2. 322000 浙江 义乌，浙江大学医院感染管理科;
3. 400016 重庆，重庆医科大学附属第一医院消化内科
2. Department of Infection Management, Fourth Affiliated Hospital, Zhejiang University, Yiwu, Zhejiang Province, 322000;
3. Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400016, China
结直肠癌是全球范围内常见的恶性肿瘤之一，在肿瘤导致的死亡中位居第三。目前，无远处转移的结肠癌患者5年总生存期率较高，一旦发生转移，5年总生存率低于15%[1]。因此，识别灵敏度、特异度较高的生物标志物对预测结肠癌患者的预后至关重要。
焦亡是由Gasdermin蛋白家族(GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME和PJVK)参与的新型程序性细胞死亡形式，涉及细胞溶解和炎症反应等过程[2-3]。目前普遍认为焦亡发挥作用的途径主要有3种：①依赖Caspase-1的经典途径；②依赖Caspase-4、5、11的非经典途径；③依赖Caspase-3的焦亡途径，通过这些途径切割GSDMD或GSDME，从而引起质膜破裂、孔洞形成、细胞质肿胀和染色质凝结[4]。越来越多的研究表明，焦亡在许多癌症[5]的发生发展中发挥重要作用。在胃癌中，下调GSDMD可以通过PI3K/AKT、STAT3、ERK信号通路促进肿瘤的进展[6]。在结肠炎相关的结直肠癌中，GSDME可能通过HMGB1影响ERK1/2通路调控肿瘤的进展[7]。同时，诱导焦亡可增加结肠癌细胞[8]的化学敏感性。但焦亡作为一种新型的程序性死亡模式，在结肠癌预后中的研究尚不深入。因此，寻找焦亡相关的预后标记物可能成为指导结肠癌患者治疗的新突破。
生物信息学发展日新月异，可以利用前人的研究数据，高效挖掘、分析数据，获得预后标志物。长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是由200多个核苷酸组成的非蛋白编码转录体，越来越多的研究表明，lncRNA可以通过介导代谢途径的代谢酶、转录因子和其他蛋白质的翻译后修饰过程影响肿瘤的能量代谢，从而影响肿瘤的进展[9]，lncRNA作为癌症的新型生物标志物和治疗靶点具有很强的前景[10]。本研究通过生物信息学方法挖掘焦亡相关lncRNA并构建预后模型，通过共表达、突变和差异分析得到焦亡相关基因，为后续的基础研究提供新的方向。
1 材料与方法 1.1 共表达和差异分析从TCGA数据库(http://tcga-data.nci.nih.gov./Tcga/)下载结肠癌患者的转录组数据和配对的临床资料，从文献[11-14]中检索到52个与焦亡相关基因。在R语言(4.0.4版本)中运行“limma”包，以相关系数过滤标准(|corFilter|)>0.4，且P值< 0.05为共表达分析检验标准；以log2|fold change|(log2FC)>1.5，且错误发现率(false discovery rate，FDR) < 0.05为差异分析检验标准。再将共表达和差异分析结果取交集，从而得到存在差异表达的焦亡相关lncRNA。
1.2 焦亡相关lncRNA预后模型的建立及评价采用分层随机抽样方法，按照1 ∶1分为训练组和验证组。在训练组中使用单因素Cox回归分析筛选预后相关lncRNA，通过多因素Cox回归分析和LASSO回归筛除冗余lncRNA，随后构建焦亡相关预后模型。
计算
整合所有预后相关因素(性别、年龄、分期和风险评分)，通过R语言“survival”包和“regplot”包来构建列线图模型，用于预测结肠癌患者1、3和5年OS。
1.4 突变分析和共表达网络的构建在TCGA数据库下载结肠癌样本突变数据，运用R语言“maftool”包[15]绘制瀑布图，实现突变数据可视化，计算每个结肠癌样本的肿瘤突变负荷(tumor mutation burden，TMB)=突变碱基个数/百万碱基，比较高、低风险两组间TMB的统计学差异。通过“limma”包筛选差异表达的基因，检验标准P值< 0.05。
提取预后相关lncRNA及焦亡基因的表达数据，以相关系数过滤标准(|corFilter|)>0.4，且P值< 0.05为共表达分析检验标准，用Cytoscape软件将共表达网络关系可视化，结合差异分析结果，得到可能调控预后的焦亡基因。
1.5 免疫组化验证收集2017-2020年重庆医科大学附属第一医院接受结直肠癌手术切除的64例结肠癌组织和32例配对癌旁组织，本研究获得重庆医科大学附属第一医院伦理委员会审批(2017-121)。一抗使用兔抗人SCAF11抗体(Thermo Fisher, 1 ∶20；美国)，二抗使用羊抗兔抗体(Proteintech, 1 ∶200；中国)，具体操作方法参照陈玲等[16]的研究，2名病理学专家确定免疫反应评分(IRS)。每张切片取4个不同视野，每个视野中，根据染色强度评分为0~3分(0分：无染色，1分：低染色，2分：中等染色，3分：高染色)，根据阳性染色细胞的百分比评为0~4分(0分：阳性细胞＜1%，1分：阳性细胞1%~10%，2分：阳性细胞＞10%~50%，3分：阳性细胞＞50%~80%，4分：阳性细胞＞80%)。将平均强度和阳性染色细胞的百分比相乘得到IRS值，2名专家评分的平均值>4分为高表达[17]。
1.6 统计学分析使用R语言(4.0.4版本)、Cytoscape(3.6.0版本)软件进行生物信息学分析并绘制图像，对定量资料进行Kolmogorov-Smirnov正态性检验，不符合正态分布的两组独立样本间的定量资料使用Wilcoxon符号秩检验；定性资料比较采用χ2检验。P < 0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 差异表达的焦亡相关lncRNA的筛选从TCGA数据库下载473例结肠癌组织和41例癌旁组织的基因测序数据，共表达分析提取出1 634个焦亡相关lncRNA，与1 847个差异表达lncRNA取交集，得到388个差异表达的焦亡相关lncRNA。火山图展示差异表达的焦亡相关lncRNA分布情况，桑葚图展示焦亡相关基因和差异lncRNA之间的相互关系。见图 1。
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| A：火山图示lncRNA表达差异情况；B：韦恩图示焦亡相关的lncRNA和差异表达lncRNA之间的交叉关系；C：桑葚图示焦亡相关基因和差异表达的焦亡相关lncRNA的对应关系 图 1 差异表达的相关lncRNA的获取 |
2.2 结肠癌患者焦亡相关的差异lncRNA预后模型的构建
在临床数据中排除了随访时间 < 30 d的结肠癌患者，采用分层随机抽样法，将筛选出的466例结肠癌样本分为训练组(224例)和验证组(222例)，合并表达数据和生存数据。在训练组中通过单因素COX回归分析初步筛选到9个与预后相关的lncRNA(图 2A)，随后通过多因素COX回归、Lasso回归分析进行筛选，最后得到5个预后相关的lncRNA，并绘制森林图(图 2B~D)。
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| A：单因素回归分析筛选预后相关的lncRNA；B、C：LASSO回归分析进一步消除冗杂因素；D：多因素回归分析筛选最终lncRNA 图 2 DEPlncRNA风险预后模型的构建 |
2.3 模型准确度和预测性能的评价
计算训练组中每例结肠癌患者的风险评分，根据风险评分的中位值(M=0.994)分为高风险组和低风险组，绘制出风险评分曲线图、预后相关lncRNA的热图。Kaplan-Meier生存分析结果显示，高风险组患者生存率较低风险组更低。ROC曲线结果表明该模型可以较好地预测结肠癌患者1、2、3年的生存情况。结果可在验证组和全组中重复。见图 3。
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| A~F：结肠癌患者生存风险曲线；G~I：预后lncRNA表达热图；J~L：Kaplan-Meier生存曲线；M~O：时间依赖性ROC曲线 图 3 差异表达的焦亡相关lncRNA风险预后模型的验证 |
2.4 预后模型与临床病理特征的关系
在测试组、验证组和全组中依次对高、低风险组患者进行单因素和多因素COX回归分析，结果显示：在3组中分期(P < 0.001)、风险评分(P < 0.001)为结肠癌患者独立预后影响因素(图 4A~F)。纳入年龄、性别、分期和风险评分构建列线图，在测试组、验证组和全组中结肠癌患者1、3、5年的生存率可以通过从整体点轴上画一条垂直线来确定(图 4G~I)。该列线图可有效预测结肠癌患者的短期和长期生存率，比单个诊断因素准确性更高。
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| A~C：各组单因素COX回归独立预后分析；D~F：各组多因素COX回归独立预后分析；G~I：各组列线图预测结肠癌患者1、3、5年生存率 图 4 预后模型与临床病理特征的关系 |
2.5 焦亡相关基因突变和差异分析
突变分析结果显示：399个样本中，297个样本有碱基突变，突变率为74.44%，其中TP53、NLRP7、SCAF11、NLRP1、NLRP2是突变率较高的基因(图 5A)。对高、低风险组结肠癌患者TMB进行Wilcoxon符号秩检验，结果显示：高风险组较低风险组有更高的肿瘤突变负荷(P＜0.01，图 5B)。对52个焦亡相关基因的表达量进行Wilcoxon符号秩检验，结果发现：28个基因的表达量在肿瘤和正常组织间差异有统计学意义(P＜0.05，图 5C)。
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a：P < 0.05，b：P < 0.01 A：焦亡相关基因在结肠癌样本中的突变瀑布图；B：高、低风险组结肠癌样本的突变负荷；C：焦亡相关基因在正常和结肠癌组织中的表达 图 5 焦亡相关基因突变和差异分析 |
2.6 共表达网络展示lncRNA和基因的相互作用关系，并通过免疫组化验证SCAF11的表达
共表达网络图直观地展示了基因和lncRNA之间的相互关系，结合共表达分析、突变分析和差异分析结果，得到5个关键的焦亡相关基因：SCAF11、IL1A、PJVK、CHMP2A、CHMP6(图 6)。SCAF11在肿瘤样本中有更高的突变频率，因此选择SCAF11进行进一步探索。采用免疫组化实验检测SCAF11在结肠癌和癌旁组织中的表达，结果显示：与癌旁组织相比，结肠癌组织中SCAF11的表达更高(P＜0.05，表 1)，免疫组化染色情况见图 7。
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| 图 6 差异预后lncRNA和焦亡相关基因的共表达网络 |
| 组织 | n | SCAF11 高表达 |
SCAF11 低表达 |
χ2值 | P值 |
| 癌旁组织 | 32 | 9 | 23 | 19.433 | < 0.05 |
| 结肠癌组织 | 64 | 48 | 16 |
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| A：癌旁组织；B：结肠癌组织 图 7 免疫组化验证SCAF11在不同组织中的表达 |
3 讨论
lncRNA在细胞中分布广泛、功能复杂，目前发现主要有以下功能：①通过和miRNA内源性竞争影响miRNA靶基因的表达[18]；②细胞核中的lncRNA可以与DNA和蛋白质结合，参与调控染色质、转录和RNA加工；③细胞质中的蛋白质通过与mRNA或蛋白质结合，调节mRNA稳定性、翻译和细胞级联反应[19]。因为其复杂的功能，所以在肿瘤的调控中发挥广泛作用。NAKASHIMA等[20]研究表明lncRNA(HOXA11-AS)可以通过调控NQO1和NQO2调节口腔鳞状细胞癌的进展。ZHU等[21]的研究表明lncRNA(MIR4435-2HG)的表达与儿童肠息肉大小及结肠癌细胞增殖、侵袭能力有关。
焦亡是一种新型程序性细胞死亡方式，与癌症的发展有关[5]。CHU等[22]研究表明，焦亡信号通路参与肝癌的发生发展，并可能成为治疗的靶点。TAN等[7]研究表明，焦亡在结肠癌的生长和转移中起着重要作用。结合lncRNA和焦亡在肿瘤进展中的重要作用，本研究基于TCGA临床和表达数据，构建焦亡相关的lncRNA预后模型，帮助临床评估患者预后。因此，lncRNA和焦亡基因的结合研究对结肠癌的机制探索有更加重要的意义，希望可以为结肠癌患者提供新的治疗靶点。
lncRNA作为一个“桥梁”分子，主要通过调节基因的表达发挥对肿瘤的生物学调控作用。因此本研究首先构建一个框架，一方面建立一个lncRNA预后模型，一方面通过共表达分析寻找其潜在调控基因，最后通过整合预后模型和共表达分析结果，探究lncRNA对预后的影响是否通过相关基因发挥作用，构建一个lncRNA-基因-预后调节框架。从目前焦亡在肿瘤中的研究成果分析，焦亡很可能在结肠癌预后中发挥不可或缺的作用，但如何影响结肠癌患者的预后，目前研究尚不深入。因此，本研究以焦亡相关基因为研究对象，通过生物信息学分析探索出一条具体lncRNA-基因-焦亡-预后调节通路。
本研究通过相关文献得到52个焦亡相关基因，随后下载TCGA临床和表达数据，为了提高模型的准确性，将数据分为训练组和验证组，将训练组构建的lncRNA预后模型在验证组和全组中重复验证，提高预后模型的准确性，找到更加精准的预后分子，通过构建预后模型和共表达分析，最终找到5个lncRNA和5个焦亡相关基因。部分基因在其他肿瘤中做过相关研究，例如FU等[23]的研究表明SCAF11在肝癌中可以作为独立的预后因素，并通过初步实验验证SCAF11在肿瘤组织中mRNA高表达。此外，IL1A炎症细胞因子的激活与西妥昔单抗在结肠癌治疗中效果受损有关[24]，PJVK在GEO数据库构建的结肠癌预后模型中也是预后因子[25]，在头颈鳞状细胞癌模型中CHMP2A可以通过分泌表达MICA/B和TRAIL的细胞外囊泡介导肿瘤对NK细胞的耐药性[26]，CHMP6也与肾上腺皮质癌患者预后有关[27]。本研究通过突变分析这5个基因中作用最显著的焦亡相关基因，结果显示SCAF11突变频率最高，于是选择SCAF11完成后续相关研究。
SCAF11作为一个焦亡相关基因，KOLB等[28]研究表明，Caspase-1(CASP1)-/-的老鼠经常伴随着SCAF11(Casp11)的丢失，研究推测SCAF11通过Caspase-1介导的经典焦亡途径调控焦亡过程；此外从WiKipathway(https://www.wikipathways.org/index.php/WikiPathways)通路分析可知SCAF11(Casp11)可以调控Caspase-1和Caspase-3，说明SCAF11可能通过依赖Caspase-3的焦亡途径参与焦亡的调控。因此SCAF11是一个焦亡相关基因。本研究通过初步免疫组化染色分析，提示SCAF11在癌组织中高表达，说明SCAF11可能在结肠癌中发挥癌基因的作用，lncRNA-SCAF11-焦亡-预后调节模式很可能在结肠癌的预后中发挥关键作用。但具体哪个lncRNA以及是否通过SCAF11发挥作用，目前尚不明确，也是本研究的不足。接下来将继续完成SCAF11在结肠癌细胞中的功能实验，通过基因编辑技术探索具体的调控方式, 为焦亡在结肠癌中的研究奠定基础。
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