2. 400038 重庆，陆军军医大学(第三军医大学)：极端环境医学教育部重点实验室
2. Key Laboratory of Extreme Environmental Medicine of Ministry of Education, Faculty of Military Preventive Medicine, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400038, China
热射病(heat stroke)是一种危及生命的疾病，临床诊断为严重的体温升高，伴有中枢神经系统功能障碍[1]。根据引发热射病原因及是否伴随劳力性因素，分为经典型热射病(classic heat stroke，CHS)和劳力型热射病(exertional heat stroke，EHS)[1-3]。两者的潜在机制不同，CHS是由于暴露在热环境且散热机制差，因此，多发于老年人和体温调节尚未发育完全的儿童。而EHS则与体力活动相关，是由于代谢热量的过度产生超过了生理散热机制，因此运动员、工人、消防员等发病率较高[4]。虽然EHS和CHS患者均可出现不同程度的器官功能障碍，但EHS患者较CHS患者表现出更多器官、系统功能障碍，预后也较CHS差[5]，因此研究两者发病机制及器官损害的差异是必要的。
在竞技体育中，EHS被认为是运动员非创伤性死亡的第二大原因[6]，2009-2018年日本高中生运动相关死亡的流行病学调查显示，EHS致死高达22.2%，仅次于心脏相关死亡及创伤性死亡[7]。在美国军队中，1998-2017年临床诊断的EHS发病率为(2.7±0.5)/10 000[8]。然而，该项流行病学调查基于准确的临床诊断，EHS导致的死亡率估计在真实世界要高得多[4]。虽然EHS是公认最古老的医学疾病之一，但目前仍缺乏一个普遍接受的定义，EHS的主要特征之一是在运动过程中骨骼肌收缩产生的代谢热不能迅速消散，骨骼肌收缩只有20%的效率(即能量用于从ADP重新合成ATP)，因此80%的能量以热量的形式释放在体内，在失代偿条件下，高心排血量无法维持，如得不到及时救治，最终发展为多器官功能衰竭甚至死亡[9-10]。高温复合运动的病理生理反应主要表现为细胞热休克、缺血和心血管反应，其中心血管反应包括内脏血管收缩，皮肤血管扩张，导致器官(肠、肾、肝、脾等)低灌注，缺血后产生活性氧[11]。
心血管系统是热损伤的重要靶点之一[12]。在热射病的快速进展过程中，心肌损伤会增加死亡的风险[13]。刘志峰等[14]对2008-2019年劳力型热射病致心肌损伤的患者进行回顾性研究，结果显示53.7%的热射病患者合并心肌损伤，与非心肌损伤的热射病患者相比，心肌损伤的热射病患者更为严重，心肌损伤组的90 d死亡率显著增高。还有研究报道，热射病能够对心脏造成急性永久性损伤，并产生慢性及远期影响。热射病患者心血管疾病的发生率远远高于其他热致相关疾病患者及对照组患者[15-16]。EHS小鼠中发生的迟发性代谢紊乱与动脉粥样硬化的形成和心力衰竭的发展有关[17-18]。热射病除了造成心脏急性损伤，还对远期预后存在深远影响。但目前对CHS和EHS发生发展过程中，心脏功能的变化规律及对应的病理生理和分子机制仍知之甚少。因此，我们对比研究EHS和CHS大鼠急性心脏损伤的特点，探索两种热射病动物模型心肌损伤的差异，为热射病心肌损伤的临床治疗提供可能的实验室依据。
1 材料与方法 1.1 动物所有SPF级雄性SD大鼠，体质量220~250 g，均购自陆军军医大学实验动物中心，生产许可证号: SCXK(渝)2022-0011，使用许可证号: SYXK(渝)2022-0018。购入后正常饮食饮水，适应性饲养1周后进行后续实验。实验动物相关方案通过动物伦理学委员会批准。
实验动物分组80只SD大鼠按随机数表法随机分为对照组(CON，n=10)、运动对照组(EXC，n=10)、经典热射病组(CHS，n=30)和劳力型热射病组(EHS，n=30)。
1.2 主要仪器与设备高温复合多因素环境模拟舱(烟台豪特氧业设备有限公司，中国)，5道小动物跑台(Harvard Apparatus，美国)，Visual sonic VEVO 2100超高频高分辨率小动物超声成像仪(加拿大Visual Sonics公司)，四道热电偶直肠温度测量仪(台湾群特)。
1.3 方法 1.3.1 核心体温测量将涂有润滑油的动物四道肛温仪电偶探头插入大鼠肛门，电偶探头插入深度3~5 cm，间断测量大鼠直肠温度(Tr)，以Tr代表核心体温(Tc)。
1.3.2 适应性训练实验开始前所有大鼠均接受模拟热气候动物舱适应性训练。大鼠连同饲养笼置于环境模拟舱中，环境温度25 ℃，湿度(50±5)%，1次/d，每次8 h，连续1周，期间自由进食、水。适应性运动训练：将大鼠置于跑台，跑台放置于环境模拟舱中，设置跑台速度为12 m/min，坡度0°，运动时间为10 min，1次/d，连续5 d，保证所有运动组动物正确使用跑台，运动期间禁食水。适应性训练结束后洗脱2 d，避免运动训练对后续实验的干扰，洗脱期间仍将动物置于多气候模拟舱中适应环境。
1.3.3 热射病动物模型构建动物模型构建前30 min，实验动物禁食水，监测体重、直肠温度。待直肠温度(初始Tr，Tr, ini)稳定在37.0 ℃以下，多气候模拟舱稳定在目标环境条件后将动物置于舱内，作为实验开始起点(0 min)。热暴露组(EHS组和CHS组)大鼠置于环境温度(39.0±0.5)℃，相对湿度(50±5)%。EHS组大鼠给予强迫跑台运动，强迫方式为电击，电击强度0.8 mA，跑台为恒定速度12 m/min，坡度为0°，每运动8 min休息2 min，以测量直肠温度[19]。当Tr接近最大Tr(Tr, max=42.3 ℃)时，间隔1~3 min测量直肠温度。CHS组实验动物不接受强迫运动。热暴露组达到42.3 ℃或出现瘫倒(掐尾反射消失)，作为热射病发生标志并终止实验。常温组(对照组和EXC组)置于环境温度25±0.5 ℃，湿度(50±5)%条件下。EXC组运动及电击强度与EHS组相同，动物力竭瘫倒时(掐尾反射消失)终止实验。对照组不接受强迫运动。用摄像机连续监测大鼠行为。实验期间，所有实验动物禁食、水。实验终止后，恢复自由食、水，置于原饲养环境中复温。
1.3.4 热暴露负荷面积计算“热暴露负荷面积”被用作“热应激”或“热剂量”的估计值，根据LEON等人[20]的定义进行计算。从数学上讲，约等于温度变化曲线下的面积。时长的计算，系热暴露开始(0 min)至热射病发生(Tr=42.3 ℃或出现瘫倒)所持续的时间。升温速率(℃/min)=[(Tr, max-Tr, ini)/热暴露时间]×100%。热暴露负荷(℃.min)=Tr≥39.5 ℃的热暴露时间×(Tr, max-39.5 ℃)，选择39.5 ℃作为截断值，是由于环境温度保持在(39.0±0.5) ℃，当大鼠Tr≥39.5 ℃时，无法单独通过辐射排出多余热量[21]。
1.3.5 超声心动图仪检测大鼠心功能指标动物模型构建后1~3 h，采用加拿大VisualSonics公司的VeVo2100型高分辨小动物超声仪检测各组大鼠左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)及左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)。LVEF指每搏输出量占心室舒张末期容积量的百分比，正常值为50%~70%，是判断心力衰竭类型的重要指征之一。LVFS是指左心室舒张末期与收缩末期的内径差, 再比上左心室的舒张末期内径所得的百分比数值, 正常范围值为25%~45%，通常在临床上需结合LVEF等指标来综合判断心脏的收缩功能[22-23]。因此，本研究以LVEF < 50%作为诊断左室收缩功能异常的标准。
超声心动图由陆军军医大学第一附属医院超声科具有小动物超声操作经验的实验技师实施检测。各组检测大鼠吸入异氟醚麻醉后，仔细脱去大鼠胸前毛发，充分暴露胸骨和左胸廓位置，然后行M型超声心动图检测。
1.3.6 样品的采集与制备1%戊巴比妥钠溶液麻醉大鼠，并将大鼠仰卧位固定于手术台上，于腹主动脉采血。立即在4 ℃下，3 000转/min离心20 min，取上层血清待测。采血后打开胸腔，取出心脏组织，在冰上除去心房组织，留取左心室或心尖部组织，生理盐水冲洗，立即浸泡于4%多聚甲醛中固定72 h，进行常规脱水、透明、石蜡包埋等，切成4 μm的石蜡切片备用。每组剩余心肌组织保存于-80 ℃备用。
1.3.7 血清心肌酶学检测基于采集的血清，采用微纳芯生化试剂盒检测血清AST、LDH、CK、CK-MB水平。
1.3.8 苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin，HE)观察大鼠心肌组织病理变化取左心室组织石蜡切片，二甲苯脱蜡后进行常规HE染色。乙醇脱水、二甲苯透明处理后用中性树脂封片，置于显微镜下观察心肌组织的病理变化。
1.3.9 TUNEL染色观察大鼠心肌细胞凋亡情况取石蜡切片采用二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水后，用蛋白酶K处理。按照TUNEL试剂盒说明书进行后续操作。二甲苯透明处理后用中性树脂封片后在显微镜下观察细胞凋亡情况。视野中红色颗粒即为凋亡细胞。
1.3.10 蛋白免疫印迹法(Western blot, WB)检测心肌组织中内质网应激及线粒体凋亡相关蛋白表达水平心肌组织采用心肌蛋白提取试剂盒提取蛋白上清液。采用BCA试剂盒检测蛋白浓度。蛋白变性后采用SDS-PAGE凝胶电泳分离目的蛋白。将蛋白转移至PVDF膜上，采用抗体结合后，经ECL发光试剂显色。
1.4 统计学分析本研究的实验数据均采用SPSS 22.0版软件统计分析。其中符合正态分布的计量资料以x±s的形式表示，多组计量资料之间的比较采用ANOVA方差分析，两两比较采用LSD-t检验。两组间比较采用独立样本t检验。24 h存活率分析采用Kaplan-Meier法，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 两种热射病模型中体温调节反应及总体表现各组实验动物热应激反应生理指标如表 1所示。所有实验动物实验前初始体重无统计学差异，将各组动物放置(25.0±0.5)℃，相对湿度(50±5)%，待动物初始基础体温稳定在37 ℃以下(表 1)方可开始运动和(或)热暴露实验，经过跑台强迫运动和(或)热暴露实验后。EXC组运动表现(运动距离 & 运动时间)显著优于EHS组(P＜0.01)。CHS组到达Tr, max(或出现神经症状)的时间显著长于EHS组(P＜0.01)。EXC组、CHS组、EHS组体重丢失总量均高于对照组(P＜0.01)。CHS组体重丢失率高于EXC组及EHS组(P＜0.01)，EXC组高于EHS组，但两者无统计学差异(P＞0.05)。值得注意的是，EHS组的热暴露时间及运动时间远远低于CHS组和EXC组，因此本研究计算了各组体重丢失速率(g/min)，即单位时间内的体重丢失。结果显示EHS组的体重丢失速率远远高于CHS组(P＜0.01)和EXC组(P＜0.01)。提示高温复合运动使受热动物在短时间内大量脱水，因此推断高温复合运动对有效循环血量的急性影响，远远大于静息状态下受热及常温运动。
| 热反应指标 | 对照组 | EXC组 | CHS组 | EHS组 |
| 初始体温(℃) | 36.39±0.36 | 36.54±0.28 | 36.65±0.12 | 36.56±0.17 |
| 最高体温(℃) | 36.52±0.43cfh | 39.03±0.29afh | 42.36±0.25bd | 42.48±0.23bd |
| 脱水率(%) | 3.06±0.51dfh | 8.09±2.42bf | 14.09±1.45bdh | 6.83±2.63bf |
| 脱水速率(g/h) | 1.18±0.24dfh | 4.99±0.90ah | 5.54±0.87bh | 13.19±4.64bdf |
| 热暴露时间(min) | - | - | 359.69±32.99h | 81.58±36.34f |
| 运动时间(min) | - | 237.88±78.47h | - | 45.90±14.04d |
| 运动距离(m) | - | 3277.12±549.27h | - | 526.67±175.85d |
| a: P＜0.05，b: P＜0.01, 与对照组比较；c: P＜0.05，d: P＜0.01，与EXC比较；e: P＜0.05，f: P＜0.01, 与CHS比较；g: P＜0.05，h: P＜0.01与EHS比较 | ||||
实验期间各组体温变化曲线如图 1所示。结果显示，CHS组较短时间内Tr即上升到较高温度，随即稳定在39℃-40.0℃这一平台期，持续数小时，最后于Tr, max附近，核心体温迅速上升并出现神经症状，Tr, max几乎于神经症状出现的数分钟后达到。EHS组的核心体温动态时相变化曲线趋势与CHS类似，即运动早期核心体温迅速上升，随即稳定在平台期，在Tr, max附近再次迅速上升，实验动物在瘫倒并停止自主运动时几乎已达到Tr, max。与CHS不同的是，EHS组在热暴露早期，迅速升至41.0 ℃左右并稳定在这一水平，平台期较CHS明显缩短(图 1A)。对此可能的解释是，高温复合运动后，大量代谢热的产生远远超出了大鼠机体散热代偿能力，导致EHS组快速达到Tr, max。相比热暴露组(CHS和EHS)，对照组体温在正常范围内波动，平均Tr, max=(36.53±0.43) ℃(表 1)。EXC组的变化幅度在2.5 ℃内波动，平均Tr, max=(39.03± 0.29) ℃。造模成功后，热暴露组在放置室温后，恢复期体温出现不同的时相变化：①体温迅速降至低体温范围(Tr < 35.0 ℃)，其中部分动物体温呈双相变化，表现为低体温期持续1~3 h后恢复至基线水平；②部分体温持续处于低体温期，未出现反弹，直至死亡(图 1A)。比较热暴露组热负荷面积，结果表明EHS组大鼠热暴露负荷面积显著低于CHS组大鼠(P < 0.05，图 1B)。各组24 h存活率显示对照组和EXC组全部存活，CHS组存活率52%，EHS存活率36%，两者差异具有统计学意义(P < 0.05，图 1C)。
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| A: 动物升温曲线; B: 动物热暴露负荷面积; C: 动物存活率 图 1 各组动物中体温变化曲线、热暴露负荷面积及存活率 |
2.2 超声心动图评估心脏收缩功能结果
各组动物(n=9)行超声心动图检测，入选标准为收缩功能正常(即LVEF>50%)。热射病发生后1~3 h，再次评估心脏收缩功能，如前所述，判定左室收缩功能异常的标准为LVEF < 50%。
表 2所示各组造模成功后LVEF及LVFS情况，结果显示，对照组及EXC组大鼠LVEF、LVFS均正常，且EXC组大鼠显著高于其他各组(P < 0.05)。热暴露组LEVF和LVFS较对照组显著减低(P < 0.05)，其中，EHS组LVEF低于CHS组，差异具有统计学意义(P < 0.05)，但两者LVFS无统计学差异。
| 心功能指标 | 对照组 | EXC组 | CHS组 | EHS组 |
| 射血分数(%) | 66.68±5.45cfh | 78.43±6.69afh | 53.77±9.87bdg | 44.06±13.12bde |
| 短轴缩短率(%) | 37.67±4.51deh | 48.14±7.40bfh | 29.08±6.56ad | 22.34±8.68bd |
| a: P＜0.05，b: P＜0.01, 与对照组比较；c: P＜0.05，d: P＜0.01，与EXC比较；e: P＜0.05，f: P＜0.01, 与EHS比较；g: P＜0.05，h: P＜0.01，与CHS比较 | ||||
如图 2所示，对照组和EXC组心腔结构及心功能正常。CHS组可见心腔扩大，EHS可见左室后壁与室间隔同向运动。两种热射病模型均有心功能异常发生，CHS组有3只大鼠(3/9)呈现左室收缩功能异常，EHS组大鼠有5只大鼠(5/9)出现左室收缩功能异常。有趣的是，对上述实验动物进行24 h监测，CHS组及EHS出现收缩功能异常的大鼠均在24 h内死亡，无心功能异常的存活时间均超过24 h，此结果与各组大鼠24 h存活率一致，说明热射病后心功能异常可能与24 h内的急性期死亡相关。
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| A：对照组；B：EXC组；C：CHS组；D：EHS组 图 2 两种热射病模型超声心动图代表性结果，对照组、EXC组心功能正常，未见心脏结构性改变；CHS组可见左室舒张内径增大，提示心室扩张；EHS组可见左室后壁与室间隔呈同向运动 |
2.3 血清心肌酶学水平
基于生存曲线，EHS组和CHS组在热射病发生后1~6 h死亡较多。因此，心肌酶学检测选择热射病发生后3 h收集血清标本。结果表明，EHS组AST水平高于对照组(P＜0.01，图 3A)和EXC组(P＜0.01，图 3A)。EHS组AST水平显著高于CHS组(P＜0.01，图 3A)。LDH水平EHS组高于其他3组(P＜0.01，图 3B)。EHS和CHS组的CK-MB和CK水平显著高于对照组和EXC组(P＜0.01，图 3C, D)，而EHS组和CHS组间无统计学差异(P>0.05，图 3C, D)。
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1：对照组；2：EXC组；3：CHS组；4：EHS组；a: P＜0.01，与对照组比较；b: P＜0.01，与CHS组比较 A: 血清AST含量; B: 血清LDH含量; C: 血清CKMB含量; D: 血清CK含量 图 3 两种热射病模型对血清心肌酶学水平的影响 |
2.4 组织病理学结果
心肌组织病理学改变是明确心肌损伤的重要依据。对照组心肌纤维染色均匀，细胞边界清晰。而EXC组小鼠心脏病理学切片显示，心肌纤维排列稍紊乱，可见少量炎症细胞浸润。CHS组心肌纤维边界较紊乱，细胞水肿。EHS组心肌纤维界限不清，细胞严重水肿，均质红染(图 4A)。此外，不同组的组织学评分表明，EHS组和CHS组心肌病理损伤重于EXC组和对照组(P＜0.01，图 4B)。EHS组心肌病理损伤重于CHS组(P＜0.05，图 4B)。
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a: P < 0.01, 与对照组比较; b: P < 0.05, 与CHS组比较 A: 动物心肌组织HE染色; B: 病理学评分 1:对照组; 2:EXC组; 3:CHS组; 4:EHS组 图 4 两种热射病模型中大鼠左心室心肌组织病理切片图 |
2.5 心肌细胞凋亡检测
通过TUNEL检测心肌细胞凋亡。对照组和EXC组未见明显凋亡; CHS组及EHS组可见大量心肌细胞凋亡(图 5A), 且EHS组凋亡比率显著高于CHS组(P＜0.05，图 5B)。
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a: P < 0.01, 与对照组比较; b: P < 0.05, 与CHS组比较 A: 动物心肌组织TUNLE染色; B: 心肌细胞凋亡率 1:对照组; 2:EXC组; 3:CHS组; 4:EHS组 图 5 两种热射病模型中大鼠左心室心肌组织TUNLE染色图 |
2.6 热射病导致凋亡相关蛋白表达上调
如图 6所示，与对照组相比，CHS组、EHS组大鼠心肌组织的Nrf2、HO-1、Bcl-2水平降低，Cl-Caspase3、Bax水平升高。与CHS组相比，EHS组大鼠心肌组织的Nrf2水平降低，Cl-Caspase3、Bax水平升高。
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1:对照组; 2:EXC组; 3:CHS组; 4:EHS组; a: P < 0.01, 与对照组比较; b: P < 0.05, 与CHS组比较 A: 动物心肌组织蛋白条带图; B: Nrf2蛋白表达水平; C: Cl-caspase3蛋白表达水平; D: HO-1蛋白表达水平; E: Bax蛋白表达水平; F: Bcl-2蛋白表达水平 图 6 两种热射病模型中大鼠左心室心肌组织蛋白表达 |
3 讨论
随着全球气候变暖，热射病发病率逐渐升高[24]。心血管系统在热射病过程中参与全身的散热反应与器官灌注。在热射病多脏器功能障碍患者中，心血管功能障碍发生的比例可高达43.4%~65.2%，且心脏被认为是热射病易受损的重要脏器之一[25-27]。与CHS相比，EHS除了高温环境这一危险因素，还复合了高强度运动，因此心脏负荷相对更大。临床流行病学亦提示，EHS病情更为凶猛，发展迅速，病残率及病死率更高[5, 15]。因此，对比CHS和EHS所导致的心肌损伤的研究就显得尤为必要。
本研究中，相同体质量、相同核心体温的健康大鼠，如果仅仅给予运动负荷，而没有复合高温环境，大鼠未发生热射病，即大鼠的核心体温不会达到42.3℃或出现神经症状。单纯的热暴露，大鼠可出现热射病(即Tr，max≥42.3 ℃或出现神经症状)，但需要相对较长的热暴露时间[(359.69±32.99)min，表 1]。而当高温复合运动时，大鼠的核心体温快速升高，在较短时间内[(81.58±36.33)min，表 1]即可达到热射病标准。因此，我们推断，静息状态下受热，CHS的散热机制可以在较长时间内代偿机体产热。相比CHS，EHS在复合高温及高强度运动条件下，骨骼肌大量产热以及心脏负荷增大[28]，导致机体在较短时间内即进入散热失代偿状态，表现为平台期较短，平台期体温较CHS显著增高(图 1A)。
机体可通过辐射、传导和对流以及蒸发等物理方式散热。散热的速度主要取决于机体与环境之间的温度差。机体温度越高或环境温度越低，则散热越快。当环境温度与皮肤温度接近或相等时，辐射、传导和对流这3种散热方式便无效[3]，机体只能依靠蒸发进行散热。蒸发散热会引起机体脱水，因此我们观察了CHS组和EHS组的脱水率。有趣的是，CHS组的脱水率是高于EHS组的。出现这样的现象，我们认为是因为EHS组总的热暴露时间远远短于CHS组，机体进行蒸发散热的时间较短。因此，我们通过脱水速率(g/h)来计算，这个计算方法排除了热暴露时长对脱水的影响，只观察单位时间的脱水量，结果发现EHS组每小时脱水量远远高于CHS组(表 1)。由此推断EHS快速脱水，导致有效循环血量在短期内急剧下降，是EHS心功能障碍发生率大于CHS的原因之一。
体温升高迫使机体散热增加，这种需求是通过增加心输出量，以支持皮肤血流量的增加实现的，这种改变导致内脏灌注减少，从而介导组织损伤和多器官功能衰竭[28-29]。有研究发现，机体受热复合运动时，心血管系统须承担更大的负荷[28]。本研究结果亦显示，虽然CHS和EHS均会导致不同程度的心功能障碍，但EHS发生心功能障碍的几率更大——如CHS组的9只大鼠中，有3只大鼠出现了射血分数减低，EHS组的9只大鼠中，有5只大鼠出现射血分数减低。并且，我们还发现CHS组及EHS出现收缩功能异常的大鼠均在24 h内死亡，心功能正常大鼠的存活时间均超过24 h，此结果与各组大鼠24 h存活率一致。上述结果说明，高温复合运动，增加了热射病和心功能障碍的易感性，表现为较少的热负荷即可导致热射病，以及更高的心功能障碍发生率。
心肌酶是存在于心肌的多种酶的总称，包括天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LD或LDH)、肌酸激酶(CK)及同工酶(CKMB)等。急性心肌梗死时因心肌细胞坏死而释放出心肌内多种酶，因此测定血清中心肌酶对了解心肌细胞的损伤有一定的价值。本研究发现，仅给予运动负荷，而没有复合高温环境，不会导致血清中心肌酶的增加。而两种热射病模型均会导致血清中心肌酶的增加，提示二者均会引起心肌细胞的损伤，但是，EHS大鼠AST、LDH显著高于CHS，可能说明EHS介导的心肌损伤更严重。除此之外，心脏组织的病理学结果也提示两种热射病模型均可导致心肌组织出现心肌纤维界限不清，细胞水肿等改变。EHS组的病理学评分高于CHS组，且具有统计学差异。
心脏主要通过线粒体产生大量的ATP，以维持高耗能需求及心脏功能，除了作为心肌细胞的动力站，线粒体在调节心肌细胞死亡(凋亡、坏死)中发挥重要作用。心肌细胞作为高耗能细胞，富含大量线粒体，过去有报道心肌细胞线粒体损伤可激活线粒体凋亡途径，导致心肌细胞大量凋亡[30-32]。有证据表明，体温过高通过线粒体Bax易位和细胞色素c释放到细胞质激活启动子caspase-9，进而激活下游效应子caspases-3，从而介导细胞凋亡[31]。本研究通过心肌细胞凋亡检测，发现热暴露组(CHS组和EHS组)凋亡比率明显高于非热暴露组(对照组和EXC组)，且EHS组凋亡率高于CHS组。并且在蛋白表达水平上，热暴露组(CHS组和EHS组)Caspase3、Bax水平升高，Bcl-2水平降低。提示心肌细胞发生了以细胞凋亡为特征的心肌损伤。Nrf2通路在抗氧化应激中具有重要作用，当细胞内氧自由基增多时，Nrf2会被激活进入细胞核，诱导下游的HO-1等内源性保护因子表达[33-35]。本研究中，热暴露组(CHS组和EHS组)大鼠心肌组织的Nrf2、HO-1水平降低，提示心肌细胞还遭受了氧化应激损伤。
综上所述，EHS组较CHS组具有更高的脱水速率和心功能障碍发病率。EHS组的心功能损伤和心肌组织损伤显著高于CHS组，且EHS组心肌细胞凋亡较CHS严重。EHS组大鼠心肌损伤可能与氧化应激相关信号通路的活化相关。这对于开发新的有针对性的EHS治疗策略提供了实验基础。由于EHS发病机制的复杂性，且本研究对此问题仅是热射病发病后短期的观察研究，因此相关的实验结果还需要进一步的研究。
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