胃癌是常见的恶性肿瘤，近年来，它一直处于世界各地癌症发病率及病死率的前列，我国每年新增胃癌患者超过60万，每年有超过40万人死于胃癌[1]。早期胃癌可通过手术达到根治效果，中晚期胃癌多采用手术联合化疗的治疗方式[2]。耐药是胃癌化疗的重要阻碍，是导致临床化疗失败的主要原因，目前针对耐药细胞株，多采用更换药物来达到化疗效果，但这种方法缺点在于耐药细胞会对新的化疗药物产生耐药，导致化疗失败，且可加重患者的医疗及心理负担[3]。长春新碱疗效明确且价格较低，常用于胃癌的化疗，但肿瘤细胞易对其产生耐药性是制约其应用的一大难题[4]。SGC-7901/VCR细胞是人胃癌细胞SGC-7901对临床用药长春新碱耐药的细胞。寻找一种本身无显著毒副作用，与长春新碱联合用药后能抑制耐药细胞增殖的药物是应对耐药的新思路。
粉防己碱又名汉防己甲素，是从传统中药汉防己的根中提取的生物碱，临床主要用于治疗早期轻度高血压，亦可用于重症高血压及高血压危象，未见其明显的毒副作用[5]。有研究表明粉防己碱作为自噬抑制剂，对多种肿瘤细胞具有抗耐药作用，与化疗药物联合作用，可导致耐药细胞死亡，具有良好的应用前景[6-8]。但粉防己碱联合长春新碱对SGC-7901/VCR细胞的作用研究较少。本研究旨在探究粉防己碱增敏长春新碱诱导SGC-7901/VCR细胞凋亡的分子机制，为将粉防己碱联用长春新碱开发为治疗耐药胃癌的药物组合提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂胃癌SGC-7901/VCR细胞购自ATCC；DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶购自Gibco公司；胎牛血清购自天津康源公司；粉防己碱、硫酸长春新碱购自罗恩试剂；DMSO、MTT、PI购自Sigma公司；AnnexinV FITC、Bcl2购自BD公司；GAPDH、cleaved-Caspase 9、cleaved-Caspase 3、PARP-1、P38、p-P38、ERK抗体购自CST公司；p-ERK、CDC2、p-CDC2抗体购自SCBT公司；P0013蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂购自碧云天公司；SB203580、SP6000125购自Selleck公司；PD98059购自MCE公司。
1.2 细胞培养SGC-7901/VCR细胞用DMEM完全培养基(10%胎牛血清)37 ℃、饱和湿度及5%CO2的恒温培养箱中培养，每2天传代。
1.3 Western blot检测SGC-7901/VCR细胞经处理后，提取全细胞蛋白并测定蛋白浓度，蛋白液加入Loading buffer，96 ℃，金属浴10 min，保存于－80 ℃。经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电转3~4 h至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭30 min，于4 ℃摇床上孵育抗体过夜，1×TBST洗涤10 min/次×3次，加入二抗于室温下孵育2 h，1×TBST洗涤后暗室显影。
1.4 MTT比色法检测细胞活度处于对数生长期的SGC-7901/VCR细胞，按3 000/孔铺96孔板，每孔90 μL培养基，37 ℃培养过夜后给予不同药物处理。2种药物单用组药物浓度：粉防己碱(2、4、6、8 μmol/L)，长春新碱(50、100、150、200 nmol/L)。联用组药物浓度为粉防己碱单用药物浓度处理下联合长春新碱100 nmol/L共同处理，长春新碱单用浓度处理下联合粉防己碱4 μmol/L共同处理。给药处理后继续培养48 h，每孔加入20 μL 0.5% MTT，37 ℃继续培养4 h，吸尽孔内液体，每孔加入150 μL DMSO，室温避光振摇约10 min，溶解甲臜。酶标仪于波长490 nm处检测光密度值D(490)。设既无细胞也不给药的孔为调零孔，设有细胞但不给药的孔为对照孔(其细胞活性为100%)。所有组平行3个复孔。细胞存活率＝[处理组D(490)-调零孔D(490)]/[对照组D(490)-调零孔D(490)]×100%。
1.5 细胞凋亡检测SGC-7901/VCR细胞计数后分盘于6孔板中(150 000/孔)，37 ℃培养24 h后加药处理，单用组药物浓度：粉防己碱4 μmol/L，长春新碱100 nmol/L；联用组药物浓度：粉防己碱4 μmol/L，长春新碱100 nmol/L。继续培养48 h，去除培养基，0.25%胰蛋白酶消化细胞，培养基终止消化，细胞收集于15 mL离心管中，1 000 r/min 4 ℃离心5 min。2 μL Annexin V-FITC和5 μL PI(50 μg/mL)共同混于100 μL 1×binding buffer，每个离心管加入100 μL混匀的binding buffer，涡旋离心管，转移细胞悬液之1.5 mL EP管中，避光染色15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。
1.6 细胞周期检测取SGC-7901/VCR细胞悬液接种于60 mm培养皿中，每皿3×105个细胞。培养体系为4 mL，置于37 ℃的恒温培养箱中培养24 h后加药处理，继续培养24 h后用胰酶消化，收集于15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，每管加入300 μL细胞周期染色液，避光冰浴2 h, 涡旋后转入1.5 mL EP管中进行流式检测。
1.7 统计学分析量效关系、协同系数数据采用Calcusyn软件分析，Western blot检测结果采用photoshop软件处理，流式检测数据采用FLowJo V7.6软件分析。采用GraphPad Prism 7.0和SPSS 22.0统计软件，两样本的组间比较采用独立样本t检验。检验水准：α=0.05。
2 结果 2.1 粉防己碱联用长春新碱对SGC-7901/VCR细胞增殖有明显抑制作用采用MTT实验检测粉防己碱联用长春新碱对SGC-7901/VCR细胞增殖的影响，结果显示：单用粉防己碱(0~8 μmol/L)或者长春新碱(0~200 nmol/L)48 h对SGC-7901/VCR细胞增殖均无明显抑制作用，但联合应用后，可以明显抑制肿瘤细胞增殖，差异具有统计学意义(P＜0.05，图 1A、B)。利用CalcuSyn软件求得协同系数和量效关系，结果显示：在一定剂量范围内，药物效应与浓度呈正相关(图 1C、D)。协同系数小于1，表明粉防己碱与长春新碱联合作用效果为协同。
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a：P＜0.05, 与单用组比较 A：不同浓度长春新碱单用及与粉防己碱(4 μmol/L)联用48 h对SGC-7901/VCR细胞增殖的影响；B：不同浓度粉防己碱单用及与长春新碱(100 nmol/L)联用48 h对SGC-7901/VCR细胞增殖的影响；C：粉防己碱联用长春新碱的协同系数；D：药物浓度与细胞死亡率之间的量效关系 图 1 粉防己碱增敏长春新碱对SGC-7901/VCR细胞增殖活性的影响 |
2.2 粉防己碱联用长春新碱诱导SGC-7901/VCR细胞凋亡及凋亡相关蛋白的表达
通过Annexin V-FITC和PI双染色法检测联合用药对SGC-7901/VCR细胞细胞凋亡的影响，结果显示：单用粉防己碱(4 μmol/L)或长春新碱(100 nmol/L) 48 h均不能明显促进SGC-7901/VCR细胞凋亡，但两种药物联合应用48 h细胞凋亡明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05，图 2A、B)。提取细胞全蛋白，Western blot检测结果显示：联合用药可使PARP剪切激活，cleaved-Caspase 9、cleaved-Caspase 3表达增加，抗凋亡蛋白Bcl2表达减少(P＜0.05，图 2C、D)。结果表明粉防己碱联用长春新碱促进SGC-7901/VCR细胞凋亡。
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1：对照组；2：粉防己碱单用组；3：长春新碱单用组；4：联合用药组；a：P＜0.05, 与对照组比较 A：流式细胞术检测单用及联合用药对SGC-7901/VCR细胞凋亡的影响；B：各组细胞凋亡率；C：Western blot检测凋亡相关蛋白的表达；D：各组细胞凋亡相关蛋白表达的半定量分析 图 2 粉防己碱联用长春新碱诱导SGC-7901/VCR细胞凋亡及相关蛋白的表达 |
2.3 粉防己碱联用长春新碱影响细胞内MAPK信号通路
粉防己碱(4 μmol/L)联用长春新碱(100 nmol/L) 处理SGC-7901/VCR细胞48 h，Western blot检测结果显示：细胞内MAPK信号通路相关蛋白P38、JNK、ERK表达无变化，p-P38、p-JNK表达增加，p-ERK表达减少(P＜0.05，图 3)。结果表明联合用药激活MAPK信号通路的p38和JNK通路，抑制ERK通路。
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| A：Western blot检测单用及联合用药对MAPK信号通路相关蛋白的影响 1：对照组；2：粉防己碱单用组；3：长春新碱单用组；4：联合用药组；B：MAPK信号通路相关蛋白表达的半定量分析 a：P＜0.05, 与对照组比较 图 3 粉防己碱联用长春新碱对MAPK信号通路相关蛋白表达的影响 |
2.4 MAPK信号通路抑制剂对联合用药促进胃癌SGC-7901/VCR细胞凋亡的影响 2.4.1 抑制p38或JNK通路减弱细胞凋亡
流式细胞术检测发现：经SB203580或SP600125预处理后，联合用药组细胞凋亡少于联用组，差异有统计学意义(P＜0.05，图 4)。Western blot检测结果显示：相比于联合用药组，经SB203580或SP600125预处理后，联合用药组PARP剪切减弱，Bcl2表达增加，cleaved- Caspase 9、cleaved-Caspase 3表达减少(P＜0.05，图 5)。结果表明联合用药诱导SGC-7901/VCR细胞凋亡与p38和JNK通路激活密切相关。
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a：P＜0.05, 与对照组比较 A：流式细胞术检测经SB203580预处理后联用药对SGC-7901/VCR细胞细胞凋亡的影响；B：各组细胞凋亡率 1：对照组；2：联合用药组；3：SB203580单用组；4：经SB203580预处理后联合用药组；C：流式细胞术检测经SP600125预处理后联用药对SGC-7901/VCR细胞细胞凋亡的影响；D：各组细胞凋亡率 1：对照组；2：联合用药组；3：SP600125单用组；4：经SP600125预处理后联合用药组 图 4 流式细胞术检测经SB203580或SP600125预处理后联合用药对细胞凋亡的影响 |
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a：P＜0.05, 与对照组比较 A：Western blot检测经SB203580预处理后联用药对SGC-7901/VCR细胞凋亡相关蛋白表达的影响 1：对照组；2：联合用药组；3：SB203580单用组；4：经SB203580预处理后联合用药组；B：经SB203580预处理后联用药细胞凋亡相关蛋白表达半定量分析；C：Western blot检测经SP600125预处理后联用药对SGC-7901/VCR细胞凋亡相关蛋白表达的影响 1：对照组；2：联合用药组；3：SP600125单用组；4：经SP600125预处理后联合用药组；D：经SP600125预处理后联用药细胞凋亡相关蛋白表达的半定量分析 图 5 Western blot检测经SB203580或SP600125预处理后联合用药对细胞凋亡相关蛋白表达的影响 |
2.4.2 抑制ERK通路增强细胞凋亡
流式细胞术检测发现：经PD98059预处理后联用组细胞凋亡多于联用组(P＜0.05，图 6A、B)。Western blot检测结果显示：相比于联合用药组，经PD98059预处理联合用药组PARP剪切增强，Bcl2表达减少，cleaved-Caspase 9、cleaved-Caspase 3表达增加(P＜0.05，图 6C、D)。以上结果说明联合用药诱导SGC-7901/VCR细胞凋亡与ERK通路抑制密切相关。
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1：对照组；2：联合用药组；3：PD98059单用组；4：PD98059预处理后联合用药组；a：P＜0.05，与对照组比较 A：流式细胞仪检测经PD98059预处理后联用药对SGC-7901/VCR细胞细胞凋亡的影响；B：各组细胞凋亡率；C：Western blot检测凋亡相关蛋白表达；D：经PD98059预处理后联用药细胞凋亡相关蛋白表达的半定量分析 图 6 经PD98059预处理后联合用药对细胞凋亡的影响 |
2.5 联合用药对SGC-7901/VCR细胞周期的影响
单用粉防己碱(4 μmol/L)或长春新碱(100 nmol/L) 均不能明显阻滞SGC-7901/VCR细胞周期，但两种药物联用处理后发生S/G2期细胞周期阻滞(P＜0.05，图 7A、B)。Western blot检测结果显示：联合用药导致p-CDC2表达减少(P＜0.05，图 7C、D)。
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a：P＜0.05，与对照组比较 A: 流式细胞仪检测单用及联用药物对SGC-7901/VCR细胞细胞周期的影响；B：各组细胞周期统计分析；C：Western blot检测细胞周期相关蛋白的表达 1：对照组；2：粉防己碱单用组；3：长春新碱单用组；4：联合用药组；D：细胞周期相关蛋白p-CDC2表达的半定量分析 图 7 粉防己碱联用长春新碱对SGC-7901/VCR细胞周期及周期相关蛋白表达的影响 |
3 讨论
胃癌作为常见恶性肿瘤，因其发病隐匿，患者初次就诊时多数已进展为中晚期胃癌，难以通过胃癌根治手术彻底治愈，需要应用药物予以化疗[2, 9]。胃癌的化疗，特别是耐药胃癌化疗是医学界的难题之一，目前行之有效的化疗方法很少，针对耐药主要的措施有运用增敏剂、逆转剂、分子靶向药物等，但这些方法往往也会产生新的耐药[3]。越来越多研究表明采用自噬抑制剂与化疗药物联合用药的方法可以达到很好的化疗效果，杀死耐药细胞[10-11]。我国作为传统中草药大国，从传统中草药中找到高效低毒的增敏剂，增敏长春新碱促进耐药细胞死亡具有重要意义。
肿瘤细胞内信号通路的改变与细胞增殖及凋亡密切相关，针对这一环节进行干预是肿瘤治疗的重要化疗策略[12-14]。MAPK信号通路在真核生物细胞内发挥重要生理作用[15-16]，主要包括p38、JNK和ERK通路，均可被激活或抑制而参与细胞的增殖、分化、凋亡等过程[17-18]。其中，p38通路可通过激活c-Jun、增加TNF-α的表达等途径促进细胞凋亡发生[19]。同时，研究表明p38通路的激活可导致细胞周期阻滞及细胞凋亡[20]。激活JNK可上调促凋亡蛋白的表达并激活Caspase 3[21-22]，而抑制ERK可促进细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖[23-25]。
从天然药物中分离提取有效成分，单用或者联合用药增加特定药物敏感性以达到更好治疗效果，一直是肿瘤药物研发的热点和难点，随着全球肿瘤发病率不断增高，这一问题显得尤为突出。有研究报道，姜黄素可通过下调P-gp表达并使其活性下降，增敏长春新碱，激活Caspase 3级联反应，诱导SGC-7901/VCR细胞发生凋亡，但该联合用药作用剂量较大，20 μmol/L姜黄素联合1 μmol/L长春新碱作用于SGC-7901/VCR细胞时，细胞凋亡率仅能达到43.7%[26]，而在本研究中，4 μmol/L粉防己碱联合100 nmol/L长春新碱即可使SGC-7901/VCR细胞凋亡率达到53.6%，提示本联合用药组合具有明显优势和应用前景。另有研究证实，RPN2通过活化ERK信号通路，增加P-gp和ABCG2介导的胃癌细胞多药耐药发生，而抑制ERK信号通路可以显著降低SGC-7901/DDP和SGC-7901/VCR细胞的耐药性[27]。本研究发现并证实，粉防己碱联用长春新碱可激活SGC-7901/VCR细胞MAPK信号通路中p38和JNK通路，抑制ERK通路，进而激活下游的Caspase级联反应，同时导致SGC-7901/VCR细胞S/G2周期阻滞，最终使SGC-7901/VCR细胞发生凋亡。
综上所述，粉防己碱增敏长春新碱诱导胃癌SGC-7901/VCR细胞凋亡，其机制可能为联合用药激活肿瘤细胞MAPK信号通路p38和JNK通路，抑制ERK通路，从而激活下游Caspase家族，同时导致SGC-7901/VCR细胞S/G2周期阻滞，最终诱导胃癌SGC-7901/VCR细胞凋亡发生。
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