2. 400042 重庆，陆军特色医学中心野战外科研究部特殊环境战伤防治研究室，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室
2. State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injuries, Department of Special Environment War Wound Prevention and Treatment, Institute of Surgery Research, Army Medical Center of PLA, Chongqing, 400042, China
脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)在青壮年人群中致残率高，临床上难以获得功能的完全康复。SCI后轴突的脱髓鞘改变损害了正常的传导特性，导致运动、感觉和自主功能障碍。因此，再髓鞘化是恢复SCI后机体功能的重要治疗靶点。少突胶质前体细胞(oligodendrocytes precursor cells，OPCs)在脱髓鞘损伤后会被激活，随后增殖并迁移到病变部位，根据微环境变化激活髓鞘基因相关转录程序，并分化为少突胶质细胞(oligodendrocytes，OLs)，成熟的OLs将细胞质突起包裹在裸露的轴突周围，从而形成新的髓鞘[1]。自发性髓鞘再生在损伤后会启动[2]，但这种内源性再生能力极为有限：损伤会导致OPCs和OLs的丢失；即使大量的OPCs会募集到病变部位，其分化成OLs的过程通常受阻；存活下来的OLs是否能够促进髓鞘修复目前也存在不同的观点[3-5]。长期脱髓鞘会造成轴突萎缩、神经变性，从而导致疾病进展。因此，外源性干预促进SCI后髓鞘的修复受到广泛的关注。运动训练是SCI患者康复治疗中必不可少的一部分。研究报道，连续3周的强制性跑台运动能够促进正常小鼠胼胝体的适应性髓鞘形成[6]；对脱髓鞘模型动物(如实验性自身免疫性脑脊髓炎、饲铜、溶血磷脂毒素诱导)采取运动训练(如游泳、自愿跑轮)能够减少髓鞘丢失或促进髓鞘再生[7-9]。然而，既往的研究主要基于运动对髓鞘状态的观察，运动对SCI后少突胶质谱系细胞演变特别是OPCs的增殖、分化以及髓鞘化的影响尚不清楚。因此，本研究以促进SCI后髓鞘再生为切入点，探讨跑台训练对成年小鼠脊髓损伤后髓鞘结构修复过程及运动功能恢复的影响。
1 材料与方法 1.1 实验动物与分组42只6~8周、体质量18~20 g的C57/BL雌性小鼠，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK(湘)2019-0004。饲养于12 h/12 h昼夜交替、室温25~28 ℃、湿度40%~60%的通风环境中，给予自由饮食。其中，12只小鼠分为假手术组和SCI组(n=6)用于验证SCI模型；30只小鼠按照随机数字表法分为3组：假手术组、SCI组、跑台训练组(n=10)。模型验证小鼠于术后2周取材，其余小鼠于术后5周取材。实验按照重庆医科大学动物伦理委员会相关规定进行。
1.2 SCI模型制备腹腔注射0.5%戊巴比妥钠(100 mg/kg)麻醉小鼠，消毒备皮，切开背部皮肤，以颈背部脂肪垫为参照，脂肪垫下缘第一个棘突为T9，再往下一个棘突即为T10。钝性剥离筋膜和肌肉，去除T10棘突及椎板，暴露脊髓。假手术组接受椎板切除，但不损伤脊髓。SCI组和跑台训练组接受SCI，模型制备采用改良Allen’s击打仪(美国罗格斯大学W.M. Keck Center for Collaborative Neuroscience的Wise Young教授惠赠)，损伤部位为左背侧脊髓白质(避开中央血管)，致伤强度为2.5 mm×5 g。致伤后缝合背部肌肉及皮肤，给予皮下注射0.5 mL的0.9%生理盐水补液，放回笼中并观察记录术后情况。术后1周内，每日对小鼠进行3次人工膀胱排空。
1.3 跑台训练方案实验前对小鼠进行5 d的预训练，速度为9 m/min，训练时间为20 min。正式训练在SCI后1周开始，初始速度(热身速度)为9 m/min[10]，持续5 min；一级速度为12 m/min[11]，持续25 min；30 min/次，1次/d，5 d/周，共训练4周。假手术组和SCI组则放在静止的跑道中待30 min。
1.4 dCST顺行示踪取材前2周对小鼠进行BDA注射。腹腔注射0.5%戊巴比妥钠麻醉小鼠，消毒备皮，沿头颅矢状线划开头部皮肤，暴露前囟，使用牙科钻于前囟右侧开一个颅窗，后将小鼠固定于立体定位仪上，微量注射器中吸取10% BDA溶液2.4 μL(D1956，Thermo Fisher，美国)备用。定位前囟，沿着中线向前0.5 mm、向后0.5 mm，旁开0.8 mm和1.2 mm，深0.7 mm，共4个位点进行注射，0.6 μL/位点，速度为0.2 μL/min，每个位点注射后滞针3 min，后缓慢退针。注射完毕，缝合头部皮肤并消毒，放回笼中观察、记录。
1.5 灌注、取材与冰冻切片每组取7只小鼠进行免疫荧光染色检测。过量麻醉小鼠后，依次使用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，C0103，博奥森，北京)和4% 多聚甲醛溶液(PFA，科隆，成都)对小鼠进行经心灌注，灌注后取出小鼠大脑及下胸段脊髓，4 ℃下在4% PFA溶液中固定24 h，然后在18%、24%、30%的蔗糖溶液中梯度脱水，使用O.C.T.组织包埋剂(4583，Sakura，美国)包埋，沿着大脑冠状面和脊髓横切面进行18 μm冰冻切片(Cryo Star NX50，赛默飞，中国)。
1.6 免疫荧光染色冰冻切片室温复温15 min；0.01 mol/L PBS浸洗3次，每次8 min；0.3% Triton(T8787，Sigma，美国)通透30 min；0.01 mol/L PBS浸洗3次，每次8 min；使用免疫荧光封闭液(P0260，碧云天，上海)室温封闭60 min；加入一抗后室温过夜孵育，一抗分别为：兔来源抗GFAP抗体(1∶2 000；PA1-10019，赛默飞，中国)，山羊来源抗血小板源性生长因子受体α(platelet-derived growth factor receptor α，PDGFRα)、抗体(1∶100；AF1062，R&D systems，美国)，兔来源抗Ki67抗体(1∶300；AB9260，Millipore，美国)，兔来源抗少突胶质细胞转录因子2(oligodendrocyte transcription factor 2，Olig2)抗体(1∶200；1D-710，IBL，日本)，小鼠来源抗腺瘤性结肠息肉病蛋白(adenomatous polyposis coli protein，APC/CC1)抗体(1∶500；OP80，Millipore，美国)，大鼠来源抗髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)抗体(1∶500；MAB386，Millipore，美国)；次日，倒去一抗，0.01 mol/L PBS浸洗3次，每次8 min；加入Alex Fluor-488和Alex Fluor-594标记的驴来源抗兔、山羊、小鼠和大鼠的荧光二抗(1∶400，Jackson Laboratories，美国)后室温避光孵育60 min；0.01 mol/L PBS浸洗3次，每次8 min；使用DAPI(0.5 μg/mL；Sigma，美国)染细胞核，避光孵育2 min；0.01 mol/L PBS浸洗3次，每次8 min；洗涤后晾干封片；静置于4 ℃冰箱中2~3 h，然后在激光共聚焦显微镜(A1+R，Nikon，日本)下观察染色情况，使用Image J对图像进行细胞计数和平均荧光强度分析。
1.7 透射电镜(transmission electron microscope，TEM)观察每组取3只小鼠，过量麻醉后，依次使用0.01 mol/L PBS、4% PFA、2.5% 戊二醛(G916055，麦克林，上海)混合溶液对小鼠进行经心灌注，灌注后取出小鼠下胸段脊髓，放在戊二醛溶液中于4 ℃冰箱保存，脱水、包埋、切片。12 000倍拍摄左侧dCST区。使用Image J测量和计算髓鞘厚度参数G-ratio(等于轴突直径除以纤维直径)。
1.8 小鼠左后肢运动功能评估(basso mouse scale，BMS)评分将小鼠放在1个空旷的场地并观察4 min，正式评估之前先让小鼠进行环境预适应以保证评估结果准确。于伤前，损伤后1周，训练后1、2、4周使用BMS评估小鼠的左后肢粗大运动情况[12]。
1.9 统计学分析采用GraphPad Prism 8进行数据统计分析。结果以 x±s表示。采用Anderson-Darling test进行正态性检验。采用Kruskal-Wallis test非参数检验和Dunn’s multiple comparisons test事后组间比较分析G-ratio。采用双因素方差分析(two-way ANOVA)和Tukey’s multiple comparisons test事后组间比较分析小鼠BMS得分。其余数据均采用单因素方差分析，并采用Tukey’s multiple comparisons test进行事后组间比较。P < 0.05被认为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 SCI模型成功建立本模型主要观察部位为T10左侧dCST区(图 1A)。免疫荧光染色和TEM结果显示，相比于假手术组小鼠，SCI组小鼠脊髓左背侧白质出现胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)阳性的细胞数量增加，提示星形胶质细胞增生(图 1B)；左侧dCST区域出现广泛的髓鞘变薄、分层(图 1C)。以上结果表明，本实验成功建立了T10脊髓轻度挫伤模型，为后续研究髓鞘修复奠定了模型基础。
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| A：T10脊髓冠状面示意图 红色线框：示左侧dCST区；B：免疫荧光染色观察左侧dCST区GFAP阳性星形胶质细胞激活情况 绿色：示GFAP；C：透射电镜观察左侧dCST区髓鞘结构情况 图 1 小鼠SCI模型的建立与鉴定(n=6) |
2.2 跑台训练增强SCI后dCST区OPCs的增殖能力
免疫荧光双标染色(图 2A)结果显示，SCI组左侧dCST区内处于增殖状态的OPCs(PDGFRα/Ki67双阳性)与总OPCs(PDGFRα阳性)的比值较假手术组显著减少(0.59±0.06 vs 0.92±0.01，P < 0.01，图 2B)，跑台训练组左侧dCST区内处于增殖状态的OPCs与总OPCs的比值较SCI组有所增加(0.77±0.03 vs 0.59±0.06，P < 0.01，图 2B)。以上结果表明，跑台训练增强SCI后dCST区OPCs的增殖能力。
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| A：免疫荧光染色观察左侧dCST区OPCs的增殖情况 红色：示PDGFRα(标记OPCs)，绿色：示Ki67(标记增殖状态的细胞)，蓝色：示DAPI(标记细胞核)；B：各组小鼠左侧dCST区PDGFRα/Ki67双阳性细胞数量与PDGFRα阳性细胞数量的比值(n=7，x±s) a：P < 0.01，与假手术组比较；b：P < 0.01，与SCI组比较 图 2 跑台训练增强实验小鼠SCI后dCST区OPCs的增殖能力 |
2.3 跑台训练促进SCI后dCST区OLs的成熟
免疫荧光双标染色(图 3A)结果显示，SCI组左侧dCST区内成熟的OLs(Olig2/APC/CC1双阳性)与少突胶质谱系细胞(Olig2阳性)的比值较假手术组显著降低(0.52±0.07 vs 0.89±0.06，P < 0.01，图 3B)，跑台训练组左侧dCST区内成熟的OLs与少突胶质谱系细胞的比值较SCI组显著增加(0.75±0.02 vs 0.52±0.07，P < 0.01，图 3B)。以上结果提示，跑台训练促进SCI后dCST区OLs的成熟。
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| A：免疫荧光染色观察左侧dCST区OLs的成熟情况 绿色：示Olig2(标记少突胶质谱系细胞)，红色：示APC/CC1(标记OLs)，蓝色：示DAPI；B：各组小鼠左侧dCST区Olig2/APC/CC1双阳性细胞数量与Olig2阳性细胞数量的比值(n=7，x±s) a：P < 0.01，与假手术组比较；b：P < 0.01，与SCI组比较 图 3 跑台训练促进实验小鼠SCI后dCST区OLs的成熟 |
2.4 跑台训练增加SCI后dCST区MBP的表达并促进髓鞘形成
于小鼠右侧皮层M1区注射BDA，顺行示踪左侧dCST(图 4A)。免疫荧光双标染色(图 4B)结果显示：相比于假手术组(51.44±1.45)，SCI组左侧dCST区内MBP平均荧光强度显著下降[(30.17±2.89)，P < 0.01，图 4C]；而跑台训练组左侧dCST区内MBP的平均荧光强度较SCI组有所增加且具有统计学差异[(39.58±2.63) vs (30.17±2.89)，P < 0.01，图 4C]。
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| A：免疫荧光染色观察大脑右侧皮层M1区BDA注射情况与脊髓左侧dCST区BDA示踪情况 红色：示BDA，蓝色：示DAPI；B：免疫荧光染色观察左侧dCST区BDA阳性轴突和MBP阳性髓鞘染色情况 红色：示BDA，绿色：示MBP；C：各组小鼠左侧dCST区MBP平均荧光强度统计结果(n=7，x±s) a：P < 0.01，与假手术组比较；b：P < 0.01，与SCI组比较 图 4 跑台训练增加实验小鼠SCI后dCST区MBP的表达 |
TEM观察髓鞘结构显示：假手术组左侧dCST区中髓鞘结构完整致密；SCI组存在广泛、严重的脱髓鞘或髓鞘变薄、分层以及轴突萎缩的情况；而跑台训练组脱髓鞘程度较轻，轴突保留相对较好(图 5A)。G-ratio是一种描述髓鞘厚度的参数，等于轴突直径除以纤维直径，比值等于1时表示脱髓鞘。统计结果显示：SCI组左侧dCST区G-ratio较假手术组显著增加(0.83±0.05 vs 0.69±0.04，P < 0.01，图 5B)，跑台训练组左侧dCST区G-ratio较SCI组有所降低(0.77±0.04 vs 0.83±0.05，P < 0.01，图 5B)。以上结果表明，跑台训练增加SCI后dCST区MBP的表达并促进髓鞘修复。
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| A：透射电镜观察左侧dCST区髓鞘结构情况；B：各组小鼠左侧dCST区G-ratio分析(n=3，x±s) a：P < 0.01，与假手术组比较；b：P < 0.01，与SCI组比较 图 5 跑台训练降低实验小鼠SCI后dCST区的G-ratio |
2.5 跑台训练对SCI小鼠BMS评分结果的影响
BMS评分结果显示(图 6)：损伤后1周及训练后1、2周，SCI组BMS评分均较假手术组显著减少(分别为3.10±1.60 vs 9.00±0.00、4.20±1.32 vs 9.00±0.00、5.50±1.43 vs 9.00±0.00，P < 0.01)；在损伤后各个时间点中跑台训练组BMS得分逐渐提高，但与SCI组比较无统计学差异(3.10±1.29 vs 3.10±1.60，4.50±0.71 vs 4.20±1.32，5.70±0.82 vs 5.50±1.43，8.20±1.03 vs 8.10±1.10，P > 0.05)。以上结果表明，跑台训练对SCI小鼠后肢运功功能恢复的作用不显著。
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| a：P < 0.01，与假手术组比较 图 6 各组小鼠BMS评分结果(n=10，x±s) |
3 讨论 3.1 轻度脊髓挫伤模型成功建立
皮质脊髓束(corticospinal tract，CST)是由运动皮层直接投射到脊髓的信号传导束，是产生自主运动的关键；而SCI导致下行传导束的结构或功能受损，造成来自大脑信号突然且持续地丧失，从而影响了运动功能。因此，本研究着重观察SCI后CST及后肢运动功能。挫伤是脊髓短暂地受到物理冲击，与临床上大多数SCI患者发病原因相似[13]。团队前期开发了一种诱导小鼠dCST脱髓鞘的模型：采用改良Allen’s击打仪制备轻度脊髓挫伤模型，从而造成轴突大部分保留和广泛性脱髓鞘[14]。本研究沿用该模型，发现SCI后脊髓背侧白质出现GFAP阳性的星形胶质细胞增生，并且dCST区域出现广泛的髓鞘变薄、分层，这与前期研究结果相一致，表明本研究成功建立了SCI模型，这为接下来研究SCI后髓鞘修复奠定了模型基础。
脱髓鞘后最初的2周内，OPCs在病变处迅速聚集，随后增殖并分化为OLs，进而形成新的髓鞘结构[15]。然而，这种自发的髓鞘再生是远远不够的。在慢性脱髓鞘部位中，尽管有大量的OPCs迁移到病变区域，但这些OPCs出现分化阻滞[16]。因此，促进OPCs的分化是髓鞘修复的关键。文献报道，OLs中过表达Olig2的转基因小鼠在溶血磷脂胆碱诱导的胼胝体脱髓鞘后显示出OPCs分化能力和再髓鞘化能力增强[17]。在脱髓鞘模型的动物实验中也显示出细胞移植在促进OPCs增殖和分化上的效果[18-19]。然而，病毒传递、基因调控和侵入性的手术干预在临床转化中仍存在一些局限。通过硬膜外电刺激、化学遗传学技术来激活神经元活动以促进OPCs分化和OLs成熟的相关研究已为经颅电刺激等非侵入性神经肌肉调节技术在临床SCI患者中的应用提供了强有力的证据[14, 20]。而运动是一种需要患者主动参与的治疗方法，更加符合康复医学的理念；在动物实验中也发现运动能够减少髓鞘丢失或促进髓鞘再生：运动训练可以增加高脂饮食小鼠脊髓中髓鞘蛋白脂蛋白(proteolipid protein，PLP)和MBP表达，减少高脂饮食导致的OPCs和OLs丢失[21]。在溶血磷脂毒素诱导小鼠脊髓脱髓鞘后，立即进行自愿跑轮训练可以促进OLs的形成，增加再生髓鞘的厚度[9]。运动还能调节慢性脑低灌注小鼠小胶质细胞和星形胶质细胞的表型，促进髓鞘碎片清除和OPCs的增殖和分化，从而修复白质和改善认知功能[22-23]。由此可见，运动在促进髓鞘修复方面有很大的潜力。
3.2 跑台训练的适宜时机SCI后大量OLs死亡、髓鞘结构紊乱、CNS常驻免疫细胞被激活并与浸润的外周白细胞一起引起炎症[24]，同时继发性损伤如水肿、缺血、兴奋性毒性、氧化应激和自由基积累也随之而来[25]。在这种环境下，过早地开始运动训练可能会加重损伤程度。然而，若运动训练开始时间太晚，在慢性期局部有大量死亡细胞碎片、损伤后反应性星形胶质细胞激活导致胶质瘢痕的形成可能会阻碍轴突再生和髓鞘修复，神经功能下降导致神经对运动训练的敏感性降低，从而影响治疗效果[26-27]。此外，研究显示，胸髓挫伤模型动物多数采取在SCI后1周进行跑台运动的方式进行[11, 28]，因此，本研究在SCI后1周开始跑台训练。JAMES等[29]发现小鼠脊髓挫伤后1周内脊髓背侧上行柱轴突传导完全阻滞，在亚急性期(2~4周)内恢复一定程度的传导能力，在慢性期(3 ~6个月)传导能力没有进一步改善。BACMEISTER等[4]对脱髓鞘模型小鼠的前肢运动皮层进行纵向双光子成像，结果显示，脱髓鞘后神经元会立即表现出高度兴奋，此时小鼠的学习能力受损，进行前肢伸取训练会短暂地抑制OLs的生成，但延迟训练(脱髓鞘后10天)则增加了OPCs分化和OLs的生成，表明运动训练和OLs之间存在复杂的动力学关系。本研究在SCI后1周开始进行4周的跑台训练可能可以在内源性髓鞘修复的基础上维持并提高脱髓鞘轴突的髓鞘再生能力。然而，目前尚不清楚脱髓鞘期间进行运动是否有协同或者拮抗作用，团队后续将对SCI后运动时间进行探索，优化运动时间以在内源性髓鞘修复基础上驱动更强有力的髓鞘再生。
3.3 跑台训练促进OPCs增殖、OLs成熟和髓鞘化本研究采用了OPCs标记物(PDGFRα)与Ki67免疫荧光共染来检测OPCs的增殖状况，发现跑台训练组左侧dCST区内处于增殖状态的OPCs在总OPCs中的占比高于SCI组，表明跑台训练增强了损伤后OPCs的增殖能力，这一结果支持了先前的报道。本研究使用少突胶质谱系细胞标记物(Olig2)和成熟的OLs标记物(APC/CC1)免疫荧光共染来检测OLs的成熟情况，发现跑台训练组左侧dCST区内成熟的OLs在少突胶质谱系细胞中的占比较SCI组显著增加，证实了跑台训练增加了SCI后dCST区中成熟的OLs的数量。显然，这是跑台训练促进损伤后髓鞘再生的关键一步。接着，本研究采用免疫荧光染色和TEM来观察髓鞘结构。皮质注射BDA可以更好地标记dCST。我们发现跑台训练组dCST区内BDA阳性轴突周围的MBP表达强度比SCI组高；电镜也观察到跑台训练降低了G-ratio，即髓鞘厚度更大，表明跑台训练能够改善dCST轴突髓鞘化情况。
3.4 跑台训练促进髓鞘修复的机制探讨在分子机制方面，我们考虑运动促进髓鞘修复可能与以下这些途径相关：①本团队前期发现，跑台训练可以提高SCI小鼠运动皮质中脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor，IGF-1)水平[10]。而BDNF在脱髓鞘后OPCs的招募中发挥作用。VONDRAN等[30]发现双环己酮草酰二腙(cuprizone，CPZ)诱导的脱髓鞘引起胼胝体中BDNF蛋白水平降低，BDNF杂合缺陷小鼠在脱髓鞘后出现OPCs增殖减少、MBP表达降低，表明BDNF可能通过调节脱髓鞘损伤后的OPCs数量以及髓鞘相关蛋白的表达来发挥作用。OPCs成功通过G2/M期对细胞周期的退出和随后分化成能够形成髓鞘的OLs在髓鞘发育或者髓鞘修复过程中是必要的。MIN等[31]在体外验证了IGF-1能够加速OPCs的G2/M期进程。此外，IGF-1还参与招募的OPCs分化为OLs[32]。由此可以推测，跑台训练可能通过提高如BDNF和IGF-1等生长因子和营养因子的表达等来促进OPCs的增殖、分化和OLs的成熟。②运动可以上调骨骼肌和大脑中过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator 1 α，PGC1α)的表达[33-34]。近来有研究显示，在小鼠脊髓脱髓鞘后立即进行自愿跑轮训练可以激活PGC1α，促进OLs的形成，增加再生髓鞘的厚度；然而，当OLs中的PGC1α被敲除后，即使接受了跑轮训练，病变处G-ratio没有下降，表明PGC1α是运动促进髓鞘增厚的关键因子[9]。另外，先前已有研究证明了PGC1α在CNS中调控着髓鞘发育，对髓鞘结构和致密成分的生成十分重要[35]。因此，我们推测，跑台训练可能通过上调PGC1α水平来促进OPCs的增殖、分化和OLs的成熟以及髓鞘化。
我们注意到，与SCI组相比，在损伤后各个时间点跑台训练组BMS得分逐渐提高，但二者在统计学上没有明显的差异，考虑可能的原因是：①本研究采用的模型损伤程度相对较轻，对小鼠的运动功能影响较小；而BMS是一个简化的、半定量的粗大运动评估量表，主要评估足踝关节活动、前肢与后肢的协调情况、行走时足爪的位置和躯干稳定性[12]。因此，需要采用更加系统、精细的后肢运动功能评定方法以观察后肢关节活动情况和测量具体的步态参数，从而更好地评估本研究中跑台训练带来的行为学变化情况。②尽管本研究发现运动增强了髓鞘再生能力，但再生髓鞘期间形成的髓鞘的厚度比正常髓鞘小，再髓鞘轴突动作电位的传导速度较完整轴突慢[36]。这可能不足以导致跑台训练组在SCI后有更明显的功能恢复表现。
综上所述，跑台训练能够促进SCI小鼠左侧dCST区中OPCs增殖、分化和OLs的成熟，增加髓鞘相关蛋白MBP的表达和髓鞘厚度，从而促进轴突髓鞘解剖学上的修复，由此可以推断，跑台训练对SCI后髓鞘修复有积极影响，未来有必要深入研究跑台训练等运动疗法促进SCI髓鞘修复的分子机制。
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