表1(Table 1)
2. 230026 合肥，中国科学技术大学科学岛分院;
3. 230601 合肥，安徽大学物质科学与信息技术研究院，信息材料与智能感知安徽省实验室
2. Science Island, University of Science and Technology of China, Hefei, Anhui Province, 230026;
3. Anhui Provincial Laboratory of Information Materials and Intelligent Sensing, Institute of Physical Science and Information Technology, Anhui University, Hefei, Anhui Province, 230601, China
运动神经元(motor neuron，MN)是一种主要控制肌肉运动的神经元类型，其神经突起结构是与其他神经元或靶组织之间信息传递的主要通道[1]。神经突起的生长异常或变性都会导致一系列的神经系统症状，如肌肉无力、萎缩甚至死亡[2-4]。化学因素是导致神经突起生长异常的一个原因。已有研究证实许多环境化学物质，包括重金属、农药和有机阻燃剂，具有神经毒性和神经发育毒性，与儿童的注意力缺失症和多动障碍等神经系统缺陷的发病率增加有关[5-7]。并且环境因素也是MN变性的主要诱因，会导致散发性肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)的发生[3]。虽然确切的致病机理仍然未知，但是神经突起生长异常是ALS的一个主要特征。因此，建立测量MN神经突起生长的方法对于检测导致运动相关疾病的环境因素具有重要意义。
人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)培养和分化技术，可将hESCs分化为多种体细胞类型，为评价环境污染对人类早期发育影响提供有价值的模型[8]，也为研究人类MN神经突起生长过程提供了独特的机会[9]。来自hESCs的MN二维培养平台已广泛用于神经突起生长和再生的模拟[10]。二维培养方法包括MN低密度培养和高密度培养两种方法。低密度培养可以评估单个神经元的形态和神经突起生长[9]。但是根据实验结果，低密度神经干细胞很难存活到成熟的MN阶段。而且，成熟MN胞体极容易聚集而形成神经网络。因此，测量单个MN的神经突起生长较为困难。高密度神经元培养虽然不能评估单个神经元的形态和神经突起生长，但是可以显著提高MN的存活率。并且高密度神经元培养仍然可以提供培养系统中神经突起的总体生长情况的信息。目前可用于自动测量神经突起生长的市售的自动分析系统非常昂贵，而且算法复杂[11-12]。这些算法对于编程经验有限的生物学研究人员来说并不容易理解和实现。因此，神经突起生长量化通常还是通过劳动密集型手动或半手动跟踪进行分析，而且精度低[13-14]。本研究提出将图像识别算法用于MN神经突起的自动化测量，并将该测量方法用于评价环境污染物，如有机磷阻燃剂三(2-氯乙基)磷酸酯[Tris(2-chloroethyl) Phosphate，TCEP]，对MN神经突起的影响，从而为MN神经突起网络的量化分析提供新的方法。
1 材料与方法 1.1 细胞与试剂胚胎干细胞系H9购自Nuwacell Biotechnologies Co., Ltd.。
培养基和试剂：Advanced DMEM/F12、Neurobasal Medium(Gibco，USA)；N2、B27、mTeSR Medium(StemCell Technologies，Canada)；胰酶、DMSO(Sigma，USA)；EDTA(Nuwacell，China)；Matrigel(Corning，USA)；TCEP(Dr. Ehrenstorfer，Germany)。
小分子：GlutaMAX、NEAA、β-mercaptoethanol(Gibco，USA)；CHIR99021、LDN、SB431542、RA、SAG(StemCell Technologies，Canada)；DAPT(Sigma，USA)；BDNF(R&D Systems，USA)；GDNF(PeproTech，USA)；cAMP(Sigma，USA)。
抗体：NANOG(Abcam，United Kingdom)；OCT4(Santa Cruz Biotech，USA)；PAX6(Covance，USA)；NESTIN(Santa Cruz Biotech，USA)；OLIG2、ISLET1、ChAT(GeneTex，USA)；βⅢ-tubulin(BioLegend，USA)。
1.2 hESCs培养当hESCs的细胞汇合度达到80%时，进行传代。5 d左右传代一次。提前准备好复温的包被Matrigel的培养板。洗涤后，加入2 mL的EDTA传代工作液，置于培养箱中消化6 min，吸弃传代工作液，加入1 mL mTeSR轻轻吹打细胞，使之脱离基质胶。按所需1∶5~1∶10的比例，加入新铺好的6孔板中，并添加mTeSR培养基至2 mL。
1.3 hESCs-运动神经元的诱导分化分化基础培养基为N2B27：25 mL Neurobasal Medium、25 mL Advanced DMEM/F12、0.5% N2、1% B27、1% NEAA、1% Glutamax、0.1 mmol/L Ascorbic acid和0.1 mmol/L β-mercaptoethanol。当hESCs的细胞汇合度达到80%时，开始诱导，加入含有10 μmol/L SB、0.1 μmol/L LDN和3 μmol/L CHIR小分子化合物的N2B27培养基。每天换液，6 d后可得到神经上皮(neural epithelium，NE)细胞，并表达神经上皮细胞标记物PAX6和NESTIN。从第6天开始加入1 μmol/L RA和1 μmol/L SAG，到第14天时可获得运动神经元祖(motor neuron progenitor，pMN)细胞，并表达pMN细胞标记物OLIG2。从第14~20天加入10 μmol/L DAPT诱导pMN向未成熟运动神经元(immature motor neuron，iMN)分化。并从第11~20天加入10 ng/mL BDNF、10 ng/mL GDNF和1 μmol/L cAMP。第20天时可得到iMN细胞，并表达未成熟运动神经元标志物ISLET1和泛神经元标志物βⅢ-tubulin。第20~27天在N2B27培养基中继续加入10 ng/mL BDNF、10 ng/mL GDNF和1 μmol/L cAMP。到第27天时细胞表达胆碱乙酰化酶(choline acetyltransferase，ChAT)和泛神经元标志物βⅢ-tubulin，表明获得了成熟的MN。在hESCs分化为MN的过程中，使用Operetta CLSTM高内涵成像分析系统(PerkinElemer，United Kingdom)记录不同分化阶段细胞的明场图像。
1.4 免疫荧光实验将无菌的细胞爬片置于孔板中，然后用Matrigel铺板，使用时提前1 h复温。将细胞接种在含有细胞爬片的孔板上，进行免疫荧光实验鉴定hESCs多能性标记物NANOG和OCT4，以及分化过程各阶段细胞标志物的表达。主要步骤：4%的多聚甲醛在室温下固定细胞样品20 min；0.1% SDS在室温下通透细胞样品30 min；2%的驴血清封闭后，用一抗稀释液在4 ℃过夜孵育；二抗和染细胞核DPAI避光孵育1 h后进行封片和拍片。使用Operetta CLSTM高内涵成像分析系统进行荧光成像。
1.5 神经元神经突量化方法为了量化神经突起生长，使用神经突起密度来衡量每个视野区域的神经突起所覆盖的面积。先前的研究表明，每个成像区域的神经突起面积可以直接反映神经元培养中神经突起的伸长情况[15-16]。为了计算神经突起密度，使用成像算法对不属于胞体区域的细胞部分(即神经突起)进行计算、识别和定量。实验进行3次，对于同一样本，随机选取位置上下左右中5个视野进行统计[17-18]。
测量MN神经突起的算法如表 1所示。使用Matlab软件运行表 1算法，来识别和定量每个视野下的神经突起面积。神经突起密度的计算公式为：神经突起密度=神经丝面积/视野总面积×100%。
| clear; close all; clc; |
| % filename='.\\文件所在位置\\'; |
| filename='.\\文件所在位置\\图片'; |
| % filename='.\\文件所在位置\\图片'; |
| img=imread(filename); %%图片 |
| img=double(img)/255; |
| subplot(2, 3, 1); imshow(img, [ ]); title(filename); |
| imageGreen=img(: , : , 2); %%图像绿色通道 |
| H=fspecial('gaussian', 3, 1); |
| imageGreen=imfilter(imageGreen, H, 'replicate'); %%高斯滤波 |
| mask=imbinarize(imageGreen); %%二值化图像 |
| mask=imopen(mask, strel('disk', 5)); %%平滑图像，去除噪声 |
| mask=imdilate(mask, strel('disk', 5)); %%膨胀处理 |
| subplot(2, 3, 2); imshow(mask, [ ]); title('神经元胞体分割'); |
| imgS=imageGreen.*double(~mask); |
| subplot(2, 3, 3); imshow(imgS, [ ]); title('去除胞体'); |
| imgD =imageGreen - imerode(imageGreen, strel('disk', 5)); |
| subplot(2, 3, 4); imshow(imgD.*~mask, [ ]); title('细丝增强'); |
| Th=0.12; %%细丝保留阈值，取值范围0~0.3；阈值越小，保留的细丝越多 |
| mask2=(imgD>Th)&~mask; |
| area=sum(mask2(: )); |
| subplot(2, 3, 5); imshow(mask2, [ ]); title(['细丝面积=', num2str(area)]); |
| subplot(2, 3, 6); imshow(img, [ ]); hold on; title('细丝描绘'); |
| [yy, xx]=find(mask2); |
| plot(xx, yy, 'r.', 'MarkerSize', 0.5); |
1.6 污染物TCEP暴露实验
将TCEP溶解在DMSO中配置母液。使用前，将母液在培养基中稀释1 000倍制成工作液。在MN分化过程中，TCEP暴露浓度为0、25、50和100 μmol/L。
1.7 统计学分析使用Graphpad Prism 8.0软件作图并对实验所得数据进行统计学检验，数据以x±s表示，采用单因素方差分析进行比较。P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 胚胎干细胞鉴定对胚胎干细胞系H9进行多能性标记物NANOG和OCT4的免疫荧光鉴定。免疫荧光结果如图 1所示，细胞均同时表达NANOG和OCT4。表明实验所使用的胚胎干细胞系干性良好，纯度高，可以进行后续诱导分化实验。
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| 图 1 hESCs的多能性鉴定 |
2.2 运动神经元诱导分化
诱导分化小分子加入时间点和各阶段细胞明场图像见图 2A、B，分化过程包括4个阶段：①第6天分化为NE细胞；②第14天分化为pMN细胞；③第20天分化为iMN细胞；④第27天分化为MN细胞。同时对各阶段细胞表达的特定标志物进行免疫荧光实验验证，可看出各阶段细胞均大量表达其相应标志物(图 2C)。NE阶段细胞大量表达神经上皮细胞标记物PAX6和NESTIN。加入诱导信号分子RA及SAG调控NE向pMN分化，pMN表达OLIG2。pMN随后向iMN分化，iMN阶段细胞大量表达未成熟MN标志物ISLET1和泛神经元标志物βⅢ-tubulin。MN阶段细胞大量表达成熟MN标记物ChAT和泛神经元标志物βⅢ-tubulin。表明实验方案能够诱导出纯度较高的MN。
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| A：诱导hESCs分化为MN的示意图；B：不同分化阶段细胞的明场图像；C：免疫荧光检测定向分化过程中各阶段细胞的标记物 图 2 hESCs分化为运动神经元 |
2.3 神经突起生长的表征
选择利用神经突起密度来量化神经突起，即单位面积的神经突起所覆盖的面积。开发图像识别算法，使用MATLAB软件运行程序处理神经突起荧光图像，实现对神经突起的识别和定量。MATLAB软件运行算法的结果如图 3A所示，该算法能够识别和分离出神经元胞体的轮廓以及神经突起的位置。并且可以通过优化细丝增强和细丝描绘技术，识别和保留细小的分支和丝状结构。优化结果如图 3B所示，在合适的细丝保留阈值下，保留的细丝能够与荧光图像细丝高度重合，提高测量的精度。
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| A：图像识别处理流程图；B：细丝描绘算法的优化 图 3 MATLAB软件运行算法的结果 |
进一步利用开发的算法对hESCs分化为MN过程中神经突起的生长过程进行量化表征。神经突起的免疫荧光图像如图 4A所示，微小的神经突起样结构是从pMN阶段细胞中开始少量出现。随着pMN细胞的分化，神经突生长迅速，βⅢ-tubulin染色阳性的神经突起密度越来越高。从iMN期开始，许多细胞具有多个较长的神经突起。到MN阶段神经突起网络形成，特征是神经突起呈辐射状分布在聚集的胞体周围。从图中可以看到，在细胞分化过程中，神经突起密度逐渐增加。为了量化表征神经突起密度，使用开发的图像处理算法对不同阶段的神经突起图像进行处理。结果如图 4B所示，与免疫荧光结果相一致，随着分化的进行，神经突起密度明显增加。说明该算法能够用于高密度二维培养的MN神经突起的量化。
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| A：NE到MN阶段细胞由βⅢ-tubulin免疫荧光显示神经突起的生长过程；B：pMN到MN阶段细胞神经突起密度的图像识别算法量化 图 4 图像识别算法对运动神经元神经突起生长过程的表征 |
2.4 图像识别算法在评价环境污染物对MN神经突起毒性上的应用
利用开发的图像识别算法分析TCEP，一种环境介质中普遍存在的有机磷酸酯阻燃剂(organophosphate flame retardants，OPFRs)，对MN细胞生成过程神经突起生长的影响。从hESCs诱导第1天开始进行TCEP暴露，直到MN细胞形成，观察并分析TCEP对MN整个分化过程中神经突起生长的影响。结果如图 5A所示，随着浓度的升高，TCEP抑制了神经突起生长。而且从50 μmol/L的TCEP开始，神经突起密度明显降低，神经突起也变得更微弱。使用图像识别方法的量化结果显示，TCEP处理组从浓度50 μmol/L开始，神经突起密度显著减少(P < 0.05，图 5B)。说明使用算法的量化结果与免疫荧光结果相一致，表明本文开发的算法能够用于TCEP对神经突起的毒性评价。
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| A：不同浓度TCEP暴露的运动神经元神经突起免疫荧光图像；B：基于图像识别算法的量化数据表明TCEP以剂量依赖的方式抑制运动神经元神经突起生长 a：P<0.05，b：P<0.01，与0 μmol/L TCEP比较 图 5 图像识别算法量化TCEP对运动神经元神经突起的影响 |
3 讨论
MN作为运动系统的核心细胞，具有非常复杂的回路，其神经纤维是全身最长的，轴突从中枢神经系统一直延伸到与之相连的肌肉[4]。MN的神经突起极容易受环境因素影响而异常生长或退化，从而导致一系列的神经系统症状，如肌肉无力、萎缩甚至死亡[2]。因此，建立测量MN神经突起生长的方法对于检测导致运动相关疾病的环境因素具有重要意义。
根据MN培养结果发现低密度神经干细胞很难存活到成熟的MN阶段。而且，成熟MN胞体极容易聚集而形成神经网络。因此，测量单个MN的神经突起生长较为困难。高密度神经元培养不仅可以提高细胞存活率，而且可以为神经突起的总体生长情况提供有用的信息。但是高密度培养的MN，其神经突起相互交错，而且神经突起粗细、深浅差异较大。因此，本研究选择利用神经突起密度来量化神经突起生长，即单位面积的神经突起所覆盖的面积。前人研究也表明，每个成像区域的神经突起面积可以直接反映神经元培养中神经突起的伸长情况[15-16]，而且目前的图像分析软件在高密度神经突起网络识别上还存在耗时和识别精度低的缺点[13]。因此，本研究开发了图像识别算法用于MN神经突起的自动化测量。
通过模拟MN在体内的发育过程，调控诱导信号将hESCs经历4个阶段分化为MN。随着分化的进行，每个阶段的细胞都表达特定的标志物。在第一阶段，大多数细胞表达标志物NESTIN和PAX6，显示NE的生成。然后在维甲酸和SHH信号通路的作用下，NE细胞分化成为表达OLIG2的pMN细胞。pMN细胞继续分化为表达ISLET1的iMN细胞，并进一步成熟为表达ChAT的MN。这与研究报道的MN分化过程和结果相一致[9, 19]。利用开发的算法对神经突起生长过程进行表征，量化表征结果与免疫荧光结果相一致，随着分化的进行，神经突起密度明显增加。因此，该算法能够用于高密度二维培养的MN神经突起的量化。
由于溴化阻燃剂造成的过度污染，全球发展趋势是使用OPFRs作为可燃材料的添加剂，以防止火灾发生[17, 20]。而TCEP是一种大量使用的OPFRs，被广泛用于塑料、纺织品、电子设备、家具和建筑材料，导致其在人体中被频繁检出[21-27]。因此，本研究继续分析了环境污染物TCEP暴露对MN细胞神经突起密度的影响。采用图像识别算法获得的定量数据显示，TCEP从浓度为50 μmol/L开始，神经突起密度显著减少，表明TCEP从此浓度开始能够显著抑制神经突起生长。动物实验表明，TCEP在500 mg/L(1.751 4 mmol/L)及以上的浓度时，能够显著降低线虫的身体弯曲和头部摆动的运动频率[28]。最近的一项研究使用室内灰尘、母乳和擦手巾中OPFRs浓度估计OPFRs在人体血浆中的浓度范围是10-6~31.9 μmol/L[29]。因此，本研究建立的方法是一个高灵敏度的方法，有潜力应用于人体暴露相关浓度下的OPFRs的神经发育毒性评估。
综上，本研究成功诱导出表达ChAT的MN，开发了图像识别算法用于神经突起的自动化识别和密度计算，分析了不同浓度TCEP对神经突起生长的抑制作用，确定TCEP从50 μmol/L开始对MN神经突起生长有显著的抑制作用。研究结果表明本研究建立的图像分析方法是一个高灵敏度的方法，有潜力应用于其他环境污染物的神经发育毒性分析，为评估环境污染物对人体的健康危害提供了新的方法。此外，图像识别算法还有望帮助研究者对神经突起生长过程中的细节特征进行有效的提取和分析，从而获得更加准确的数据和结果。例如，通过深度学习等技术对图像进行高精度的识别和分析，测量出微小的变化，进一步提高测量精度。这有助于理解神经突起生长的细节机制，有助于为深入了解神经系统的发育和功能提供更加全面和详细的数据和信息，也可以为神经退行性疾病的预防和治疗提供更加科学和有效的手段和方法。但是本研究所提出的图像分析方法主要反映的是神经突起的密度，没有对神经元平均突起长度进行计算。因此，后续研究将尝试使用深度学习技术，更好地实现对神经突起网络的检测。
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