表1(Table 1)
神经病理性疼痛(neuropathic pain，NeP)是感觉神经结构或功能病变引起的常见慢性疼痛性疾病，全球近1/10的人口受其影响[1]。星形胶质细胞是中枢神经系统内重要的支持细胞，既往研究表明其功能的改变与慢性疼痛的产生和持续密切相关[2-3]。在稳态条件下，星形胶质细胞为神经元提供结构和营养支持，并通过释放神经递质或调质对疼痛信号的产生和传导进行调节，如产生腺苷[4]、Ⅰ型干扰素(Interferon-I，IFN-Ι)[5]等。与此同时，功能异常甚至凋亡的星形胶质细胞可能对NeP的产生起到重要的推动作用，其一方面产生伤害性递质直接损害神经元，另一方面也因对伤害性信号的缓冲作用下降而失去对神经元的保护[6]。因此，了解外界伤害性刺激对星形胶质细胞损伤的作用和机制对于研究NeP的发病机理有重要意义。
近期研究发现，游离的线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)的重要来源[7-8]，其通过介导炎症反应和细胞极化等调节细胞功能变化[9-11]，是一种存在于神经元和免疫细胞之间的新兴信使，参与帕金森[12]、脑损伤[13]等多种疾病的进展。本课题组前期研究发现，在带状疱疹后遗神经痛患者血清中出现大量神经细胞来源的游离mtDNA，推测其可能在NeP的形成和维持中发挥重要作用。也有研究表明[14]mtDNA可引起M1型小胶质细胞的激活，但其对星形胶质细胞的影响以及是否通过此途径促进NeP的产生尚不得而知。
钙离子(calcium ion, Ca2+)平衡对于维持神经环境稳态至关重要[15]。细胞内的Ca2+可通过内质网-线粒体连接复合物，即线粒体相关膜(matochondria-associated membrane，MAMs)向线粒体内运输形成钙超载[16]。据研究报道，线粒体钙超载或MAMs连接增强，如GRP75蛋白(glucose-related protein 75，GRP75)表达上调，可破坏星形胶质细胞氧化还原平衡[17-18]，诱导细胞死亡。目前为止，mtDNA是否可通过影响Ca2+水平改变星形胶质细胞功能状态尚不清楚。本研究拟通过观察NeP小鼠痛觉行为学和脊髓中mtDNA含量的变化，初步了解NeP形成与mtDNA之间的相关性，并在体外实验中观察受损神经细胞来源的mtDNA诱导U87细胞凋亡、Ca2+平衡以及GRP75蛋白表达的变化，为探索mtDNA通过星形胶质细胞促进NeP形成的机制打下基础。
1 材料与方法 1.1 实验试剂C57BL/6雄性小鼠，6~8周龄，体质量20~30 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。人脑星形胶质母细胞瘤细胞(human glioblastoma cell line U-87MG，U87)购自厦门逸漠生物科技有限公司。基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司，货号：DP304)；2× Super SYBR Green qPCR Master Mix(上海奕杉生物科技有限公司，货号：ES-QP002)；线粒体DNA分离试剂盒(英国Abcam公司，货号：ab65321)；CCK-8试剂盒(北京兰杰柯科技有限公司，货号：BS350B)；IP3R、VDAC1、β-actin、Tubulin(成都正能生物技术有限责任公司，货号：R381962、R26067、200068-8F10、200608)；GRP75(美国Cell Signaling Technology公司，货号：3593T)；ER-Tracker Green试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，货号：C1042S)；MitoTrackerTM Red CMXRos-Special Package(美国赛默飞公司，货号：M7512)；JC-1检测试剂盒、活性氧测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：M8650、CA1410)；Annexin-FITC试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号：A211-02)；Rhod-2，AM，钙离子荧光探针(上海翌圣生物科技股份有限公司，货号：40776ES50)；MKT-077、BAPTA-AM(美国MedChem Express公司，货号：HY-15096、HY-100545)。
1.2 NeP模型的建立及分组所有动物实验程序均获陆军军医大学实验动物福利和伦理委员会批准(伦理批号：AMUWEC20187019)。小鼠坐骨神经慢性缩窄(chronic constriction injury，CCI)制作NeP模型按文献描述的方法进行[19]，小鼠吸入1%~3%异氟醚麻醉后，手术区域皮肤消毒，沿右侧大腿剪开中后部皮肤，顺肌纹的方向分离股二头肌，暴露坐骨神经，在距神经分叉前的主干部位约5 mm处用4.0铬制羊肠线结扎3道，每道距离1 mm，生理盐水冲洗创面，逐层缝合皮肤，放回恒温箱待苏醒。术后观察小鼠行为，如有右后肢瘫痪、咬噬、死亡等情况剔除出组。
20只小鼠按随机数字表法分为4组，每组5只：假手术组(暴露神经而未结扎的小鼠)、CCI-7天组、CCI-14天组、CCI-21天组。在CCI手术当天及术后第7、14、21天测量小鼠机械性刺激缩足阈值。第21天完成测试后，快速处死小鼠，分离腰3-5脊髓提取DNA，检测各组小鼠脊髓中mtDNA的相对含量。
1.3 实验方法 1.3.1 机械性刺激缩足阈值测定按文献描述方法进行小鼠机械性缩足阈值(paw withdrawal mechanical threshold，PWMT)测定[20]。实验小鼠静止于测量洞板上15 min后开始测量，采用不同硬度的Von-frey纤维丝，垂直刺激其右后爪中部，若小鼠后爪突然撤离记为阳性反应，若本次无反应则使用邻近高一规格纤维丝刺激，当首次出现与前一次不同反应时记为第二次有效测量，累计6次测量结果，根据文献公式计算PWMT。
1.3.2 实时荧光定量PCR法(quantitative real-time PCR, qPCR)检测小鼠脊髓mtDNA相对含量采用DNA提取试剂盒提取各组基因组DNA，测定DNA浓度和纯度，20 μL体系进行qPCR反应，SYBR Green 10 μL、基因组DNA 100 ng、上下游引物各0.4 μL，加入ddH2O至20 μL，每个样本设置3个复孔。以18s核糖体RNA(18s ribosomal RNA，18s rRNA)为内参，细胞色素c氧化酶I(cytochrome c oxidase I，CO1)和NADH脱氢酶亚基1(nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase 1，ND1)作为检测mtDNA含量的目的基因[10]，2-△△Ct计算各组mtDNA的相对含量，引物序列见表 1。
| 基因 | 引物序列 |
| CO1 | 上游：GCATCTGTTCTGATTCTTTGGGCAC |
| 下游：GTGGTGGGCTCATACAATAAAGCC | |
| ND1 | 上游：CGGCCCATTCGCGTTATTC |
| 下游：GATCGTAACGGAAGCGTGGA | |
| 18s rRNA | 上游：CCTGAGAAACGGCTACCACATC |
| 下游：CACCAGACTTGCCCTCCA |
1.3.3 细胞培养与处理
U87和SH-SY5Y细胞培养在含10% FBS及1%双抗的DMEM培养基中，于5% CO2、37 ℃的恒温细胞培养箱中孵育。当细胞密度大于80%时，进行传代或处理。mtDNA处理U87细胞分5组：对照组、mtDNA组、mtDNA组+GRP75抑制剂(MKT-077 1 μg/mL)组、mtDNA+钙螯合剂(BAPTA-AM 10 μmol/L)组、mtDNA+ MKT-077+BAPTA-AM组；其中，mtDNA浓度为0 ng/μL作为对照组，mtDNA处理前2 h分别予以MKT-077 1 μg/mL、BAPTA-AM 10 μmol/L预处理。
1.3.4 mtDNA提取及处理根据线粒体DNA分离试剂盒进行细胞mtDNA的提取：过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)300 μmol/L处理SH-SY5Y细胞24 h (根据预实验结果进行)。收集细胞，在1×细胞质提取缓冲液中冰上孵育10 min，4 ℃ 1 200×g离心10 min，转移上清液，4 ℃ 10 000×g再次离心30 min。去除上清液，将沉淀重悬于1×胞质提取缓冲液中，4 ℃ 10 000×g离心30 min。将沉淀(分离的线粒体)重悬于线粒体裂解缓冲液中，冰上裂解10 min，加入酶混合物于50 ℃孵育60 min。之后，将样品离心并用Tris-EDTA(TE)缓冲液重悬颗粒，获得mtDNA。测定mtDNA浓度和纯度，使用DMEM培养基将其稀释至0.01、0.05、0.1、1 ng/μL进行U87细胞活力检测[21]。
1.3.5 CCK-8细胞活力检测U87细胞种于96孔板，8×103个细胞/孔。PBS清洗细胞，每孔加入100 μL基础培养基与10 μL CCK-8混合溶液，培养箱内孵育1 h。酶标仪测定在450 nm处的光密度值，根据建立的标准曲线进行细胞活力检测。
1.3.6 Western blot检测细胞汇合度＞80%时，胰酶收集细胞，冰上制备蛋白样品，BCA法测定蛋白浓度。使用SDS-PAGE凝胶电泳，低温下将蛋白印迹转移至PVDF膜，TBST稀释的5%脱脂牛奶于室温封闭2 h，一抗IP3R(1∶1 000)、GRP75(1∶2 000)、VDAC1(1∶2 000)、β-actin(1∶5 000)、tubulin(1∶5 000)4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次5 min，室温孵育山羊抗小鼠、兔HRP偶联二抗(1∶10 000)1 h。配制ECL化学发光液，凝胶成像仪曝光。
1.3.7 内质网-线粒体染色U87细胞接种于共聚焦皿中，Hanks平衡盐溶液洗涤细胞，加入37 ℃温育的ER-Tracker Green染色工作液(1∶3 000)，与培养箱中孵育15 min，随后去除ER染色工作液，洗涤细胞后加入提前配制的MitoTrackerTM Red染色工作液(100 nmol/L)，室温避光孵育15 min。洗涤细胞，激光共聚焦显微镜下观察拍照。
1.3.8 线粒体膜电位检测PBS清洗细胞，加入JC-1染色工作液，细胞培养箱中37 ℃孵育20 min。去除染色液，1× JC-1染色缓冲液洗涤细胞，激光共聚焦显微镜下拍照。
1.3.9 活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测去除U87细胞培养液，加入无血清培养液稀释的DCFH-DA(终浓度10 μmol/L)，细胞培养箱中孵育20 min，随后采用无血清培养液洗涤细胞，共聚焦显微镜下拍照。
1.3.10 线粒体Ca2+检测U87细胞中加入2 μmol/L Rhod-2/AM工作液，37 ℃孵育30 min，洗涤细胞，使用不含探针缓冲液覆盖细胞，37 ℃孵育20 min。该探针可特别定位在线粒体，共聚焦显微镜进行线粒体Ca2+检测。
1.3.11 PI染色使用Annexin-FITC试剂盒进行评估，根据文献中描述的方法进行[22]，细胞种于24孔板中，加入195 μL结合液后，滴加10 μL PI Staining溶液并混匀，室温避光孵育10 min，buffer洗涤细胞后，加入Hoechst覆盖细胞。1 h之内完成细胞检测。
1.4 统计学分析应用Image J软件对免疫荧光图像和Western blot检测的蛋白质条带进行定量，采用GraphPad Prism 9.0软件进行作图及统计分析，数据以x±s表示，实验至少进行3次；多组间比较采用单因素方差分析，数据不符合正态性检验时用Kruskal-Wallis非参数检验；对于不同时期假手术组与CCI组小鼠PWMT的测量，采用非配对t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 CCI小鼠脊髓中mtDNA相对含量增加观察CCI术后小鼠脊髓中mtDNA相对含量的变化。首先进行小鼠行为学检测，结果显示，CCI术后第7天始小鼠PWMT降低(P<0.05，图 1A)，此后稳定在低值，表明CCI造模成功。qPCR检测小鼠脊髓中mtDNA相对含量，结果显示，与假手术组比较，CCI-21天组小鼠脊髓中mtDNA相对含量增加(P<0.05，图 1B)。
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| A：各组小鼠机械性刺激缩足阈值测定；B：小鼠脊髓中mtDNA相对含量表达(COI); C: 小鼠脊髓中mDNA相对含量表达(ND1)；a：P<0.05，与假手术组比较；b：P<0.05，与CCI-14天组比较 图 1 小鼠脊髓中mtDNA相对含量(n=3，x±s) |
2.2 受损神经来源的mtDNA对U87细胞活力的影响
采用CCK-8检测细胞外液中不同浓度梯度mtDNA对U87细胞活力的影响。结果显示，相较于对照组，浓度<0.1 ng/μL的细胞外mtDNA对U87细胞活力影响不显著；而较高浓度(1 ng/μL)的细胞外mtDNA显著抑制了细胞活力(P<0.01，图 2A)，细胞活力降低约50%[(1.02±0.13) vs (0.52±0.12)]，显微镜下可发现在含1 ng/μL mtDNA细胞培养基中生长的细胞表现出收缩、突触消失变化(图 2B)。因此，本实验选择浓度范围在0.1~1.0 ng/μL (0.1、0.2、0.3、0.5 ng/μL)的mtDNA进行后续研究。
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| A：CCK-8检测不同浓度梯度mtDNA对细胞活力的影响 a：P<0.01，与对照组比较，b：P<0.01，与0.1 ng/μL组比较；B：通过荧光显微镜观察U87细胞的形态变化 图 2 受损神经来源的mtDNA对U87细胞活力的影响(n=5，x±s) |
2.3 mtDNA对U87细胞内质网-线粒体偶联的影响
0.1、0.2、0.3、0.5 ng/μL mtDNA处理U87细胞12 h，Western blot检测IP3R、GRP75、VDAC1反映内质网-线粒体连接复合物蛋白的表达量变化。内质网-线粒体免疫荧光共染观察内质网-线粒体偶联情况。结果显示：与对照组比较，细胞外0.2 ng/μL mtDNA可上调GRP75蛋白的表达水平(P<0.05，图 3A、B)并且细胞中内质网-线粒体共定位增强(P<0.05，图 3C、D)。表明0.2 ng/μL浓度的mtDNA可致使内质网-线粒体偶联增强。
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a：P<0.05，b：P<0.01，与对照组比较 A、B：Western blot检测不同浓度细胞外mtDNA对IP3R、GRP75、VDAC1蛋白相对表达的影响；C、D：免疫荧光共染分析内质网-线粒体共定位情况 图 3 游离mtDNA对IP3R-GRP75-VDAC1表达及内质网-线粒体偶联的影响(n=6，x±s) |
2.4 mtDNA对U87细胞线粒体Ca2+及线粒体功能的影响
采用钙离子荧光探针(Rhod-2)显示线粒体Ca2+水平，活性氧检测线粒体氧化应激情况，JC-1检测线粒体膜电位的改变。结果显示，与对照组相比，0.2 ng/μL mtDNA增加线粒体Ca2+水平[(109.4±62.61) vs (540.3±150.3)，P<0.05，图 4A、B]，并引起ROS释放增多(P<0.05，图 4C、D)，线粒体膜电位异常(P<0.01，图 4C、E)；而GRP75抑制剂(MKT-077)可显著抑制游离mtDNA诱导的上述线粒体情况变化，且干预效果与使用钙螯合剂(BAPTA-AM)效果相似(P<0.01，图 4)。提示受损神经来源的mtDNA可增强U87细胞线粒体Ca2+负荷，并造成线粒体氧化应激损伤和功能障碍。
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1：对照组；2：0.2 ng/μL mtDNA组；3：mtDNA+ GRP75抑制剂(MKT-077 1 μg/mL)组；4：mtDNA+钙螯合剂(BAPTA-AM 10 μmol/L)组；5：mtDNA+ MKT-077+ BAPTA-AM组 a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与0.2 ng/μL mtDNA组比较 A、B：钙离子荧光探针显示MKT-077或/和BAPTA-AM对线粒体Ca2+水平的影响；C：ROS、JC-1荧光染色检测ROS释放及线粒体膜电位的影响；D：半定量分析ROS平均荧光强度线；E：半定量分析粒体膜电位变化 图 4 MKT-077或/和BAPTA-AM抑制对线粒体Ca2+水平及线粒体功能的影响(n=4，x±s) |
2.5 抑制内质网-线粒体偶联对mtDNA诱导的U87细胞凋亡的影响
通过PI染色检测U87细胞凋亡。结果显示，与对照组比较，细胞外0.2 ng/μL mtDNA增加了U87细胞凋亡(P<0.05，图 5)，通过MKT-077或/和BAPTA-AM抑制GRP75表达或/和干扰线粒体Ca2+流动后，U87细胞凋亡有所减轻[mtDNA组vs mtDNA+MKT-077组：(18.39±2.09) vs (13.22±1.42)，P<0.05；mtDNA组vs mtDNA+BAPTA-AM组：(18.39±2.09) vs (12.09± 1.53)，P<0.05；mtDNA组vs mtDNA+ MKT-077+ BAPTA-AM组：(18.39±2.09) vs (11.65±2.09)，P<0.05，图 5]，表明mtDNA可能通过增加内质网-线粒体连接，加剧线粒体钙超载，诱导U87细胞凋亡。
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1：对照组；2：0.2 ng/μL mtDNA组；3：mtDNA+ GRP75抑制剂(MKT-077 1 μg/mL)组；4：mtDNA+钙螯合剂(BAPTA-AM 10 μmol/L)组；5：mtDNA+ MKT-077+ BAPTA-AM组 A：PI染色显示MKT-077或/和BAPTA-AM对U87细胞凋亡的影响；B：半定量分析U87细胞凋亡情况 a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与0.2 ng/μL mtDNA组比较 图 5 MKT-077或/和BAPTA-AM抑制对线粒体Ca2+水平及线粒体功能的影响(n=3，x±s) |
3 讨论 3.1 mtDNA被证实参与了NeP的发生
调查统计，在一般人群中，NeP的患病率接近10%[23]，但因其发病机制复杂，在临床治疗上一直缺乏有效的方法[24]。寻找引起NeP发生及发展的关键伤害性递质一直是神经科学研究的热点和难点。存在于线粒体内的mtDNA具有遗传学特性，但是释放到线粒体甚至细胞外的mtDNA被认为是一种先天免疫激动剂，参与多种神经系统疾病的炎症因子激活和细胞损伤[25]。本课题组前期研究发现[26]，NeP小鼠外周受损神经和脊髓内出现线粒体动态平衡失调、线粒体轴突转运增加的现象，在此过程中伴随有细胞外游离mtDNA的产生和转移。有研究证实，离开细胞的mtDNA可以在细胞间质内被DNA酶分解、通过外泌体转运进入周边细胞也可以通过体液循环转移到全身各处[27]。在本实验中，CCI制作的NeP小鼠行为学结果表明，CCI术后小鼠的PWMT降低，而术后21天时检测到小鼠脊髓中mtDNA含量升高。另有研究发现，在视神经脊髓炎患者的脑脊液中，mtDNA水平同样升高 [28]。在含有mtDNA的培养环境中生长的神经胶质细胞，可产生多种炎症因子，如IL-1β、TNF-α等[29]，而这些炎症因子均在NeP的形成中具有重要调控作用[30]。由此可见，CCI小鼠疼痛的发展可能与外周神经损伤后脊髓部位升高的mtDNA有关。
3.2 mtDNA可影响U87细胞活力状态在NeP中，功能异常的星形胶质细胞可通过多种途径促进疼痛产生和维持，如释放炎症因子、伤害性神经递质等[6]。为研究外源性mtDNA对脊髓部位星形胶质细胞的影响，本研究选择H2O2处理的SH-SY5Y细胞模拟NeP中受损的神经元，从这些细胞中提取的mtDNA，根据实验浓度制备U87细胞培养液，以模拟含有丰富神经源性mtDNA的细胞外环境，观察U87细胞的功能状态变化。结果显示，当细胞外mtDNA浓度在0.1~1.0 ng/μL U87时细胞活力明显下降，这表明细胞生存环境中异常增多的mtDNA可能影响细胞活力。目前的研究尚未能完全明确来源于损伤细胞的mtDNA与正常细胞内的mtDNA的具体区别，有研究认为受损细胞来源的mtDNA可以在ROS作用下产生的氧化型mtDNA(oxidized mitochondrial DNA，Ox-mtDNA)，Ox-mtDNA以鸟嘌呤碱基第8位碳原子的氧化为主，氧化产物8-羟基脱氧鸟苷(8-Hydroxy-2'-deoxyguanosine, 8-OHdG)具有强烈的致炎作用并影响受体细胞功能，其通过激活炎症小体NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)将无活性的pro-caspase-1加工成有活性的Caspase-1，进一步将pro-IL-1β裂解为IL-1β并引起细胞mPTP离子通道开放、钾外流和多种炎症信号(如NF-κB、cGAS-STING)激活，严重者导致细胞过早死亡[31]。受检测条件限制，本研究未能明确CCI小鼠脊髓内增多的mtDNA是否为Ox-mtDNA，但可以明确该类mtDNA通过干涉星形胶质细胞的功能状态参与了NeP的形成，这对于神经-胶质交互作用和星形胶质细胞的健康有了新的认识[32]。
3.3 mtDNA诱使U87细胞凋亡的潜在机制推理MAMs具有参与钙平衡和线粒体自噬等生物学功能[33]。疾病状态下，内质网和线粒体之间的双向通讯甚至可以传递死亡信号，调控细胞死亡[34]。IP3R-GRP75-VDAC1复合物是MAMs中调节线粒体Ca2+的关键途径。通过增强MAMs中的蛋白表达，或促进Ca2+流向线粒体，可触发线粒体细胞色素C的释放、形态结构改变，继而诱使细胞凋亡[35]。此外，干扰MAMs的连接可以影响伤害感受器兴奋性，控制疼痛信号的传导，这对于NeP的发展非常重要[36]。本研究中，Western blot及免疫荧光结果提示，mtDNA可上调细胞中GRP75通道蛋白的表达，增加MAMs偶联，这种现象可能是内质网与线粒体之间的信息交流增强引起的。对照组与mtDNA组的钙离子荧光检测对比可见，mtDNA组的线粒体Ca2+水平升高，且U87细胞中ROS产生增多，同时也观察到mtDNA组线粒体膜电位下降，这可能是因线粒体内Ca2+超载，引发了线粒体功能障碍所致。采用MKT-077阻断MAMs连接可以有效地缓解了mtDNA诱导的线粒体膜电位衰退、线粒体Ca2+负荷等表现，证明mtDNA诱使线粒体功能障碍是通过GRP75-Ca2+的介导进行的，而BAPTA-AM干扰Ca2+流动对U87线粒体功能的改善结果与MKT-077相似，也充分表明mtDNA是通过调节线粒体内Ca2+负荷而对线粒体产生作用。上述结果提示，异常增多的mtDNA促使U87细胞内MAMs在内质网和线粒体之间转运增加从而引起后者Ca2+超载，这可能是其诱导U87细胞凋亡和CCI脊髓内炎症反应的重要原因之一。
综上所述，本研究初步证明了外周神经受损后可以引起脊髓部位mtDNA浓度增加，在体外受损神经来源的mtDNA可通过调控U87细胞中GRP75蛋白的表达，干扰线粒体Ca2+水平、加剧线粒体氧化应激，以诱导U87细胞凋亡，但其在NeP形成过程中是否具有同样效应尚需进一步探讨。
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