6通路的激活需要其磷酸化，主要由IL-4和IL-13刺激，IL-4与其受体结合后，STAT6发生磷酸化，磷酸化的STAT6形成二聚体易位进入细胞核内，参与M2型巨噬细胞典型基因的转录，比如MR、ARG-1等[17, 36]。研究表明，白头翁皂苷A3可以抑制IL-4、IL-13激活的巨噬细胞STAT6的磷酸化水平，并且同时下调了MR的表达[37]。木犀草素可以升高STAT6的磷酸化水平，并升高MR以及相关抗炎细胞因子的表达[20]。研究表明姜黄素处理组的RAW264.7细胞中MR、ARG-1的蛋白水平以及STAT6的磷酸化升高，用STAT6的抑制剂来氟米特处理后，MR、ARG-1的mRNA以及蛋白水平显著降低。由此可知，来氟米特可以抑制姜黄素诱导的MR、ARG-1的上调，表明STAT6是MR、ARG-1上游调节因子[38]。这些研究都表明STAT6对MR和ARG-1的表达至关重要。本研究发现APS可降低M2型巨噬细胞STAT6的磷酸化水平。但因为本研究没有通过干预STAT6信号通路来确认APS是否通过调控STAT6来影响M2型巨噬细胞的分化和功能，所以只能推测APS抑制M2型巨噬细胞MR的表达，可能与其影响STAT6信号通路相关，其确切机制将继续探讨。
综上所述，APS对M2型巨噬细胞的分化和功能均具有双向调控作用。即一方面，APS可升高M2型巨噬细胞CD163的表达，但抑制MR的表达；另一方面，APS可升高M2型巨噬细胞吞噬微球的能力，但又能改变其形态，降低其ARG-1的表达，并在高浓度时诱导其凋亡。这可能与APS可下调STAT6信号通路相关。这些结果为APS的免疫调节功能提供了新的机制，可为临床应用APS治疗和预防疾病提供新的理论依据。
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