金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，简称金葡菌)是重要的人兽共患病原菌，可引起人创伤感染、肺炎、脑脓肿、脓毒症，牛、羊乳腺炎等感染性疾病[1-2]。2017-2021年，据中国细菌耐药监测网(http://www.chinets.com)报道，我国临床金葡菌分离率均位列所有细菌分离率第3位，革兰阳性菌分离率第1位。金葡菌可产生上百种毒力因子参与致病，致病机制复杂[3]。在进行金葡菌致病机理研究及治疗策略探索的实践中，亟需一种高效、可靠的细菌示踪系统。
光学示踪成像主要采用荧光(fluorescence)和生物发光(bioluminescence)两种技术[4]。自绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，简称GFP)发现以来，该分子被广泛用于构建荧光报告系统，应用于肿瘤生长与转移、干细胞归巢等示踪研究中[5]。GFP在接受其他分子提供的能量后可产生509 nm的绿色荧光，容易被机体组织细胞所吸收(波长 < 600 nm的光都易被组织吸收)[6]。金葡菌等细菌的个体微小(约1.0 μm)，利用质粒表达GFP进行细菌示踪，尤其是体内示踪，效果不理想。一方面，质粒不稳定，在体内极易丢失；另一方面，GFP体内荧光成像敏感性差，常常需要将实验动物处死，解剖取出脏器进行成像[7]。生物发光则是利用荧光素酶催化底物进行发光和示踪成像，常用的荧光素酶有细菌的荧光素酶基因操纵子(LuxCDABE)，发光波长490 nm；萤火虫荧光素酶(firefly luciferase，Fluc)，分子量60.6 kDa，发光波长460 nm；海肾荧光素酶(renilla luciferase，Rluc)，分子量36.0 kDa，发光波长 < 500 nm等[4, 8]。2012年，Hall从一种深海虾(Oplophorus gracilirostris)中发现了发光波长454 nm的荧光素酶(nanoLuc，Nluc)，分子量仅19.1 kDa，但其催化底物的效率比Fluc和Rluc高约150倍，发光强度高100倍[9]。将Nluc与两分子的橘红色荧光蛋白CyOFP1融合形成的Antares荧光素酶，通过生物发光能量转移可产生>600 nm的光子，极大改善了体内成像效果[6]。将Nluc编码基因经过错配PCR分子进化，筛选到的突变体TeLuc与两分子CyOFP1构建的融合物Antares2催化底物diphenylterazine (DTZ)发光效率又提高了3.8倍(相较于Antares/DTZ系统)，在肿瘤细胞活体示踪成像中优势显著，但在细菌示踪中尚未见相关研究报道[6, 9]。本研究基于Antares2构建金葡菌生物发光示踪系统，通过构建稳定示踪菌株，遴选合适底物，探索金葡菌示踪系统的生物发光检测敏感性。
1 材料与方法 1.1 实验菌株、质粒与试剂金葡菌USA300(FPR3757)菌株由上海交通大学李敏教授惠赠，金葡菌RN4220(NCTC 8325-4)以及大肠埃希菌-金葡菌穿梭质粒pBT2由中国科学技术大学孙宝林教授惠赠。DH5α大肠埃希菌购于北京天根(Tiangen)公司。荧光素酶Antares2全长基因由华大基因合成并克隆至pUC-antares2质粒中。细菌基因组提取试剂盒、DNA片段回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Promega公司，Gibson组装克隆试剂盒购自NEB公司；哥伦比亚血琼脂平板购自庞通医疗，细菌培养基LB和TSB购自Oxoid公司；furimazine (FUR)购自Promega公司；荧光素酶底物DTZ和hydrofurimazine(HFZ)购自MCE公司。
1.2 金葡菌示踪菌株的构建示踪菌的构建采用同源重组的方式进行[10]。烯醇酶编码基因eno是金葡菌中进化保守的基因，课题前期研究发现Eno是金葡菌内可靠的外源蛋白融合靶标[11]。因此，我们根据金葡菌USA300基因组序列(GenBank登录号：CP014362.1)中Eno编码基因终止密码子的上、下游序列，设计1对引物Up-eno-F3(5′-gagctcggtacccgggatgatcgcattagacggt-3′，下划线碱基为与PBT2质粒的同源序列)/Up-eno-R3(5′-tgctcaccattttatctaagttatagaatgatttgataccg-3′，下划线碱基为与引物eno-antares2-F3的同源序列)用于PCR扩增左同源臂，再设计1对引物Down-eno-F3(5′-caagtgactcgagttttctttataatcaaatgctgac-3′，下划线碱基为与引物eno-antares2-R3的同源序列)/Down-eno-R3 (5′-gataaactaccgcattactgcttttaccttcttggagtag-3′，下划线碱基为与PBT2质粒的同源序列)扩增右侧同源臂。根据pUC-antares2质粒荧光素酶基因编码序列设计1对引物eno-antares2-F3 (5′-cttagataaaatggtgagcaagggcgag-3′, 下划线部分为与引物Up-eno-R3的同源序列)/eno-antares2-R3(5′-gaaaactcgagtcacttgtacagctcgtccatgc-3′，下划线部分为与引物Down-eno-F3的同源序列)用于扩增荧光素酶基因antares2。将PCR扩增获得的同源左臂(Eno)、右臂(Down)及Antares2片段用琼脂糖凝胶回收后取等摩尔比例混合，利用各片段之间的同源序列，采用Gibson组装克隆试剂盒克隆到pBT2穿梭质粒上，转化DH5α大肠埃希菌感受态，涂布LB平板(含氨苄青霉素Amp100 μg/ml)，37 ℃孵箱培养，第2日挑取单菌落于LB液体培养基中37 ℃振荡培养后，制备重组质粒进行酶切鉴定，含有目标融合片段的重组质粒命名为pBT2-eno-antares2。
将pBT2-eno-antares2质粒电转化入金葡菌RN4220中进行限制性修饰，再从中提取修饰后的质粒电转化入金葡菌USA300感受态细胞，涂布TSB平板(含氯霉素Cm 20 μg/mL)。次日挑取单菌落接种于TSB培养基中，30 ℃振荡培养过夜，提取质粒再行酶切验证，获得转化菌。根据pBT2质粒的温敏特性，将转化菌接种到含Cm的TSB中，42 ℃培养过夜；次日，取菌液涂布含Cm的TSB平板，置42 ℃培养；第3日挑取单菌落接种含Cm的TSB培养基，37 ℃培养后提取基因组，用引物对Up-eno-F3/pBT2-PCR-R(5′-ccgggtaccgagctcg-3′)和pBT2-PCR-F(5′-taatgcggtag-tttatcacagtt-3′)/Up-eno-R3进行PCR扩增，确定是左同源臂，还是右同源臂发生了重组的菌株。取重组菌于TSB培养基(无抗生素)中25 ℃培养24 h，涂布于无抗TSB平板，37 ℃培养过夜，次日再挑取单菌落分别接种至含Cm及无抗生素的TSB平板上，37 ℃过夜培养，在氯霉素平板上不生长，而在无抗平板上生长者，为可疑的重组菌株，挑取可疑重组菌培养后提取基因组，用外侧引物Up-eno-F3/Down-eno-R3进行PCR扩增，鉴定发生双交换的菌株，并将扩增产物送DNA测序，序列正确的突变菌株即为示踪菌USA300/Eno-Antares2。
1.3 USA300/Eno-Antares2示踪菌株的Western blot鉴定参考前期研究方法[7]，将测序鉴定正确的USA300/Eno-Antares2示踪菌株及野生型USA300株碎菌后，提取菌体蛋白并进行SDS-PAGE电泳，然后通过半干转印系统蛋白质转印到PVDF膜上，用anti-Eno多克隆鼠抗体进行Western blot鉴定，实验重复3次。
1.4 金葡菌示踪菌的生长曲线测定将示踪菌USA300/Eno-Antares2及野生型USA300株分别接种于含2 mL TSB培养基中于37 ℃振荡培养过夜。次日，取过夜菌液按1∶100比例分别接种于含50 mL TSB培养基的锥形瓶(250 mL)中，37 ℃振荡培养，每小时取1 mL培养液于石英比色杯中，分光光度计检测光密度值D(600)，检测至24 h，实验重复3次。用D(600)值与培养时间绘制生长曲线。
1.5 金葡菌溶血活性检测取USA300/Eno-Antares2及野生型USA300的过夜培养菌液各1 μL，加入至含99 μL无菌PBS缓冲液的EP管中，振荡混匀。取10 μL稀释菌液滴入血平板上，置于37 ℃孵箱培养24 h，取出血平板转移至4 ℃冰箱，保存12 h后观察溶血情况并摄像。
1.6 金葡菌示踪菌株体外生物发光信号检测将USA300/Eno-Antare2接种至BHI培养基于37 ℃培养至D(600)值为2.0，10 000×g离心10 min收集细菌细胞，用PBS缓冲液洗涤1次，再用PBS调整至每毫升含1×109菌落形成单位(colony forming unit, CFU)。在3支0.2 mL Ep管中分别加入90 μL示踪菌悬液，再分别加入10 μL底物溶液(DTZ、FUR和HFZ，每个浓度3 mmol/L)，混匀后，在暗室中肉眼观察发光信号，并使用V40数码相机进行摄像。
为检测示踪菌催化不同底物的发光强度差异，在96孔板中加入1×107 CFU/mL的示踪菌悬液50 μL/孔，再每孔加入等体积含不同浓度(3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L)的底物DTZ，PUR或HFZ溶液后混匀。将96孔板置生物发光检测仪IVISⓇ Lumina LT system上进行总发光强度检测，读取每孔的生物发光强度。
1.7 金葡菌示踪菌体外生物发光敏感性分析为分析示踪金葡菌发光信号与细菌数量之间的相关性，将USA300/Eno-Antares2接种至TSB培养基进行培养，次日收集细菌，用PBS稀释并制备成1×102、2×103、2×104、2×105、2×106CFU/mL等5个不同浓度的细菌悬液。分别取50 μL细菌溶液与50 μL HFZ底物(100 μmol/L)混合并加入96孔板中，使用IVISⓇ Lumina LTsystem采集发光图像和信号。绘制示踪菌总发光强度与细菌数量关系曲线，分析金葡菌示踪敏感性。
1.8 金葡菌示踪菌小鼠体内生物发光敏感性分析雌性BALB/c小鼠购自陆军军医大学实验动物中心。细菌感染的实验设计、实验过程及动物处死方式经过陆军军医大学实验动物福利伦理审查委员会审核，批准号为SYXK-YU-20170002，符合动物伦理和动物福利要求。
为探究金葡菌示踪系统USA300/Eno-Antares2/HFZ在小鼠中的发光成像敏感性，BALB/c小鼠分为6个剂量组(n=3)，先用1% (m/v)戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，再用6% (m/v)硫化钠按文献[7]报道的方法进行背部脱毛。次日，将50 μL分别含101、102、103、104、105 CFU示踪菌USA300/Eno-Antare2和50 μL底物HFZ(100 μmol/L)混合物经皮下注射到小鼠背部皮下。以105 CFU野生型USA300细菌+HFZ底物注射小鼠作为阴性对照。注射1 min后使用IVISⓇ Lumina LT系统测量小鼠发光信号。皮肤生物发光成像的灵敏度下限描述为感染小鼠皮肤中仍能发出生物发光信号的最低示踪细菌CFU。
1.9 统计学分析采用GraphPad prism 9.0软件对示踪菌催化不同浓度不同底物发光强度数据进行统计学处理，总发光强度数据以log10(p/s)平均值±标准差表示，采用单因素方差分析，检验水准：α=0.05。
2 结果 2.1 金葡菌示踪菌株的构建与鉴定以金葡菌USA300菌株为出发菌[10]，将包含同源重组左臂Eno，Antares2基因和同源重组右臂Down片段通过同源重组克隆到pBT2质粒上[7]，将荧光素酶Antares2基因插入到细菌基因组烯醇酶编码基因eno终止密码子之前，与Eno形成融合蛋白，具体构建策略如图 1A所示。构建目标基因敲入质粒(图 1B)。将该质粒转化入金葡菌USA300菌株中，利用pBT2质粒的温敏特性及氯霉素抗性，通过30 ℃和42 ℃交替培养，最后筛选氯霉素敏感的菌落，提取其基因组，PCR扩增含目标基因的片段进行测序鉴定，结果如图 1C所示，可见荧光素酶Antares2基因与Eno正确融合。为进一步探究目标融合基因是否能表达，采用Western blot对Eno-Antares2融合蛋白进行检测，结果如图 1D所示，与野生型USA300菌株相比，USA300/Eno-Antares2菌株中目标蛋白增加约70 kDa，与荧光素酶Antares2的理论分子量71.9 kDa相当，表明金葡菌示踪菌株USA300/Eno-Antares2构建成功。
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| A：金葡菌示踪菌构建示意图；B：基因敲入质粒；C：示踪菌的测序鉴定；D：示踪菌的Western blot鉴定 Eno：多克隆抗体；M：蛋白分子量标准；1：USA300菌株；2：USA300/Eno-Antares2 图 1 金葡菌USA300/Eno-Antarces2示踪菌的构建与鉴定 |
2.2 金葡菌示踪菌株生长曲线及溶血活性
为探究荧光素酶基因敲入对金葡菌菌株生物学特性的影响，首先对细菌的生长曲线进行了测定，结果如图 2A所示，可见在培养24 h内，示踪菌USA300/Eno-Antares2的生长与野生型菌株USA300无明显差异。溶血活性检测显示，示踪菌USA300/Eno-Antares2与野生型菌株USA300也无显著性差异(图 2B)，表明荧光素酶基因Antares2的敲入对金葡菌示踪菌株的生长和溶血性能无明显影响，该示踪菌可用于细菌感染等研究。
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| A：细菌生长曲线；B：细菌溶血活性 图 2 示踪菌USA300/Eno-Antarces2的生长曲线和溶血活性 |
2.3 示踪菌体外生物发光检测
荧光素酶通过催化底物发光，底物不同则发光强度会有所不同[12]。将培养至对数生长期(OD600=1.0)的金葡菌USA300/Eno-Antarces2悬液与等体积底物DTZ, FUR或HFZ进行混合，暗室中即可肉眼观察到发光(图 3A)，且示踪菌与HFZ组合的示踪系统发光最亮。进一步采用生物发光成像仪进行检测，结果发现随着底物浓度降低，示踪菌USA300/Eno-Antarces2在25 μmol/L DTZ底物中发光强度显著下降(图 3B、C)，在12.5 μmol/L FUR底物中发光强度也显著下降，而在低至3.125 μmol/L HFZ底物中仍能检测到较强发光。示踪菌催化HFZ底物发光在每个浓度梯度均显著强于DTZ和FUR底物。这些结果表明，金葡菌USA300/Eno-Antarces2/HFZ生物发光体系的效率最高，可用于示踪研究。
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| A：示踪菌催化不同底物发光的肉眼观察；B：不同底物浓度的发光强度比较；C：不同底物浓度的发光强度检测 图 3 示踪菌USA300/Eno-Antarces2催化不同底物的发光强度分析 |
2.4 金葡菌USA300/Eno-Antarces2/HFZ示踪系统的敏感性及体内生物发光检测
将不同数量的示踪菌(0.5×102、103、104、105、106 CFU)分别与100 μmol/L的HFZ底物进行混合，用生物发光仪进行总发光强度检测，结果如图 4A所示，可见50个细菌即可检测到明显的发光信号。示踪菌以HFZ为底物，总发光强度的对数与细菌数量的对数呈现很好的线性关系(图 4B)，决定系数R2=0.999 4，体外检测敏感性为50 CFU。
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| A：示踪系统体外敏感性分析；B：示踪系统体外检测的线性关系；C：示踪菌感染小鼠的敏感性检测；D：示踪菌感染小鼠敏感性的线性关系 图 4 示踪系统USA300/Eno-Antarces2/HFZ的敏感性分析 |
将不同数量的示踪菌(101、102、103、104、105 CFU)分别与100 μmol/L的HFZ底物混合后注射到BALB/c小鼠皮下，生物发光仪进行总发光强度检测。结果如图 4C所示，与感染105 CFU野生型USA300对照组相比，101 CFU示踪菌即可检测到较弱的发光信号，感染102 CFU示踪菌可催化底物产生稳定发光信号。示踪菌总发光强度的对数与102~105 CFU细菌数量的对数呈现很好的线性关系(图 4D)，相关系数R2=0.982 3，小鼠体内示踪检测敏感性为100 CFU。
3 讨论自从萤火虫发光系统被发掘以来，生物发光的应用涉及动物活体示踪成像、生物传感、毒性物质测定、病原体快速检测、细菌总数测定等领域[13]。在已开发的40余套荧光素酶/底物系统中，融合型荧光素酶Antares2是目前催化底物效率最高，发光最强的系统[6, 12]。其核心荧光素酶分子TeLuc是在深海虾荧光素酶Nluc的基础上经过错配PCR突变并筛选获得的有3个氨基酸突变(Asp19Ser, Asp85Asn和Cys164His)的分子[6]，其催化底物DTZ发射的454 nm青蓝色光可被与其融合的CyOFP1荧光蛋白吸收，发生生物发光能量转移，产生589~620 nm光，其中>600 nm光子产生的能力是野生型Nluc的3.8倍，为萤火虫荧光素酶系统Fluc/D-荧光素的65倍，尤其适合生物细胞的体内示踪[6, 8]。
生物发光示踪细菌的构建通常采用质粒对荧光素酶进行表达。如最早的研究就是将发光细菌(Photorhabdus luminescence)的LuxCDABE系统克隆到pCGSL1质粒上, 再转化伤寒沙门氏菌并实现体内示踪[14]。2003年，KADURUGAMUWA等[15]将Lux操纵子克隆到转座子质粒pAUL-ATn中，转化金葡菌ATCC 12600菌株，获得生物发光金葡菌Xen 29。但质粒在无抗生素选择压力下极易丢失，导致示踪失败。为获得稳定的金葡菌示踪菌株，本研究采用基因敲入的方法，将Antares2编码基因插入金葡菌USA300基因组烯醇酶编码基因eno的终止密码子之前，与eno形成融合蛋白。选择eno作为融合靶标主要基于2点考虑：一是烯醇酶作为金葡菌代谢关键功能酶，其表达稳定；二是前期有研究证实，在该分子后融合异源分子不会影响金葡菌生长[7]。正如设计所预期，在将Antares2基因成功敲入目标位置构建USA300/Eno-Antares2工程菌后，菌株的生长曲线和溶血活性与野生型USA300菌株无明显差异，可以用于细菌感染等研究。
荧光素酶通过催化底物发光，不同荧光素酶的底物不同，同一种酶催化不同底物的发光性能也会有差异。Antares2的底物通常是水母腔肠素类似物DTZ[9]和咪唑吡嗪酮FUR[4], 这2种底物的溶解性不好，生物利用度较差。2020年，SU等[12]以FUR为骨架，构建并筛选出了水溶性好的底物羟化物HFZ。本研究构建的示踪菌株USA300/Eno-Antares2对上述3种底物都能进行催化并发光，且产生的光在暗室中肉眼即可观察到。相比较而言，USA300/Eno-Antares2/HFZ的发光最亮，是良好的示踪系统。应用该系统进行发光检测，体外检测的敏感性为50 CFU。利用BALB/c小鼠进行示踪系统体内的发光敏感性检测，敏感性为100 CFU, 该敏感度值要比文献报道的基于甲虫荧光素酶Luc/D-luciferin的金葡菌系统(3×104CFU)高约300倍[16]。
综上所述，本研究成功构建了基于融合型荧光素酶Antares2金葡菌示踪菌株，通过催化不同底物生物发光的比较和筛选，获得的USA300/Eno-Antares2/HFZ金葡菌示踪系统的检测性能好，检测敏感性佳，为后续开展金葡菌感染及体内示踪研究奠定了基础。
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