2. 550002 贵阳，贵州省人民医院眼科;
3. 401331 重庆，重庆医科大学附属大学城医院眼科;
4. 408000 重庆，重庆市涪陵中心医院眼科
2. Department of Ophthalmology, Guizhou Provincial People's Hospital, Guiyang, Guizhou Province, 550002;
3. Department of Ophthalmology, University-Town Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 401331;
4. Department of Ophthalmology, Fuling Central Hospital of Chongqing, Chongqing, 408000, China
角膜新生血管是一种可致盲的眼表病变，已成为公共卫生关注的焦点。有研究报道：每年估计有140万人发病，其中12%的患者随后丧失了视力[1]。眼部毛细血管网沿角膜缘侵入正常角膜形成新生血管，从而引起视力下降甚至失明，其与感染、碱烧伤、同种异体移植排斥和角膜缝合线放置等有关[2-3]。目前，microRNA(miRNA)已成为生物学研究重点，并在疾病进程中起着重要的作用[4]。
MiRNA是一类非编码的小分子RNA，由单链RNA前体(pre-miRNA)经过Dicer酶剪切后生成，并通过与靶基因mRNA分子的3′端非编码区域(3′-untranslated region, 3′UTR)互补配对，引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译，从而发挥调控作用。研究表明，miRNA与眼部血管疾病紧密相关[5-6]，如视网膜疾病、黄斑变性等，并通过血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及其下游Raf蛋白激酶(rapidly accelerated fibrosarcoma, Raf)/丝裂原活化细胞外信号调节激酶(mitogen-activated protein kinase, MEK)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)通路发挥生物学效应[7]。本课题组前期研究利用缝线法构建SD大鼠角膜新生血管(corneal neovascularization, Cor NV)模型，通过微阵列分析筛选出与VEGF通路相关的具有显著差异的miRNA，其中包括miRNA-424(322)-5p[8](人miR-424-5p是啮齿动物miR-322-5p的同源基因)。故猜测miRNA-424(322)-5p是否可能通过激活VEGF及下游Raf/MEK/ERK通路来调控角膜新生血管的生成。同时，miRNA-424(322)-5p在角膜新生血管方面也尚未见报道。本研究利用缝线法构建动物模型，检测miR-424(322)-5p及VEGF mRNA的相对表达量；同时，利用人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)构建体外Cor NV模型，进一步研究miRNA-424(322)-5p的作用及机制。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物及细胞健康雌性SPF级SD大鼠20只，体质量200~250 g，重庆医科大学动物实验中心饲养并提供合格号[SYXK(渝)2018-0003]。实验前通过裂隙灯观察排除新生血管、瘢痕、穿孔、角膜损伤等疾病。HUVECs细胞系购自莱博斯生物技术有限公司。
1.1.2 主要试剂和仪器胎牛血清(FBS)、RPMI1640培养基及胰蛋白酶(HyClone，美国)，miR-424(322)-5p mimic、miR-424(322)-5p NC(上海吉玛生物公司，中国)，Lipofectamine 2000(Invitrogen，美国)，RNAiso Plus、Mir-X miRNA First Strand Synthesis、Prime Script TM RT reagent Kit with gDNA Eraser及SYBR Premix Ex Taq TMⅡ(TaKaRa公司，日本)，CCK-8试剂盒(Bryotime，中国)，BCA试剂盒(碧云天，中国)，兔抗人多克隆抗体Raf1、VEGF(Proteintech，美国)，兔抗人单克隆抗体MEK1、p-MEK1(Abcam，英国)，兔抗人单克隆抗体ERK1/2、p-ERK1/2(Cell Signaling Technology，美国)。酶联免疫检测仪(Thermo公司，美国)，Real-time RT-PCR仪(Applied Biosystems，美国)，细胞培养箱(Thermo forma，美国)等。
1.2 实验方法 1.2.1 动物模型20只健康SD大鼠(SPF级)经腹腔注射戊巴比妥钠注射液(0.2 mL/100 g)进行麻醉，左眼作为实验组，采用0.04%盐酸奥布卡因滴眼进行表面麻醉后，于角膜3、6、9、12点方向用10-0尼龙线进行缝线建模；右眼作为正常对照组不缝线。建模后每日盐酸林可霉素滴眼，3次/d，2~3滴/次。建模第0、4、7、14天通过裂隙灯观察角膜新生血管。
1.2.2 HE染色观察角膜血管形成及炎性细胞浸润建模第0、4、7、14天，大鼠经腹腔注射过量麻醉剂量处死后，收集角膜组织，将组织常规固定、脱水、包埋、切片(5 μm)，经脱蜡、苏木精-伊红染色后，于显微镜下观察拍照。
1.2.3 免疫组化(IHC)检测角膜组织中VEGF蛋白的表达角膜组织常规固定、脱水、包埋、切片(5 μm)，经脱蜡、水化；抗原修复、封闭；一抗结合、二抗结合；DAB显色；苏木精复染；脱水、透明、中性树脂封片。于显微镜下观察拍照。
1.2.4 RT-PCR检测大鼠角膜组织miRNA-424(322)-5p、VEGF mRNA的表达收集建模第4天的大鼠角膜组织，TRIzol法提取总RNA，逆转录试剂盒合成cDNA，Mir-X miRNA First Strand Synthesis法检测miR-424(322)-5p和VEGF mRNA的表达，采用2-ΔΔCt法统计分析相对表达量。实验重复3次。
1.2.5 细胞转染及转染效率检测在37 ℃ 5%CO2的条件下，采用10%FBS RPMI1640培养基培养HUVECs，待细胞生长至80%~90%时进行转染。实验分为3组：miR-424(322)-5p mimic(mimic组)、miRNA-424(322)-5p NC(NC组)、正常空白组(CON组)。在最佳转染浓度100 nmol/L下进行转染，6 h后更换新培养基，继续培养24 h后收集细胞，用TRIzol法提取总的RNA，逆转录试剂盒合成cDNA，荧光实时定量试剂盒进行PCR，采用2-ΔΔCt法统计分析相对表达量。实验重复3次。
1.2.6 CCK-8法检测细胞增殖能力96孔板中接种HUVECs(5 000/孔)，待细胞贴壁后进行转染(n=6)，6 h后更换培养基继续培养，24 h后加入CCK-8试剂(10 μL/孔)，孵育1~2 h，用酶标仪测量波长450 nm处的光密度值[D(450)]。
1.2.7 划痕实验、Transwell实验检测细胞的迁移能力6孔板中接种HUVECs(1.5×105/孔)，待细胞生长至80%~90%时，用100 μL枪头作垂直线，PBS冲洗3次后进行转染，于0、24 h在倒置显微镜下观察拍照，评估细胞迁移情况。
6孔板中接种HUVECs，待细胞生长至80%~90%进行转染，24 h后胰酶消化细胞并用无血清培养基重悬细胞，并接种到无血清培养基的6孔板型上室(1×105/孔)，下室加入15%FBS完全培养基，24 h后取出上室擦去上室内细胞，经多聚甲醛固定、结晶紫染色后，PBS冲洗3次，在倒置显微镜下观察、拍照、计数，评估细胞迁移情况。
1.2.8 Matrigel胶成管实验检测细胞的成管能力96孔板中加入50 μL/孔Matrigel胶均匀铺在底部，37 ℃孵育1 h使其凝固，将转染24 h后的各组HUVECs按1.5×104/孔接种到已铺基质胶的96孔板中，继续培养4~6 h后，在倒置显微镜下观察管腔形成情况并计数。
1.2.9 Western blot检测VEGF及Raf/MEK/ERK通路的蛋白表达水平HUVECs转染48 h后，通过1%PMSF的RIPA裂解液提取蛋白质，BCA试剂盒测量蛋白浓度。12% SDS-PAGE凝胶进行电泳，电转，用5%脱脂奶粉在室温摇床上封闭1.5 h，将PVDF膜置于稀释后的一抗(GAPDH 1∶1 000，VEGF 1∶800，Raf1 1∶500，MEK1 1∶2 500，p-MEK1 1∶2 500，ERK1/2 1∶1 000，p-ERK1/2 1∶1 000)中，4 ℃孵育过夜，次日用TBST液洗涤PVDF膜3次，于室温条件下孵育二抗1.5 h，TBST洗涤3次，配制ECL显影液，凝胶成像系统成像，采用Image J测量蛋白条带的灰度值。
1.3 统计学分析采用Graphpad Prism 5.0软件进行分析，计量资料以
正常对照组SD大鼠角膜缘血管清晰可见，角膜透明无血管浸润。通过缝线法成功构建角膜Cor NV模型，实验组第4天的角膜缘血管向缝线点呈刷状生长，缝线处角膜轻度水肿；第7天的角膜新生血管浓密，血管继续向缝线点延伸，角膜水肿加重；第14天的角膜新生血管超过缝线点，在缝线点聚集生长，血管粗大，水肿明显加重(图 1)。HE染色显示：正常对照组角膜无血管，各层结构排列整齐，层次分明，基质层无炎性细胞浸润；实验组第4天的角膜上皮细胞层处新生血管形成，血管腔稀疏细小，角膜增厚，基质层可见少量炎性细胞浸润；第7天的角膜上皮细胞层处新生血管管腔浓密粗大，角膜增厚，基质层结构紊乱，可见较多炎性细胞；第14天的角膜上皮细胞层处新生血管管腔密集粗大，角膜增厚，基质层结构紊乱，大量炎性细胞浸润(图 2)。免疫组化(IHC)结果显示：正常对照组角膜上皮细胞层处无VEGF蛋白阳性染色，实验组第4、7、14天角膜上皮细胞层处均有VEGF蛋白阳性染色，呈棕黄色(图 3)。
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| A: 正常对照组的无血管透明角膜; B: 实验组第4天的角膜; C: 实验组第7天的角膜; D: 实验组第14天的角膜↑：角膜新生血管 图 1 大鼠角膜新生血管(Cor NV)模型 |
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| A: 正常对照组的无血管角膜组织; B: 实验组第4天; C: 实验组第7天; D: 实验组第14天↑：示新生血管管腔 图 2 HE染色观察各组角膜组织新生血管形成及炎性细胞浸润 |
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| A: 正常对照组的无血管角膜组织; B: 实验组第4天; C: 实验组第7天; D: 实验组第14天 图 3 免疫组化检测角膜组织新生血管中VEGF的表达 |
2.2 大鼠Cor NV模型中miR-424(322)-5p和VEGF mRNA的相对表达量
收集正常和建模第4天的角膜组织，RT-PCR检测miR-424(322)-5p、VEGF mRNA的相对表达量。结果显示：建模第4天实验组miR-424(322)-5p、VEGF的表达均高于正常对照组，差异有统计学意义(P < 0.01，图 4)。
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| a: P < 0.01, 与正常对照组比较 图 4 大鼠Cor NV模型角膜组织中miR-424(322)-5p和VEGF mRNA的表达 |
2.3 miRNA-424(322)-5p在HUVECs的表达
脂质体转染HUVECs 24 h后检测各组miRNA-424(322)-5p的表达。与NC组和CON组比较，mimic组miRNA-424(322)-5p的表达显著升高(P < 0.01)，NC组和CON组比较差异无统计学意义。
2.4 miR-424(322)-5p对HUVECs增殖能力的影响HUVECs转染24 h后更换成含有CCK-8试剂的培养基继续培养，并在450 nm波长下测量光密度值。与NC组和CON组比较，mimic组光密度值显著升高(P < 0.01)，而NC组和CON组比较差异无统计学意义(图 5)。
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| a: P < 0.01, 与NC组和CON组比较 图 5 CCK-8检测miR-424(322)-5p对HUVECS增殖能力的影响 |
2.5 miRNA-424(322)-5p对HUVECs迁移能力的影响
划痕实验检测细胞迁移能力，结果显示与NC组和CON组比较，mimic组迁移能力显著增加(P < 0.01)，而NC组和CON组比较差异无统计学意义(图 6)。
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| A: 划痕实验结果; B: 迁移面积统计分析; 1:CON组; 2: NC组; 3: mimic组; a: P < 0.01, 与NC组和CON组比较 图 6 miR-424-(322)-5p对HUVECs迁移能力的影响 |
Transwell实验检测细胞迁移能力，结果显示与NC组和CON组比较，mimic组从上室穿入到下室的细胞数显著增加(P < 0.01)，而NC组和CON组比较无显著增加(P>0.05，图 7)。
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| A: Transwell实验结果; B: 细胞数目统计分析; 1:CON组; 2: NC组; 3: mimic组; a: P < 0.01, 与NC组和CON组比较 图 7 miR-424(322)-5p对HUVECs迁移能力的影响 |
2.6 miRNA-424(322)-5p对HUVECs成管能力的影响
Matrigel基质胶成管实验结果显示，与NC组和CON组比较，mimic组管腔数明显增加(P < 0.01)，而NC组和CON组比较无明显差异(图 8)。
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| A: 成管实验结果；B: 管腔数目统计分析；1:CON组; 2: NC组; 3: mimic组; a: P < 0.01, 与NC组和CON组比较 图 8 miR-424(322)-5p对HUVECs成管能力的影响 |
2.7 miRNA-424(322)-5p对VEGF及Raf/MEK/ERK通路蛋白表达的影响
Western blot检测结果显示，与NC组和CON组比较，miR-424(322)-5p mimic组VEGF、Raf1、p-MEK1及p-ERK1/2蛋白表达显著增加(P < 0.01)；而NC组和CON组比较无明显差异(图 9)。
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| A: Western blot实验结果; B: 各蛋白相对表达量统计; 1:CON组; 2: NC组; 3: mimic组; a: P < 0.01, 与NC组和CON组比较 图 9 miR-424(322)-5p对VEGF及Raf/MER/ERK通路蛋白表达的影响 |
3 讨论
眼表角膜新生血管病变对视力的影响日益增加，已逐渐成为人们重点关注的健康问题。它是由于缺氧及眼部损伤所致的血管生成和抗血管因子之间的不平衡使血管侵入角膜所致[9]。近年来，miRNA与血管存在密切联系，给我们提供了解决角膜新生血管问题的新思路。如在缺血性视网膜中，miRNA-126通过下调p38/ERK来抑制促血管生成基因(如VEGF)的表达以减少新血管的形成[10]；在人视网膜微血管内皮细胞中，miRNA-132被证明通过上调VEGFA和ERK2来促进血管生成[11]；在角膜新血管形成中，miRNA-184通过靶向VEGF和AKT抑制体内血管生成等[12]。本课题组以此为基础进行研究，前期基因芯片筛选结果显示，miRNA-424(322)-5P在大鼠角膜新生血管模型中显著上调[8]。同时，研究表明在缺氧环境下，miR-424靶向cullin2(CUL2)使VCBCR U3-连接酶复合物不稳定，并增加HIF-1α和HIF-2α的水平，从而促进血管形成[13]。故推测miRNA-424(322)-5p可能参与调控角膜新生血管形成。目前为止，HUVECs已被广泛作为体外模拟角膜新生血管形成的模型[14-15]。为此，本研究通过体外实验进行验证，用脂质体转染技术将miRNA-424(322)-5p mimic、NC转染到HUVECs中构建实验模型，其增殖、成管、迁移实验结果表明，miR-424(322)-5p能促进血管形成。而miR-424(322)-5p对角膜新生血管的调控是一个极其复杂的过程，因此，本研究进一步探讨了该基因的可能作用机制。
VEGF在血管形成过程中起重要作用，直接刺激内皮细胞增殖、迁移，促进血管管腔形成[16-17]。同时，VEGF可通过激活下游Raf1/MEK1/ERK1/2参与调控血管形成[18]。研究表明，目前已发现多种microRNA通过激活VEGF及其下游Raf1、MEK1、ERK1/2来影响细胞的增殖、迁移等过程，如miR-429[19]、miR-195[7]、miR-143[20]、miR-101[21]等。因此，我们推测miR-424(322)-5p是否也可以通过激活VEGF及其下游Raf/MEK/ERK通路来调控角膜新生血管的形成？为进一步求证，本研究检测了VEGF及其下游Raf1、p-MEK1/MEK1和p-ERK1/2/ERK1/2蛋白的相对表达量。结果显示，与CON组和NC组比较，mimic组的VEGF、Raf1、p-MEK1和p-ERK1/2的蛋白表达量明显上调。因此，我们推断miR-424(322)-5p可通过激活VEGF及其下游Raf/MEK/ERK通路促进HUVECs增殖、迁移、成管能力，从而促进Cor NV形成。
总之，本研究在大鼠新生血管模型中，miRNA-424(322)-5p及VEGF上调，推断miRNA-424(322)-5p可能参与角膜新生血管的发生、发展。在细胞模型中，miRNA-424(322)-5p可通过上调VEGF及其下游Raf/MEK/ERK通路蛋白的表达，促进HUVECs的迁移、增殖及管腔形成能力。因此，结合体内、体外实验结果，我们推断miR-322(424)-5P可能通过激活VEGF及Raf/MEK/ERK通路促进角膜新生血管的形成。本研究初步验证了miR-424(322)-5p对角膜新生血管形成的影响，并探讨了部分可能机制，为临床预防和治疗角膜新生血管的形成提供新的策略。关于miR-424(322)-5p到底是通过何种机制调控VEGF及其下游Raf/MEK/ERK通路，仍需后续进一步探究。
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