表1(Table 1)
Coronins是一种保守的肌动蛋白细胞骨架调节因子家族，Coronin-1又名actin-binding protein P57或TACO(tryptophan aspartate containing coat protein)，广泛表达于中性粒细胞、巨噬细胞及淋巴细胞等白细胞中，其涉及钙离子稳态[1]、细胞骨架动力学[2]、免疫[3]及炎症反应[4]等多种细胞功能。巨噬细胞的表型与胞内寄生菌感染[5]、肿瘤等疾病的发生、发展有关[6]。在肿瘤的发生、发展过程中，巨噬细胞受到肿瘤微环境调控进而发生表型的转换，由促炎的M1型转换为免疫抑制相关的M2型，为肿瘤的生成及其转移提供了有利的条件[7]。Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)4能被脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)激活，LPS-TLR4通路是介导巨噬细胞极化为M1型的重要通路[8]，研究表明Coronin-1的表达可抑制TLR4及其下游通路[9-10]，而TLR4与LPS的结合需要CD14的参与[11]。
巨噬细胞冠蛋白-1(Coronin-1)与其介导的炎症反应有关，而巨噬细胞表型极化状态又决定了其促炎或抑炎功能的发挥。为了探讨巨噬细胞Coronin-1与其极化的相关性及可能机制，本研究拟将巨噬细胞诱导为M1、M2型，检测Coronin-1蛋白表达是否存在差异；用pEGFP-C1质粒构建过表达Coronin-1的巨噬细胞系，用CRISPR/Cas9构建敲除Coronin-1的巨噬细胞系，探讨不同表达水平的Coronin-1对巨噬细胞的极化是否有影响以及与极化的因果关系；利用GeneMANIA数据库，对Coronin-1与CD14之间的蛋白互作关系进行分析，用shRNA构建Coronin-1过表达CD14沉默的巨噬细胞系和Coronin-1正常表达CD14沉默的巨噬细胞系，探讨Coronin-1在LPS介导的M1型巨噬细胞极化中的影响以及该影响是否通过CD14途径，明确Coronin-1蛋白在巨噬细胞极化中的作用及其机制，可为肿瘤的防治、炎症控制等提供新思路。
1 材料与方法 1.1 细胞株、主要材料与试剂小鼠巨噬细胞RAW264.7、HEK293T由重庆医科大学免疫学研究中心保存；pEGFP-C1、lentiCRISPR-v2、psi-LVRU6P、pMD2.G、psPAX2质粒由重庆医科大学免疫学研究中心保存。其他材料与试剂：小鼠重组γ-干扰素、小鼠重组白介素-4(美国Proteintech公司)；LPS(美国Sigma公司)；DMEM高糖培养基、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；青霉素-链霉素溶液(碧云天公司)；胎牛血清(Natocor-Industria Biologica公司，阿根廷)；LipofectamineTM 3000(美国Invitrogen公司)；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、PrimeSTAR HS DNA Polymerase试剂盒、TB GreenTM Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)RT-PCR试剂盒、DNA提取试剂盒(日本TaKaRa公司)；引物由天津擎科生物技术有限公司合成；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、PVDF膜(0.2 μm/0.45 μm)(鼎国昌盛公司)；SDS-PAGE凝胶试剂盒(雅酶公司)；兔一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)多克隆抗体、小鼠Coronin-1单克隆抗体(英国Abcam公司)；小鼠ARG-1单克隆抗体、兔CD14多克隆抗体、小鼠β-actin单克隆内参抗体(美国Proteintech公司)；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG(美国Abbkine公司)。
1.2 M1、M2型巨噬细胞的诱导分别用含有终浓度为20 ng/mL的小鼠重组IFN-γ+终浓度为100 ng/mL的LPS、终浓度为20 ng/mL的小鼠重组IL-4的培养液处理RAW264.7细胞48 h，诱导成M1和M2型巨噬细胞[12]，以未经处理的RAW264.7细胞为空白对照组(Control)。
1.3 过表达Coronin-1细胞系的建立 1.3.1 重组质粒pEGFP-C1-Coronin-1的构建根据GenBank(AF143955.1)设计合成目的基因Coronin-1引物(扩增目的基因长度为1 386 bp)。上游引物为5′-GCGTCGACGCCACCATGAGCCGGCAGGTGGT-3′，下游引物为5′-GCGGATCCCTACTTGGCCTGAACAGT-CTCCT-3′。裂解RAW264.7细胞后用RNA提取试剂盒提取总RNA，按逆转录试剂盒说明书逆转录为cDNA，以cDNA为模板PCR扩增Coronin-1目的片段。用BamHⅠ和SalⅠ双酶切PCR回收产物和质粒pEGFP-C1，使其具有相同的黏性末端，纯化回收目的基因和载体大片段，用DNA连接酶于16 ℃下连接4 h，转化至感受态TOP10大肠杆菌，卡那霉素抗性筛选并挑取阳性克隆，酶切鉴定及测序鉴定，构建的重组质粒命名为pEGFP-C1-Coronin-1。
1.3.2 RAW264.7-pEGFP-C1-Coronin-1细胞系的建立将pEGFP-C1-Coronin-1质粒用LipofectamineTM3000转染RAW264.7细胞，转染24 h后置于倒置荧光显微镜下观察荧光表达情况，将细胞以1 ∶6比例传代，用G418加压筛选，挑单克隆筛选出表达绿色荧光的RAW264.7-pEGFP-C1-Coronin-1稳定转染细胞株(Coronin-1 Plus)。
1.4 CRISPR/Cas9敲除Coronin-1细胞系的建立 1.4.1 CRISPR/Cas9基因敲除质粒lentiCRISPR-v2-Coronin-1的构建根据GenBank(NM_001301374.1)设计能有效敲除Coronin-1的sgRNA模板序列，sgRNA-上游为5′-CACCGCCACGTGTTTGGACAGCCAGCCA-3′，sgRNA-下游为5′-AAACTGGCTGGCTGTCCAAACACGT-GGC-3′，在PCR仪上退火。用Esp3 Ⅰ酶切lentiCRISPR-v2质粒，使其具有相同的黏性末端，纯化回收以后用DNA连接酶于16 ℃下连接4 h，转化至感受态Stbl3大肠杆菌，氨苄西林抗性筛选并挑取阳性克隆，测序鉴定，构建的重组质粒命名为lentiCRISPR-v2-Coronin-1。
1.4.2 RAW264.7-lentiCRISPR-v2-Coronin-1细胞系的建立采用lentiCRISPR-v2-Coronin-1、pMD2.G、psPAX2三质粒包装系统，用LipofectamineTM 3000转染HEK293T细胞，48 h后收集慢病毒上清离心过滤，于-80 ℃保存。将慢病毒、10 μg/mL polybrene加入RAW264.7细胞，6 h后补齐培养液，24 h后更换新鲜培养液，感染48 h加入嘌呤霉素筛选。将细胞铺至96孔板中，挑单克隆筛选鉴定出Coronin-1基因敲除的稳定细胞株RAW264.7-lentiCRISPR-v2-Coronin-1(Coronin-1 KO)。
1.5 CD14沉默的细胞系的建立 1.5.1 shRNA慢病毒重组质粒psi-LVRU6P-CD14的构建根据GenBank(NM_009841.4)设计能有效沉默CD14的shRNA模板序列，shRNA-上游为5′-GAT-CGTATCAAGTCTCTGTCCTTAAACT CGAGTTTAAGGAC- AGAGACTTGATACTTTTTG-3′，shRNA-下游为5′-AA-TTCAAAAAGTATCAAGTCTCTGTCCTTAAACTCGAGTT-TAAGGACAGAGACTTGATAC-3′，在PCR仪上退火。用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切psi-LVRU6P质粒，使其具有相同的黏性末端，纯化回收以后用DNA连接酶于16 ℃下连接4 h，转化至感受态Stbl3大肠杆菌，氨苄西林抗性筛选并挑取阳性克隆，测序鉴定，构建的重组慢病毒质粒命名psi-LVRU6P-CD14。
1.5.2 RAW264.7-psi-LVRU6P-CD14细胞系的建立采用psi-LVRU6P-CD14、pMD2.G、psPAX2三质粒包装系统，用LipofectamineTM 3000转染HEK293T细胞，48 h后收集慢病毒上清离心过滤，于-80 ℃保存。将慢病毒、10 μg/mL polybrene加入RAW264.7细胞，6 h后补齐培养液，24 h后更换新鲜培养液，感染48 h加入嘌呤霉素筛选，以获得CD14基因稳定沉默的RAW264.7-psi-LVRU6P-CD14细胞系(Control-CD14 KD)。
1.5.3 RAW264.7-Coronin-1 Plus-psi-LVRU6P-CD14细胞系的建立采用psi-LVRU6P-CD14、pMD2.G、psPAX2三质粒包装系统用LipofectamineTM 3000转染HEK293T细胞，48 h后收集慢病毒上清离心过滤，于-80 ℃保存。将慢病毒、10 μg/mL polybrene加入Coronin-1 Plus细胞，6 h后补齐培养液，24 h后更换新鲜培养液，感染48 h加入嘌呤霉素筛选，以获得CD14基因稳定沉默的RAW264.7-Coronin-1Plus-psi-LVRU6P-CD14细胞系(Coronin-1 Plus-CD14 KD)。
1.6 Real-time PCR检测按RNA提取试剂盒说明分别提取各组细胞的RNA，将其逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行实时定量PCR扩增，测定细胞iNOS mRNA、ARG-1 mRNA、Coronin-1 mRNA、CD14 mRNA、内参GAPDH mRNA转录水平，引物序列见表 1。每个反应做3个复孔，结果用2-ΔΔCt法进行相对定量分析，ΔΔCt=对照组ΔCt(目的基因Ct-管家基因Ct)-各组ΔCt(目的基因Ct-管家基因Ct)。
| 基因 | 引物序列(5′→3′) |
扩增长度/bp |
| iNOS | 上游5′-CCCTTCAATGGTTGGTACATGG-3′ 下游5′-ACATTGATCTCCGTGACAGCC-3′ |
127 |
| ARG-1 | 上游5′-CATATCTGCCAAAGACATCGT-3′ 下游5′-CCAGCTTGTCTACTTCAGTCA-3′ |
185 |
| Coronin-1 | 上游5′-CACCCGGACACAATCTACAGC-3′ 下游5′-CTCGATGACACGAACTCGCTT-3′ |
90 |
| CD14 | 上游5′-ATACCTTCTAAAGCGTGTGGAC-3′ 下游5′-GGCTCCGAATAGAATCCGACT-3′ |
127 |
| GAPDH | 上游5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′ 下游5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′ |
126 |
1.7 Western blot检测
RIPA裂解液提取各组细胞的总蛋白，BCA试剂用于检测各组蛋白浓度。经SDS-PAGE电泳，恒流电转至PVDF膜。用5%脱脂牛奶封闭1~2 h，加入相应的一抗于4 ℃过夜孵育；TBST洗涤后，加入HRP标记的兔/鼠二抗，室温条件下孵育2 h，TBST洗涤后，用ECL化学发光试剂盒在Bio-Rad凝胶成像仪上显影，使用Image Lab分析条带灰度值。
1.8 蛋白质互作网络(PPI)、GO功能富集分析使用GeneMANIA(http://genemania.org/)生物数据库[13]，基于已知和预测的蛋白质相互作用，构建蛋白质相互作用网络。借助R语言对GO的结果进行可视化处理。
1.9 统计学分析实验均独立重复3次，数据采用x±s表示，使用GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析，各组间比较用单因素方差分析；两组数据的比较使用独立样本t检验。检验水准：α=0.05。
2 结果 2.1 M1、M2型巨噬细胞Coronin-1的表达 2.1.1 M1、M2型巨噬细胞表型的鉴定Real-time PCR结果显示(图 1A)：处理细胞48 h后，IFN-γ+LPS处理组的iNOS mRNA表达显著高于Control组(P < 0.01)，IL-4处理组与Control组之间的差异无统计学意义。IL-4处理组的ARG-1 mRNA表达显著高于Control组(P < 0.01)，IFN-γ+LPS处理组与Control组之间的差异无统计学意义。Western blot结果显示(图 1B)：IFN-γ+LPS处理组的iNOS蛋白表达显著高于Control组(P < 0.01)，IL-4处理组与Control组之间的差异无统计学意义。IL-4处理组的ARG-1蛋白表达显著高于Control组(P < 0.05)，IFN-γ+LPS处理组与Control组之间的差异无统计学意义。以上结果表明：IFN-γ+LPS刺激诱导细胞后，iNOS高表达；IL-4刺激诱导细胞后，ARG-1高表达。M1、M2型巨噬细胞诱导成功。
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1：IFN-γ+LPS处理组；2：IL-4处理组；3：Control组；a: P < 0.05, b: P < 0.01, 与Control组比较 A: Real-time PCR检测各组细胞iNOS、Arg-1、Coronin-1 mRNA转录水平; B: Western blot检测各组细胞iNOS、Arg-1、Coronin-1蛋白表达 图 1 M1、M2型巨噬细胞表型鉴定以及Coronin-1的表达 |
2.1.2 M1、M2型巨噬细胞Coronin-1的表达
Real-time PCR结果显示(图 1A)：IFN-γ+LPS处理组的Coronin-1 mRNA表达显著高于Control组(P < 0.05)，IL-4处理组与Control组之间的差异无统计学意义。Western blot结果显示(图 1B)：IFN-γ+LPS处理组的Coronin-1蛋白表达显著高于Control组(P < 0.05)，而IL-4处理组与Control组之间的差异无统计学意义。以上结果显示：M1型巨噬细胞的Coronin-1 mRNA和蛋白水平显著高于M2型巨噬细胞及对照组。
2.2 过表达或敲除Coronin-1对M1型巨噬细胞极化的影响 2.2.1 过表达Coronin-1细胞系的建立将pEGFP-C1-Coronin-1质粒转染RAW264.7细胞，经G418加压筛选后，RAW264.7-pEGFP-C1-Coronin-1细胞均带绿色荧光，提示稳定转染细胞系构建成功(图 2A)。
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1:Coronin-1 Plus组; 2:Coronin-1 KO组; 3:Control组; 4:Control+LPS阳性对照；a: P < 0.05, b: P < 0.01, 与Control组比较 A: 镜下观察pEGFP-C1-Coronin-1质粒稳定转染RAW264.7细胞的变化(×100);B: RAW264.7/lentiCRISPR-v2-Coronin-1测序结果; C: Real-time PCR检测Coronin-1 mRNA转录水平; D: Western blot检测Coronin-1蛋白表达; E: Real-time PCR检测iNOS mRNA转录水平; F: Western blot检测iNOS蛋白表达 图 2 过表达或敲除Coronin-1对M1型巨噬细胞极化的影响 |
2.2.2 CRISPR/Cas9敲除Coronin-1细胞系的建立
用lentiCRISPR-v2-Coronin-1慢病毒感染RAW264.7细胞，经嘌呤霉素筛选后，通过对扩增产物进行测序，结果显示(图 2B)：RAW264.7-lentiCRISPR-v2-Coronin-1发生碱基插入及缺失，并在靶点的测序峰图显示有套峰现象，表明CRISPR/Cas9敲除细胞系构建成功。
2.2.3 Coronin-1过表达、敲除细胞系的鉴定Real-time PCR结果显示(图 2C)：过表达组(Coronin-1 Plus)的Coronin-1 mRNA表达显著高于Control组(P < 0.05)，敲除组(Coronin-1 KO)的Coronin-1 mRNA表达显著低于Control组(P < 0.01)。Western blot结果显示(图 2D)：Coronin-1 Plus组的Coronin-1蛋白表达显著高于Control组(P < 0.05)，Coronin-1 KO的Coronin-1蛋白显著低于Control(P < 0.01)。Coronin-1 Plus过表达率为50.2%，Coronin-1 KO敲除率为93.0%，表明Coronin-1 Plus细胞系和Coronin-1 KO细胞系构建成功。
2.2.4 Coronin-1过表达、敲除细胞系iNOS的检测Real-time PCR结果显示(图 2E)：Coronin-1 Plus组的iNOS mRNA表达显著低于Control组(P < 0.01)。Western blot结果显示(图 2F)：Coronin-1 Plus、Coronin-1 KO、Control均不表达iNOS蛋白。以上结果表明：M1型巨噬细胞Coronin-1表达显著高于M2型巨噬细胞及Control，而过表达Coronin-1不能将巨噬细胞极化为M1型，Coronin-1的高表达是由M1型巨噬细胞极化导致的。
2.3 PPI、GO分析构造蛋白质互作网络(图 3A)，PPI分析结果显示：Tlr4、Capzb、Dkk1、Lbp、Tlr6、Ncf4、Ly96、Myd88等20个基因与Coronin-1和CD14存在相互作用关系。GO分析结果显示：这些基因主要富集在受体复合物、脂筏、膜微结构域、Toll样受体信号通路、模式识别受体信号通路、脂多糖介导的信号通路、肿瘤坏死因子的产生等(图 3B)。以上结果表明：Coronin-1不但参与LPS诱导的M1型巨噬细胞极化，而且与CD14存在直接或者间接的相互作用关系。
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| 图 3 Coronin-1与CD14共表达基因的PPI(A)、GO分析(B) |
2.4 过表达或敲除Coronin-1对CD14表达的影响
Real-time PCR结果显示(图 4A)：Coronin-1 Plus组的CD14 mRNA表达显著高于Control组(P < 0.05)，Coronin-1 KO组与Control组之间的差异无统计学意义。Western blot结果显示(图 4B)：Coronin-1 Plus组的CD14蛋白表达显著高于Control组(P < 0.05)，Coronin-1 KO组与Control组之间的差异无统计学意义。以上结果表明：Coronin-1过表达会引起CD14高表达。
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1:Coronin-1 Plus组; 2:Coronin-1 KO组; 3:Control组；a: P < 0.05, 与Control组比较 A: Real-time PCR检测CD14 mRNA转录水平; B: Western blot检测CD14蛋白表达 图 4 Coronin-1不同表达水平细胞CD14 mRNA和蛋白表达 |
2.5 过表达或敲除Coronin-1对LPS介导的M1型巨噬细胞极化的影响
Real-time PCR结果显示(图 5A)：LPS(100 ng/mL) 处理48 h后，Coronin-1 Plus+ LPS组的iNOS mRNA表达显著高于Control+LPS组(P < 0.01)，Coronin-1 KO+LPS组与Control+LPS组之间的差异无统计学意义。Western blot结果显示(图 5B)：Coronin-1 Plus+LPS组的iNOS蛋白表达显著高于Control+LPS组(P < 0.01)，而Coronin-1 KO+LPS组与Control+LPS组之间的差异无统计学意义。以上结果表明：Coronin-1过表达对LPS介导的M1型巨噬细胞极化有促进作用。
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1:Coronin-1 Plus+LPS组; 2:Coronin-1 KO+LPS组; 3:Control+LPS组；a: P < 0.01, 与Control+LPS组比较 A: Real-time PCR检测iNOS mRNA转录水平; B: Western blot检测iNOS蛋白表达 图 5 LPS处理后Coronin-1不同表达水平细胞iNOS mRNA和蛋白表达 |
2.6 Coronin-1正常表达、Coronin-1过表达CD14沉默的细胞系的建立 2.6.1 Coronin-1正常表达CD14沉默的细胞系的鉴定
Real-time PCR结果显示(图 6A)：Control-CD14 KD组的CD14 mRNA表达显著低于Control组(P < 0.05)。Western blot结果显示(图 6B)：Control-CD14 KD组的CD14蛋白表达显著低于Control组(P < 0.05)。以上结果表明：Control-CD14 KD细胞系构建成功，其沉默效率为54.3%。
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1: Coronin-1 Plus组; 2: Coronin-1 Plus-CD14 KD组; 3:Control组; 4: Control-CD14 KD组；a: P < 0.05, b: P < 0.01, 与Coronin-1 Plus组或Control组比较 A: Real-time PCR检测CD14 mRNA转录水平; B: Western blot检测CD14蛋白表达 图 6 CD14沉默的细胞系鉴定 |
2.6.2 Coronin-1过表达CD14沉默的细胞系的鉴定
Real-time PCR结果显示(图 6A)：Coronin-1 Plus-CD14 KD组的CD14 mRNA表达显著低于Coronin-1 Plus组(P < 0.01)。Western blot结果显示(图 6B)：Coronin-1 Plus-CD14 KD组的CD14蛋白表达显著低于Coronin-1 Plus(P < 0.05)。以上结果表明：Coronin-1 Plus-CD14 KD细胞系构建成功，其沉默效率为62.1%。
2.7 CD14在Coronin-1过表达的巨噬细胞M1型极化中的作用Real-time PCR结果显示(图 7A)：LPS(100 ng/mL) 处理48 h后，Coronin-1 Plus+LPS组的iNOS mRNA表达显著高于Control+LPS组(P < 0.01)，Control-CD14 KD +LPS、Coronin-1 Plus-CD14 KD+LPS组与Control+LPS组之间的差异无统计学意义。Western blot结果显示(图 7B)：Coronin-1 Plus+LPS组的iNOS蛋白表达显著高于Control+LPS组(P < 0.05)，Control-CD14 KD+LPS、Coronin-1 Plus-CD14 KD+LPS组与Control+LPS组之间的差异无统计学意义。以上结果表明：Coronin-1过表达在LPS介导的M1型巨噬细胞极化是通过CD14来发挥促进作用的。
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1: Coronin-1 Plus+LPS组; 2:Control+LPS组; 3:Coronin-1 Plus-CD14 KD+LPS组; 4: Control-CD14 KD+LPS组；a: P < 0.05, b: P < 0.01, 与Control+LPS组比较 A: Real-time PCR检测iNOS mRNA转录水平; B: Western blot检测iNOS蛋白表达 图 7 CD14在Coronin-1过表达的巨噬细胞M1型极化中的作用 |
3 讨论
巨噬细胞活化可被分成M1型巨噬细胞、M2型巨噬细胞两大类[14]，其中M2型又可分为M2a、M2b和M2c三种类型[6]。M1(经典活化型)，通常是由IFN-γ、LPS等刺激诱导巨噬细胞分化而来，CD86和MHCⅡ表达增高，分泌促炎介质iNOS、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白细胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-12等。M1具有防御病原体侵入、抗肿瘤等功能。M2(替代活化型)通常是由IL-4或IL-13刺激诱导巨噬细胞分化而来，高表达CD206和Arg-1，在促进伤口的愈合以及组织重构等重要过程中发挥作用。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage，TAM)是存在于肿瘤微环境中最为丰富的免疫细胞，约占其中免疫细胞的50%以上，研究表明TAM多具有M2的表型和功能[15]，为肿瘤发生、发展和侵袭转移提供了便利条件。Coronins肌动蛋白细胞骨架调节因子家族共有7个成员，包括Coronin 1A(Coronin-1，p57，TACO，ClipinA)、Coronin 1B(Coronin-2，coroninSE)、Coronin 1C(Coronin-3)、Coronin 2A(Coronin-4，IR10，ClipinB，WDR2)、Coronin 2B(Coronin-5，ClipinC)、Coronin 6、Coronin 7(POD)[16]。Coronin-1广泛表达于白细胞中[17]，对巨噬细胞中结核杆菌的持留[18]、T细胞的生存[1]至关重要。课题组在前期研究发现Coronin-1过表达能抑制巨噬细胞TLR4的表达[10]，鉴于TLR4是M1型巨噬细胞诱导的重要途径，故推断Coronin-1可能参与了巨噬细胞的极化。本研究构建了M1、M2型巨噬细胞模型，研究了Coronin-1蛋白在不同极化类型中的表达量。结果显示M1型巨噬细胞Coronin-1的表达量高于M2组和对照组，证实了巨噬细胞的极化状态与Coronin-1存在一定的相关性。本研究构建了Coronin-1过表达、敲除细胞系，在此基础上研究巨噬细胞中Coronin-1不同表达水平能否引起巨噬细胞极化为M1型。结果显示M1型巨噬细胞Coronin-1高表达，但过表达Coronin-1不会使巨噬细胞极化为M1型。证实了Coronin-1与巨噬细胞极化的因果关系，即巨噬细胞极化可导致Coronin-1的高表达，但是Coronin-1的高表达不能直接导致巨噬细胞极化为M1型，提示Cononin-1参与了巨噬细胞极化的某个环节。
CD14是LPS受体，通过识别、结合LPS/LBP蛋白复合物，将LPS呈递给TLR4/MD-2[19]。本研究通过PPI和GO分析了Coronin-1和CD14蛋白互作和相关通路的富集，结果显示Tlr4、Capzb、Dkk1、Lbp、Tlr6、Ncf4、Ly96、Myd88等20个基因与Coronin-1和CD14存在相互作用关系。GO分析结果显示这些基因主要富集在受体复合物、脂筏、膜微结构域、Toll样受体信号通路、模式识别受体信号通路、LPS介导的信号通路、肿瘤坏死因子的产生等。本研究检测了Coronin-1不同表达水平的CD14表达量，结果显示Coronin-1过表达能引起CD14的高表达。用LPS处理Coronin-1过表达、敲除、正常表达3组细胞，结果显示Coronin-1过表达组的iNOS表达量高于对照组。为了探究Coronin-1过表达组经LPS处理后，iNOS的高表达是否是因为CD14的高表达引起，本研究构建了Coronin-1正常表达CD14沉默、Coronin-1过表达CD14沉默的细胞系，经LPS处理后，结果显示Coronin-1过表达CD14沉默组和Coronin-1正常表达CD14沉默组iNOS表达量没有差异，这表示Coronin-1过表达对LPS介导的巨噬细胞M1型极化的促进是通过CD14来发挥促进作用的，而Coronin-1正常表达CD14沉默组和对照组iNOS表达量没有差异。FU等[20]研究发现CD14沉默对TLR4的表达没有影响，CD14沉默的RAW264.7细胞中，高浓度的LPS仍能激活炎症反应通路。ESPARZA等[21]研究结果显示：在没有CD14的情况下，白蛋白可以在没有LBP的帮助下结合LPS单体，并将它们递送到TLR4/MD-2。由此推论：过表达Coronin-1引起的CD14上调在LPS刺激下能引起iNOS表达量升高，而沉默CD14后，LPS以CD14非依赖方式激活了炎症通路，iNOS表达量显示不具有显著性差异。目前，Coronin-1对CD14的影响机制尚不清楚，本研究结果可为进一步探讨Coronin-1与CD14的关系及其在巨噬细胞极化中的作用及机制奠定基础。
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