2. 400016 重庆，重庆医科大学基础医学院人体解剖学教研室，神经科学研究中心
2. Department of Human Anatomy, Neuroscience Research Center, College of Basic Medical Sciences, Chongqing Medical University, Chongqing, 400016, China
骨质疏松症是一种以骨量降低，骨组织微结构退化、功能减弱为特征，导致骨强度下降，骨折风险增加的一种慢性系统性骨骼疾病[1]。随着人口老龄化进程加快，骨质疏松症的防治成为一项繁重的公共卫生健康工作，且患病率随着年龄增长而增加，尤其在绝经后的妇女中升高，1/3的女性和1/5的男性在50岁后会遭受骨质疏松性骨折，这将带给全社会巨大的卫生和经济负担[2-3]。
动物模型在骨质疏松症的病理生理改变、探究新型药物和诊疗方法中扮演着必不可少的角色[4]。目前国际社会较多采用的是成本低、实验周期短、模型成熟和伦理影响更小的去卵巢啮齿类动物作为绝经后骨质疏松模型。小鼠虽然体型较小，存在样本量少的弊端，但越来越多的研究确立了小鼠在绝经后骨质流失方面的巨大价值，且小鼠遗传背景明确，基因组结构与人类非常一致，用转基因和突变小鼠研究某些特异性基因在骨生物力学中的作用具有良好前景。这一点相较于大鼠更具优势[5-8]。目前研究显示，不同小鼠骨质疏松模型构建时机在4~9周龄之间，且在去卵巢术后4周至3个月不同时间点均可观察到股骨近远端和胫骨近端骨微结构变化，但骨丢失的程度和进展变化尚未统一[9-13]。C57小鼠相比于其他小鼠在同月龄术后骨量丢失最明显，且进一步证明在C57小鼠8周龄时是造模的适宜时机，此时骨量变化最显著[14]。但是小鼠卵巢摘除后骨质不同时期的动态变化情况目前尚不清楚。
本研究以C57小鼠为实验动物，通过双侧卵巢摘除术诱导骨质疏松模型，模拟绝经后不同时期，应用micro-CT扫描和骨组织切片染色技术，观察术后不同时间点的骨量和骨组织形态学变化，旨在发现小鼠绝经后骨质动态变化规律，为骨质疏松疾病模型观察提供参考，也可以为筛选疾病防治的最佳阶段提供依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物7周龄未孕雌性C57小鼠(SPF级)，购自重庆医科大学实验动物中心，分笼后继续于该中心在标准条件下饲养(相对湿度50%~60%，环境温度(20±2)℃，光/暗周期12 h)，自由饮水及进食。适应性喂养1周后，分为去卵巢组(ovariectomy，OVX)和假手术组(sham ovariectomy, Sham)。所有小鼠采用腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉后，以两个背外侧皮肤切口入路，根据分组摘除双侧卵巢或只去除卵巢周围部分脂肪组织作为对照。两组小鼠分别在术后1周、1个月和3个月时(分别代表绝经后早期、中期和晚期)处死取材，即6个亚组：OVX 1周，Sham 1周，OVX 1个月，Sham 1个月，OVX 3个月和Sham 3个月组，每组6~8只小鼠。各组小鼠称重后处死，剥离双侧股骨并用4%多聚甲醛固定。右侧股骨用于Micro-CT扫描，左侧股骨进行苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE)及免疫组织化学染色。
1.2 组织形态学分析取小鼠左股骨，剥离周围软组织，用4%多聚甲醛固定24~48 h后用EDTA脱钙液(索莱宝，北京)脱钙，直至大头针能轻松插入骨组织内，脱钙完成后进行组织梯度脱水，根据实验所需摆放好标本位置，石蜡包埋，切片(切片厚度5 μm)，然后进行HE染色，光镜下观察小梁微结构改变并拍照(DMi8，莱卡，德国)。
1.3 Micro-CT分析每组均取6只右侧股骨样本进行Micro-CT扫描(Scanco，瑞士)，以股骨远端生长板近端0~100层横切面为评估骨小梁结构的感兴趣区域，股骨中段约1 mm长度(100层横切面)为评估皮质骨感兴趣区域。用Scanco分析软件进行三维重建。分析骨体积分数(bone volume/total volume，BV/TV)，骨小梁数目(trabecular number，Tb.N)，骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)和骨小梁间隙(trabecular spacing，Tb.Sp)，皮质骨面积(bone area，B. Area)，皮质骨体积分数(cortical bone volume/total volume，Ct.BV/TV)，皮质骨密度(bone mineral density，BMD)，皮质骨厚度(cortical bone thickness，Ct.Th)等骨形态参数。
1.4 免疫组织化学染色石蜡切片脱蜡后用3% H2O2于室温下孵育20 min，漂洗后按照试剂盒说明书操作。滴加一抗并4 ℃下孵育过夜，复温漂洗，滴加二抗，37 ℃孵育30 min，漂洗结束后加入显色液，冲洗，苏木精复染切片，封片。显微镜下(Olympus, Shinjuko, Japan)观察拍照。使用Image J(NIH Image J system, Bethesda, MD, USA)软件进行半定量分析。
1.5 统计学分析采用GraphPad Prism 5统计软件进行分析。各组数据以
随术后时间增加，OVX各组和Sham各组小鼠在术后1、3个月时均较1周时体质量有所增长(P < 0.05, P < 0.01)。同时间段OVX组和Sham组比较，OVX组术后1周较Sham组体质量略有升高，但差异无统计学意义，术后1、3个月组小鼠体质量均较同期Sham组显著增加，差异有统计学意义(P < 0.05, P < 0.01，图 1)。结果提示去卵巢术后雌激素骤降使小鼠体内成脂能力明显增强。
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| a: P < 0.05，b: P < 0.01，与同期Sham组比较；c: P < 0.05, d: P < 0.01，与同组别1周组比较 图 1 去卵巢小鼠不同时段体质量变化 |
2.2 去卵巢术后不同时段小鼠股骨远端组织形态学变化
股骨切片HE染色组织学观察结果显示，OVX组从术后1周到3个月，小梁排列逐渐丧失规则，小梁数量减少间隙变大，OVX 3个月组骨质丢失最严重，OVX 1个月组中可见明显的脂滴形成；同期OVX组与Sham组相比，1周组小梁排列较整齐连续；OVX 1、3个月组比同期Sham组小梁断裂增多，且脂滴也较Sham组略有增加(图 2)。
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| 图 2 HE染色观察去卵巢术后不同时段小鼠股骨远端病理学变化 |
2.3 去卵巢术后不同时段小鼠股骨Micro-CT分析及三维重建
如图 3显示，在同期OVX组与Sham组比较中，OVX 1、3个月组BV/TV、Tb.N较Sham组明显降低，Tb.Sp较Sham组明显升高，且差异有统计学意义(P < 0.01)；1周组中二者BV/TV、Tb.Sp、Tb.N差异无统计学意义；Tb.Th在各时期均未见显著改变(P＞0.05)。Sham各组从术后1周至3个月，BV/TV、Tb.N和Tb.Sp有增加或减少趋势，但1个月组较1周组差异均无统计学意义，3个月组BV/TV和Tb.N较1周组有所减小而Tb.Sp明显增大，差异有统计学意义(P < 0.01)。OVX各组从术后1周至3个月BV/TV、Tb.N和Tb.Sp有显著增加或减少趋势，1、3个月组较1周组差异均有统计学意义(P < 0.05, P < 0.01)。Tb.Th除OVX 1个月组较1周组略有增加以外(P < 0.05)，其余时段均较1周组无显著改变。而在皮质骨的各参数变化中(图 4)，各时段同期Sham组与OVX组比较均未发现有明显差异，且Sham组和OVX组都呈现出随时间增加而各项参数增大趋势，在Sham各组中，除Ct.Th和Ct.BV/TV在1个月组较1周组有所增加(P < 0.05)以外，其余参数均在3个月时出现较1周组的显著改变(P < 0.01)。OVX各组仅发现B. Area在1个月时较1周组有所增大，其他参数也均在OVX 3个月时出现较1周组的明显改变(P < 0.01)。
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| A：骨体积分数(BV/TV)；B：骨小梁厚度(Tb.Th)；C：骨小梁数(Tb.N)；D：骨小梁间隙(Tb.Sp)；a: P < 0.01, 与同期Sham组比较；b: P < 0.05, c: P < 0.01, 与同组别1周组比较 图 3 骨小梁形态参数结果分析 |
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| A：皮质骨面积(B. Area)；B：皮质骨体积分数(Ct.BV/TV)；C：皮质骨密度(BMD)；D：皮质骨厚度(Ct.Th) a: P < 0.05, b: P < 0.01，与同组别1周组比较 图 4 皮质骨形态参数结果分析 |
三维重建结果显示在术后1周时，骨小梁数量、密度及髓腔空隙未见明显变化；OVX 1、3个月组较同期Sham组骨小梁更加稀疏，且髓腔空隙较OVX 1周组进一步增大；Sham各组从1周至3个月，随着时间增加，小鼠股骨远端小梁数目和髓腔空隙未见有明显变化，皮质骨未见有明显差异(图 5)。提示去卵巢小鼠至少在术后1个月即发生了显著的松质骨丧失。
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| 红框表示骨小梁感兴趣区域；黄框表示皮质骨感兴趣区域 图 5 股骨远端骨小梁及骨皮质3D重建 |
2.4 去卵巢术后不同时段小鼠股骨远端成骨转录因子Runx2表达变化
图 6结果表明，在术后1周，OVX组Runx2的表达水平较Sham组有所下降，但差异无统计学意义；术后1个月及3个月，OVX组较Sham组Runx2表达出现明显降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。OVX各组中，1个月及3个月组Runx2表达均较1周组有显著下降(P < 0.01)；Sham各组中Runx2蛋白表达水平同样随时间下降趋势，但降低程度不及OVX组(P < 0.05)。结果说明从去卵巢术后1个月开始，成骨相关蛋白Runx2出现与骨量减少相一致的表达水平降低。
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| A: 免疫组织化学染色标记Runx2蛋白；B: Runx2阳性表达水平结果统计a: P < 0.05，与同期Sham组比较；b: P < 0.05, c: P < 0.01, 与同组别1周组比较 图 6 去卵巢术后不同时段小鼠股骨远端Runx2表达变化 |
3 讨论
啮齿类动物卵巢切除后即刻到2周内相当于人类绝经后6个月内，此为绝经早期，卵巢切除3周以后即为绝经中晚期[15]。本实验根据切除卵巢后的不同观察时间点分别模拟人类绝经早期、中期和晚期，假手术组中小鼠体质量随时间自然增长，而去卵巢组小鼠体质量在1、3个月时体质量均比假手术组有明显增加，这与卵巢摘除后体内雌激素撤退，成脂能力增强相关[16]。
Micro-CT分析和HE染色结果说明经去卵巢术后，可成功制备绝经后骨质疏松模型，用于骨质疏松相关疾病的病理机制及药物开发研究。不同的研究由于采用的小鼠种系、周龄大小及观察时间不同，所观察到的骨质疏松表型并非完全一致：WONG等[9]采用4周龄C57小鼠制备去卵巢骨质疏松模型后8周，分析股骨远端、胫骨近端及第一腰椎骨微结构时，虽在股骨远端小梁骨密度、股骨远端及胫骨近端小梁横截面积出现明显减少，但第一腰椎未出现明显改变；YANG等[10]报道9周龄昆明小鼠在摘除双侧卵巢3个月后右侧股骨远端干骺端骨量减少，骨微结构出现明显破坏。8周龄是目前报告较多的模型制备时机，但术后观察时间各有不同。LIANG等[11]观察到8周龄BALB/c小鼠在术后2个月时股骨骨小梁相比于假手术组有明显减少。当对8周龄C57小鼠在术后3个月取材分析股骨近端干骺端骨小梁骨形态参数时也证实其出现了骨丢失[12]。而JANG等[13]同样采用8周龄C57BL/6J小鼠进行实验但将观察时间提前，发现术后4周便出现股骨小梁微结构的显著变化。
在本研究中与同龄小鼠相比，小鼠在绝经早期未出现明显的骨丧失，而随时间延长，到绝经中晚期，可观察到小鼠股骨远端明显的松质骨微结构破坏，骨髓腔隙增大，脂肪细胞增多。假手术组小鼠从术后1周到1个月之间骨微结构并未出现显著变化，假手术组3个月骨量出现轻微下降；去卵巢各组则是从绝经早中期后即发生大量明显的松质骨微结构受损。实验室小鼠通常活2~3年，骨量在4~8个月时达到峰值，随后出现与年龄相关的下降[17-18]。本实验小鼠为8周龄至5月龄大小，小鼠在8周龄时进入体成熟期，激素代谢平稳，可进行实验。但皮质骨形态参数变化似乎整体晚于松质骨变化，Sham组和OVX组都呈现出随时间增加而各项骨参数增大趋势，同时段组二者暂未出现差异。这可能是皮质骨内细胞数明显低于松质骨，雌激素受体ER阳性表达量极低而较少或较晚受到雌激素降低影响的原因[19]。
Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)与骨代谢和骨发育过程密切相关。Runx2作为一种重要的成骨转录因子，负责骨髓基质干细胞向成骨细胞谱分化和成骨细胞成熟[20]，在骨质疏松症的病理机制探索及防治中有重大意义。免疫组化染色提示，术后1周左右小鼠Runx2成骨转录因子表达水平较高，说明此时小鼠成骨处于活跃阶段。Runx2可上调前成骨细胞和软骨细胞中的多种矿化相关蛋白基因如Ⅰ型胶原、骨钙素、骨桥蛋白等转录，在成骨分化早期起决定性作用[21-22]。当进入术后1个月时，无论是去卵巢组还是假手术组，Runx2表达均较1周组有明显下降，而假手术3个月和1个月两组间Runx2蛋白水平未见明显差异。表明正常生理状态下即使小鼠骨量仍在增加，可能其成骨活性已趋于平缓。
去卵巢后1周相当于人类绝经早期，此时小鼠未出现明显骨量下降，从术后1周到1个月，骨微结构变化显著，成骨转录活性也在此时期有明显下降，因此该阶段应作为研究骨质疏松病理生理机制改变的重点阶段，而在考虑抗骨质疏松药物筛选时，应该把干预时间尽量安排在术后1个月之内甚至1周之前。
本实验进一步证明了8周龄小鼠骨量稳定，成骨转录活性较高，是适宜的骨质疏松动物模型，去卵巢手术后可以观察到明显的松质骨骨量改变，尤其在术后1个月内，而同时期Sham组骨微结构未出现明显改变。但由于小鼠皮质骨变化并不明显，若是仅仅通过卵巢摘除手术而观察骨量变化，皮质骨并不适宜于和松质骨同期观察。因此，骨质疏松的防治研究可将术后1个月左右作为观察重点阶段，检测小鼠的松质骨各项指标变化，而皮质骨改变可能会受后期衰老等多种因素的影响。但由于小鼠的遗传背景优势，去卵巢小鼠不失为一种探讨受雌激素降低作用而导致包含骨质疏松在内的多疾病交互影响的可供参考的模型。
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