表1(Table 1)
2. 400038 重庆，陆军军医大学(第三军医大学)军事预防医学系毒理学研究所
2. Institute of Toxicology, Faculty of Military Preventive Medicine, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400038, China
微塑料(microplastics，MPs)是指直径小于5 mm的塑料颗粒[1]，微塑料的来源主要分为两类，分别为初级微塑料，来源于生产过程中以微米大小的颗粒排放到环境中的塑料，如化妆品、牙刷中的微珠[2]；另一类为次级微塑料，是塑料制品在环境中经过紫外辐射、高温、磨损和化学裂解[3]，以及低程度微生物降解[4]形成的塑料颗粒。聚苯乙烯(polystyrene，PS)占塑料工业生产份额的主体。研究证明，聚苯乙烯微塑料(polystyrene microplastics，PS-MPs)在多种环境介质中存在，如海洋[5]、河流[6]、土壤[7]、空气[8]。在食品如饮用水[9]、食盐[10]、糖[11]中都检出了PS-MPs。已有研究报道PS-MPs可以经食物链富集、空气吸入、皮肤接触等途径进入人体[2]。PS-MPs在生物体内发挥多种毒性作用，包括影响生长发育、代谢紊乱、氧化应激、免疫毒性、神经毒性和生殖毒性等方面[12-13]。
由于生殖系统较为敏感，PS-MPs可能会对生殖系统构成更大风险。微塑料对生殖系统毒效应的研究显示，PS-MPs暴露导致雄性小鼠精子数量和活力下降，精子畸形率增加[14]；PS-MPs可通过Nrf2/HO-1/NF-κB通路诱导睾丸炎症[15]，通过激活MAPK-Nrf2途径破坏血睾屏障(blood-testis barrier, BTB)完整性[16]，下调LH介导的LHR/cAMP/PKA/StAR途径诱导睾酮水平降低[17]。然而，PS-MPs对雄性生殖损伤的具体功能和机制仍不十分清楚。
本研究以小鼠睾丸间质细胞TM3细胞株作为研究模型，探讨不同粒径大小(5 μm和80 nm)的PS-MPs对小鼠睾丸重要组成细胞增殖和凋亡的影响以及可能涉及的毒性机制，为预防PS-MPs潜在雄性生殖损伤风险提供了理论基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂5 μm和80 nm的PS-MPs购自天津基线技术研究中心；DMEM培养基购自美国Sigma公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；Cell Counting Kit-8 (CCK-8)购自重庆葆光生物技术有限公司；Annexin V FITC Apop Dtec Kit I 100Tst购自美国BD公司；ABScript Ⅲ RT Master Mix for qPCR with gDNA Remover逆转录试剂盒、2× Universal SYBR Green Fast qPCR Mix、Total RNA Extraction Reagent(TRIzol)均购自美国Abclonal公司；无菌去离子水PCR级购自中国北京索莱宝科技有限公司；p53、Bax和Bcl2引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；RIPA蛋白裂解物、BCA蛋白浓度检测试剂盒、PMSF、QuickBlock Western一抗稀释液、QuickBlock Western二抗稀释液、β-actin Rabbit Monoclonal Antibody和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)均购自中国上海碧云天公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自中国北京庄盟国际生物基因科技有限公司；PageRulerTM预染蛋白分子量标准购自美国ThermoFisher公司；p53、Bcl2、Bax、Caspase3和Caspase9抗体购自美国Abcam公司。
1.1.2 细胞株小鼠睾丸间质TM3细胞株购自美国ATCC细胞库。将TM3细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，培养箱条件：37 ℃恒温，湿度70%，5%的CO2浓度，取对数生长期细胞用于实验。
1.2 方法 1.2.1 CTD数据库基因筛选与富集利用CTD数据库分析，种属包括Mus musculus(小鼠)、Homo sapiens(人类)和Danio rerio(斑马鱼)，暴露方式为细胞株PS染毒、动物静态染毒和胚胎注射染毒。“Keyword Search”中选择“chemical”，输入Polystyrene(聚苯乙烯，PS)。在“Disease”选项中检索相关疾病为“Urogenital disease (male)”(男性泌尿生殖系统疾病)的有关基因。将筛选的基因使用“DAVID Bioinformatics Resources”数据库进行GO生物学过程和KEGG通路富集分析PS-MPs诱导男性泌尿生殖系统疾病中相关基因的生物学意义，再使用“联川生物云平台(https://www.omicstudio.cn/tool)”进行可视化分析。
1.2.2 细胞活力检测将TM3细胞按照1×103个/孔接种于96孔板中，待12 h细胞贴壁后，分别使用5 μm和80 nm两种粒径的PS-MPs，加入超纯水配制成浓度为0、10、20、40 μg/mL处理TM3细胞。在处理48 h后，观察细胞形态并按照10 μL/孔加入CCK-8试剂，于培养箱中避光孵育60 min后，使用酶标仪在450 nm波长处测定光密度值。
1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡TM3细胞以6×104个/孔接种于6孔板中，将细胞染毒48 h后，使用离心管收集细胞培养液及胰酶消化的细胞，低速离心机1 000 r/min离心5 min，弃掉上清并使用PBS重悬。细胞计数取5×104个细胞，再次1 000 r/min离心5 min，弃上清。使用1×结合缓冲液重悬细胞，分别加入5 μL的FITC Annexin V和5 μL的PI，室温避光孵育15 min，在1 h内上BD流式细胞仪检测细胞凋亡，使用flowjo10.6.2软件作图。
1.2.4 总RNA的提取TM3细胞在6孔板染毒48 h后，弃掉培养基，使用PBS清洗2遍。加入500 μL/孔TRIzol，冰上静置5 min，吹打细胞移至无酶的1.5 mL EP管。每个EP管中加入100 μL氯仿(三氯甲烷)，上下摇晃15 s，静置10 min至分层。使用预冷的离心机，在4 ℃ 12 000 r/min离心20 min，离心之后小心吸取上层RNA移至无酶的1.5 mL EP管中，加入等体积4 ℃预冷的异丙醇，充分混匀，静置10 min。使用离心机4 ℃ 12 000 r/min离心20 min，离心后弃掉上清，风干至液体完全蒸发，沉淀为RNA。每管加入1 mL 75%乙醇，上下轻轻颠倒洗涤。离心机4 ℃ 12 000 r/min离心20 min，弃掉上清，室温静置至乙醇完全蒸发，根据沉淀大小加入DEPC水(10~20 μL)溶解RNA。采用Nanodrop软件检测RNA浓度，-80 ℃低温保存。
1.2.5 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析将提取的总RNA每管浓度定量至100 ng/μL，使用ABScript Ⅲ RT Master Mix for qPCR with gDNA Remover逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA。将逆转录的cDNA用无菌去离子水PCR级稀释20倍，使用荧光定量试剂盒2× Universal SYBR Green Fast qPCR Mix进行RT-qPCR实验，每个样品的反应一式三份进行，预变性：95 ℃，3 min; 循环次数：1次；循环反应：95 ℃，5 s、60 ℃，30~34 s，循环次数：40~45次；溶解曲线：机器自行设置。结果数据用2-ΔΔCt法计算相对表达量。
| 基因 | 序列(5′→3′) | 产物长度/bp |
| p53 | 正向：CTCCTCCCCCCAGCATCTTG 反向：ATAGGTCGGCGGTTCAT |
187 52 |
| Bax | 正向：GACCATCTTTGTGGCTGGA 反向：ATGCCTTTCCCCCCTTCCC |
143 58 |
| Bcl2 | 正向：AAACCCTCCATCCTGTCC 反向：TCCTAAACCCTGCTTCCC |
150 55 |
| β-actin | 正向：GTCCCTCACCCTCCCAAAAG 反向：GCTGCCTCAACACCTCAACCC |
122 150 |
1.2.6 蛋白提取及Western blot检测
TM3细胞处理48 h后，使用预冷的PBS洗涤2次，向每个孔中加入蛋白裂解液RIPA(1 mL RIPA中含有10 μL PMSF)，置于冰盒上裂解30 min。使用干净的刮板刮下细胞，转移至1.5 mL的EP管中，超声破碎细胞裂解悬液，12 000 r/min，4 ℃离心20 min，使用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度并定量。根据体积配置含有5×loading buffer的混合液，100 ℃变性后-20 ℃保存。配制12% SDS-PAGE胶进行电泳，转膜至PVDF膜上，3% BSA室温封闭1 h；4 ℃过夜孵育p53(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶5 000)、Bcl2(1 ∶1 000)、Caspase3(1 ∶1 000)、Caspase9(1 ∶1 000)等抗体，以抗体β-actin(1 ∶1 000)作为内参，1×TBST洗涤3次，室温孵育山羊抗兔IgG(H+L)二抗(1 ∶1 000)，1×TBST洗涤3次；最后配制曝光液曝光，使用Image J软件检测蛋白条带灰度值。
1.3 统计学分析采用GraphPad Prism 9软件进行统计分析与作图。每次实验至少重复3次，数据结果以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析；以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 PS暴露相关男性生殖系统疾病中变化基因的富集分析经CTD数据库筛选(Padjust < 0.05)后共有141个基因与PS暴露的男性生殖系统疾病有关，出现次数排名前10的基因分别为：IL6(12次)，TGFB1(12次)，EDN1(9次)，TNF(9次)，CCL2(8次)，TP53(7次)，GSTP1(6次)，RELA(6次)，CAT(5次)和SOD1(5次)。其中TGFB1和TP53参与细胞增殖与凋亡，提示PS暴露可能影响细胞增殖和凋亡。为进一步探究筛选基因在PS暴露中参与的主要功能和信号通路，对这些变化基因进行KEGG和GO富集分析(图 1)，在KEGG富集通路中，p53信号通路富集明显(P＜0.01)。GO富集分析得到GO条目314个(P＜0.05)，其中生物过程(biological processes，BP)有258个，细胞组分(cellular components，CC)有24个，分子功能(molecular function，MF)有32个，前10的生物学过程主要参与基因转录、细胞凋亡、细胞衰老等。这些富集分析提示细胞凋亡可能在PS-MPs暴露造成的生殖损伤中有重要作用。
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| A: 显著性前35的KEGG富集结果; B: 显著性前10的GO富集结果 图 1 PS-MPs暴露的男性生殖系统疾病中变化基因KEGG和GO富集分析 |
2.2 PS-MPs暴露显著抑制TM3细胞增殖
使用5 μm和80 nm的PS-MPs染毒TM3细胞模型，浓度分别为0、10、20、40 μg/mL。显微镜下观察5 μm PS-MPs处理后的细胞形态，结果显示，对照组细胞较为致密，细胞形态未见明显变化；在10 μg/mL组细胞数量开始减少；20 μg/mL组细胞数量明显减少；40 μg/mL组细胞数量减少最明显(P < 0.01，图 2A)。在80 nm PS-MPs处理组细胞生长也受到明显的抑制，细胞数量同样在高剂量组改变最明显(P < 0.05，图 2B)。而且5 μm PS-MPs组和80 nm PS-MPs组中细胞活力降低均具有剂量-效应关系(图 2C、D)。
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| A: 5 μm PS-MPs暴露48 h细胞形态；B: 80 nm PS-MPs暴露48 h细胞形态; C: 5 μm PS-MPs暴露48 h细胞存活率；D: 80 nm PS-MPs暴露48 h细胞存活率；a: P＜0.05, b: P＜0.01，与0 μg/mL比较 图 2 5 μm和80 nm PS-MPs暴露TM3细胞48 h细胞形态和增殖情况 |
2.3 PS-MPs暴露明显诱导TM3细胞凋亡
为进一步探究PS-MPs抑制TM3细胞增殖的原因，采用流式细胞术检测TM3细胞凋亡情况。结果显示，TM3细胞PS-MPs暴露48 h后，5 μm PS-MPs组和80 nm PS-MPs组随着暴露浓度升高细胞凋亡也增加(P＜0.05)，呈现出良好的剂量-效应关系(图 3)。结果表明5 μm和80 nm PS-MPs均能显著诱导TM3细胞凋亡。
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| A: 5 μm和80 nm PS-MPs暴露TM3细胞48 h流式细胞结果；B: 5 μm PS-MPs暴露TM3细胞48 h细胞凋亡定量分析；C: 80 nm PS-MPs暴露TM3细胞48 h细胞凋亡定量分析; a: P＜0.01，与0 μg/mL比较 图 3 5 μm和80 nm PS-MPs暴露TM3细胞48 h后细胞凋亡 |
2.4 PS-MPs对凋亡分子p53、Bax和Bcl2 mRNA表达的影响
前面通路的富集结果暗示p53信号通路可能参与了PS-MPs导致的TM3细胞凋亡的发生过程。为进一步验证该假设，采用RT-qPCR检测p53信号通路中促凋亡基因p53、Bax以及抑凋亡基因Bcl2的mRNA水平表达。如图 4所示，与对照组相比，5 μm和80 nm PS-MPs暴露48 h后促凋亡基因p53、Bax的mRNA水平显著升高(P＜0.05)，抑凋亡基因Bcl2的mRNA水平明显降低(P＜0.05)。结果表明PS-MPs可能通过p53信号通路诱导TM3细胞凋亡。
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| A~C：5 μm PS-MPs组p53、Bax、Bcl2 mRNA相对表达量；D~F: 80 nm PS-MPs组p53、Bax、Bcl2 mRNA相对表达量；a: P＜0.05, b: P＜0.01，与0 μg/mL比较 图 4 5 μm和80 nm PS-MPs暴露后p53信号通路中关键基因的mRNA表达变化 |
2.5 PS-MPs对p53信号通路关键蛋白表达的影响
PS-MPs暴露TM3细胞后，Western blot检测p53信号通路中p53、Bax、Bcl2、Caspase3和Caspase9蛋白的表达，结果显示，与对照组比较，PS-MPs暴露显著上调促凋亡蛋白p53、Bax、Caspase3和Caspase9的表达(P＜0.05)，显著下调抑凋亡蛋白Bcl2的表达(P＜0.05，图 5)。进一步提示PS-MPs可能通过p53信号通路诱导TM3细胞的凋亡。
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| A：5 μm和80 nm PS-MPs暴露TM3细胞48 h后Western blot检测相关蛋白表达；B~F: 5 μm PS-MPs组p53、Bax、Bcl2、Caspase3、Caspase9蛋白半定量分析；G~K: 80 nm PS-MPs组p53、Bax、Bcl2、Caspase3、Caspase9蛋白半定量分析；a: P＜0.05, b: P＜0.01，与0 μg/mL比较 图 5 5 μm和80 nm PS-MPs暴露后p53信号通路关键基因的蛋白表达变化 |
3 讨论
近年来，由于MPs向环境中释放量增加，人类对MPs的接触和蓄积会随着时间的推移而增加[18]。微塑料在体内各组织器官中长期蓄积可能导致颗粒毒性影响多个器官和系统[19]。近期研究显示，微塑料(MPs)能够对男性生育能力造成威胁，在哺乳动物模型中PS-MPs能够降低精子数量和活力[14]、改变睾丸形态[15]、降低睾酮水平[17]和破坏BTB的完整性[16]。微塑料作为分布较为广泛的新兴污染物，可能是导致雄性生殖能力下降的重要因素之一，值得对其作用和机制开展深入研究。
睾丸间质细胞主要负责睾酮的合成，在精子发生、雄性第二性征、睾丸功能的维持等方面具有重要作用。我们前期的动物体内实验也表明，PS-MPs暴露后睾酮合成显著降低，提示睾丸间质细胞受到损伤。为了揭示其潜在的损伤机制，本研究使用CTD数据库筛选PS与男性生殖系统疾病相关的基因，并使用KEGG和GO对这些相关基因进行富集分析。KEGG明显富集到p53信号通路和细胞凋亡等关键通路，GO富集分析显示PS的生物学过程与细胞凋亡有关，在BP分析中，pol Ⅱ启动子的转录和细胞凋亡两项都同时涉及了正向和负向调控。为了探讨PS-MPs与生殖细胞凋亡之间的关系，使用5 μm和80 nm两种粒径的PS-MPs处理TM3细胞发现，PS-MPs暴露48 h后细胞活力随剂量增加而降低，流式细胞术提示细胞凋亡率逐渐上升，且具有剂量-效应关系。这些结果进一步证实PS-MPs暴露能够导致睾丸间质细胞凋亡，最终影响睾酮合成和水平。p53具有控制细胞周期、调节细胞衰老和启动细胞凋亡的能力[20]，也能够激活促凋亡因子(如Bax)抑制抗凋亡因子(如Bcl2)的表达[21]。同时，p53可激活线粒体和死亡受体诱导凋亡通路进一步诱导Caspase9/3活化，从而导致细胞凋亡。在本研究中，对p53基因及其直接调控的靶基因Bax、Bcl2进行表达检测，分析结果显示，PS-MPs暴露后p53、Bax的mRNA和蛋白表达水平显著升高，下游蛋白Caspase3和Caspase9表达显著上调，而Bcl2的mRNA和蛋白表达水平显著降低。这些数据表明，p53信号通路在PS-MPs导致TM3细胞凋亡的过程中可能起到非常重要的作用，属于正向调控凋亡过程。
研究显示，微米级和纳米级的PS-MPs导致细胞凋亡的器官和效应强度不同。在微米级的PS-MPs中，0.5 μm PS-MPs通过氧化应激和激活NLRP3/Caspase-1通路引起卵巢颗粒细胞凋亡[22-23]，0.5 μm PS-MPs通过激活Wnt/β-Catenin信号通路诱导心脏纤维化和氧化应激导致心肌细胞凋亡[24]，5 μm PS-MPs通过ROS驱动钙过载诱导肝细胞凋亡[25]，0.2、2、10 μm PS-MPs被小胶质细胞内化后引起细胞免疫改变和细胞凋亡[26]。在纳米级的PS-MPs中，60 nm PS-MPs能够蓄积在神经细胞质中，导致神经细胞凋亡[27]，GES-1细胞通过内化纳米级PS-MPs激活RhoA/F-actin信号通路导致细胞凋亡[28]，50、500 nm和5 μm PS-MPs暴露后引起氧化应激，促进MOAP-1表达诱导RBL-2H3细胞凋亡[29]，其中50 nm PS-MPs导致的细胞凋亡最为严重。微米级和纳米级PS-MPs联合暴露导致肠道功能障碍，通过ROS介导肠道上皮细胞凋亡[30]，比单独颗粒PS-MPs暴露时损伤更严重。
本研究显示，无论是微米级的PS-MPs还是纳米级的PS-MPs，它们对睾丸间质TM3细胞的影响具有高度的相似性，提示不同径粒PS-MPs对雄性生殖系统可能具有类似的毒性。PS-NPs通过ERK1/2 MAPK和AKT信号通路激活mTOR/4E-BP1诱导HIF-1表达，下调StAR表达导致小鼠睾酮水平降低[31]；PS-MPs暴露Nrf2/HO-1/NF-κB途径引起的ICR小鼠精子质量异常[15]；微塑料对生殖细胞凋亡之外的还可能存在其他机制，还需要后续更为深入的机制研究。
综上，本研究结果显示PS-MPs能够诱导TM3细胞凋亡，伴随着p53信号通路关键基因的激活，提示p53信号通路可能在PS-MPs诱导的细胞凋亡中发挥着关键作用，这为进一步研究PS-MPs诱导细胞凋亡及相关通路提供了前期资料。
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