2. 400038 重庆，陆军军医大学(第三军医大学)军事预防医学系毒理学研究所;
3. 400700 重庆，西南大学药学院中医药学院
2. Institute of Toxicology, Faculty of Military Preventive Medicine, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400038;
3. College of Pharmaceutical Sciences and Chinese Medicine, Southwest University, Chongqing, 400700, China
随着社会的发展进步，人类显著增长的平均寿命和日趋下降的生殖健康水平之间出现了不对等、不均衡的发展。据估计，全世界有8%~12%的夫妻出现不孕不育症，其中男性不育症占一半以上[1-2]。研究表明，基因之间复杂的相互关系以及环境条件是造成男性生殖功能损伤的重要原因[3-5]。睾丸作为雄性生殖和内分泌系统的重要组成部分，其主要功能是产生精子和雄性激素。在哺乳动物的睾丸组织中，生殖细胞在生精小管中，主要产生精子；睾丸间质细胞分布在曲精小管之间，合成和分泌雄性必需的雄激素；睾丸支持细胞在曲细精管的基膜上附着，为生殖细胞的分化和成熟提供必要的环境。机体需要精确调节这些细胞的数目和形态，以确保雄性生殖和内分泌系统有条不紊地运转。既往针对睾丸发育和精子形成的研究多数集中在生精细胞的增殖调控、分化等方面，而睾丸间质细胞的增殖研究相对较少[6]。睾丸间质细胞增殖或功能受损会导致雄激素生成异常，并影响两性分化、性腺发育以及精子生成[7]。动物实验结果显示，全氟辛酸[8]、黄曲霉毒素B1[9]等化学物的暴露可能会抑制睾丸间质细胞的增殖和分化，进而影响其发育和功能。同时，也有研究表明邻苯二甲酸酯类物质暴露会造成睾丸间质细胞反馈性增生，其类固醇激素生物合成功能也显著降低[10-11]。可见睾丸间质细胞稳态的维持在雄性生殖和内分泌系统发挥着重要的作用，其异常的改变均可能造成雄性生殖功能不同程度的损害。因此，研究睾丸间质细胞增殖与功能的调控机制，对于全面认识生殖发育异常具有重要的意义。
我们前期研究发现，Sox30基因作为Sox[SRY(sex-determining region Y)-box]家族H亚族新发现的唯一成员，在成体小鼠睾丸中高表达，Sox30基因缺失会导致精子发生障碍和雄性小鼠不育[12]。最新的研究还发现，Sox30的甲基化失活会导致睾丸发育异常及精子发生障碍，并可能导致临床非梗阻性无精症(non-obstructive azoospermia，NOA)的发生，可作为临床NOA治疗的候选靶标[13]。同时，我们初步发现，Sox30基因敲除后，睾丸组织中睾酮水平显著下调，提示Sox30对睾丸间质细胞具有重要的影响。但是具体的调控作用还不清楚，这就有必要通过系统的体内外实验解析Sox30对睾丸间质细胞的调控作用。
因此，本课题利用前期成功构建的Sox30基因敲除小鼠模型[14]，分析该基因敲除对小鼠睾丸间质细胞增殖的影响；采用慢病毒感染及siRNA干扰技术构建体外差异表达小鼠睾丸间质细胞模型，探讨Sox30基因对小鼠睾丸间质细胞增殖的作用及分子机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物和细胞株利用课题组前期成功构建的Sox30敲除小鼠动物模型[14]，通过PCR鉴定Sox30-/+(杂合型)雌雄小鼠合笼繁殖的后代基因型，获得Sox30+/+(野生型)、Sox30-/+(杂合型)和Sox30-/- (纯合缺失型)实验小鼠。TM3细胞购自美国ATCC细胞库，该细胞来源于小鼠睾丸间质，上皮细胞样形态，贴壁生长，可作为小鼠睾丸间质细胞体外细胞实验模型。TM3细胞于10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，置于37 ℃，湿度70%~80%，CO2浓度为5%的细胞培养箱中培养，细胞生长至对数生长期进行传代培养。
1.1.2 主要试剂DMEM培养基购自美国Sigma公司；胎牛血清、Opti-MEM培养基购自美国Gibco公司；GoScriptTM逆转录试剂盒、2×GoTaq®qPCR GreenMaster Mix购自美国Promega公司；Cell Counting Kit-8、RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒均购自中国上海碧云天公司。脂质体Lipofectamin 2000购自美国Invitrogen公司。Cyclin D1、Cdk2抗体均购自英国Abcam公司；β-actin、GAPDH、Flag抗体均购自中国上海碧云天公司；siRNA购自上海生工生物工程股份有限公司; Sox30过表达载体PGMLV-6751购自上海吉满生物科技有限公司。
1.2 实验方法 1.2.1 Sox30基因敲除小鼠睾丸组织取材及病理分析采用PCR技术鉴定Sox30敲除小鼠基因型，鉴定方法参考课题组前期研究报道[14]，引物序列见表 1。分别选取10周龄的Sox30+/+(野生型)、Sox30-/+(杂合型)和Sox30-/-(纯合缺失型)雄性小鼠各5只，脱臼颈椎法处死各组小鼠后用眼科剪切开腹部解剖出小鼠一侧睾丸，Boulin固定液固定，经过梯度脱水、透明、浸蜡、包埋、修块、切片、脱蜡和水化后，进行HE染色，光学显微镜观察各组小鼠睾丸组织的病理学改变。
| 编号 名称 | 序列(5′→3′) | 产物长度/bp |
| 一号引物对 | ||
| Sox30-KItF1 | GAAGTCACTACAACCAAATACTAC | 659 |
| Common En2-R | CCAACTGACCTTGGGCAAGAACAT | |
| 二号引物对 | ||
| Sox30-KItR2 | GAAGTCATTGACAGCAGATCGAGTG | 648 |
| Sox30-H4SeqF | CAGAACATTTCTCTCCGGAAC | |
| 三号引物对 | ||
| Sox30-KItF2 | GCAAGTCCTTAGAATTAGTTCAC | 772 |
| Sox30-wtR1 | CTATGCAGTTCATAAAAGCACCATC |
1.2.2 Sox30敲除小鼠组织免疫组化检测
将上述各组小鼠的睾丸石蜡切片，脱蜡至水，经柠檬酸抗原修复，放入3%双氧水溶液避光孵育，3% BSA封闭。一抗4 ℃孵育过夜，加一抗相应种属的二抗室温孵育50 min，DAB显色。苏木精复染，苏木精返蓝液返蓝，脱水、透明，中性树胶封片，光镜下观察并拍照。
1.2.3 慢病毒感染构建Sox30过表达TM3细胞模型将生长至对数期的TM3细胞以1.0×105个/孔接种于6孔板中，待完全贴壁后替换成含Sox30过表达慢病毒或空载体病毒的完全培养基(MOI=20)，37 ℃培养48 h，更换成新鲜完全培养基，继续培养。感染病毒72 h后，采用荧光显微镜观察细胞荧光强度及比例并收集细胞鉴定感染效率。
1.2.4 siRNA转染构建Sox30敲低细胞模型在上述Sox30过表达TM3细胞模型基础上，采用siRNA转染技术构建Sox30敲低细胞模型。待细胞培养至对数期时，按1.2×105~1.5×105个/孔接种至6孔板，配制20 pmoL/μL的siRNA溶液，先取6 μL的siRNA加入250 μL Opti-MEM培养基中混匀；再取6 μL的Lipofectamine2000加入250 μL Opti-MEM培养基中，混匀静置5 min；最后将含有Lipofectamine2000的Opti-MEM培养基加入含有siRNA的Opti-MEM培养基中，轻轻混匀，室温孵育20 min后加入培养皿，培养6 h后更换完全培养基继续培养，48 h后收集细胞进行转染效率检测。si-Sox30干扰序列见表 2。
| 名称 | 序列(5′→3′) |
| Sox30-NC | 正义链：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT 反义链：ACGUGACACGUUCGGAGAATT |
| siSox30-3 | 正义链：CCUACCUACUCUGUGGUAATT 反义链：UUACCACAGAGUAGGUAGGTT |
| siSox30-4 | 正义链：CCUUUCAUCACCCUUACUUTT 反义链：AAGUAAGGGUGAUGAAAGGTT |
1.2.5 CCK-8分析细胞增殖
TM3细胞感染病毒72 h后，收集细胞以3×103/孔接种于96孔板，Sox30过表达细胞分为2组：Vector(空载)组和Sox30(过表达)组；Sox30敲低细胞分为Sox30-NC(阴性对照)组、siSox30-3(干扰)组。待完全贴壁后，分别于0、24、48、72 h按试剂说明书加入增强型CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，在酶标仪上测定450 nm波长处的光密度值[D(450)]。
1.2.6 检测细胞周期变化将细胞以1.0×105~2.0×105个/孔接种于6孔板中，待完全贴壁后，用1%的血清培养基饥饿12 h后，过表达和干扰Sox30基因48 h，收集各组细胞，用75%预冷的乙醇于－20 ℃冰箱内固定细胞24 h，分别加入RNase A和碘化丙二醇(PI，碘化丙啶)溶液，37 ℃避光孵育30 min。200目尼龙网过滤粘连细胞，采用C6流式细胞仪检测细胞DNA含量的变化。细胞周期结果通过FlowJo 7.6.1软件进行分析。
1.2.7 基因mRNA表达水平的验证各组细胞生长达到80%~90%，细胞样本通过TRIzol裂解液充分裂解以提取总RNA。使用紫外可见分光光度仪测定RNA样本浓度及纯度。使用GoScriptTM逆转录试剂盒，按照试剂盒说明书上的方法步骤吸取2 μg上述RNA进行逆转录合成cDNA，于－20 ℃低温保存。使用2×GoTaq®qPCR GreenMaster Mix进行RT-qPCR试验，引物序列见表 3。反应条件如下：①1个循环，预变性：95 ℃，40 s；②共45个循环，变性：95 ℃，40 s；退火：60 ℃，40 s；延伸：72 ℃，50 s；③72 ℃，5 min。每个样品3个复孔，以GAPDH为内参，采用相对定量2- ΔΔCt法对数据进行分析。
| 基因 | 序列(5′→3′) | 产物长度/ bp |
| Sox30 | 正向：CCCATTCCACACTCACACGTCTA 反向：AACCAAGACATTCTGGCATTGAACT |
130 |
| Ccnd1 | 正向：GCGTACCCTGACACCAATCTC 反向：ACTTGAAGTAAGATACGGAGGGC |
94 |
| Ccne1 | 正向：CCGTCTTGAATTGGGGCAATA 反向：GAGCTTATAGACTTCGCACACC |
167 |
| Cdk2 | 正向：CTCTCACGGGCATTCCTCTTC 反向：CCCTCTGCATTGATAAGCAGG |
133 |
| Cdk4 | 正向：AAGGTCACCCTAGTGTTTGAGC 反向：CCGCTTAGAAACTGACGCATTAG |
119 |
| Cdk6 | 正向：TGGACATCATTGGACTCCCAG 反向：TCGATGGGTTGAGCAGATTTG |
94 |
| GAPDH | 正向：AGGTCGGTGTGAACGHGATTTG 反向：TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA |
123 |
1.2.8 Western blot检测
过表达或干扰Sox30基因48 h后，收集各组细胞，充分裂解收集上清，并按照BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)说明书步骤测定总蛋白浓度，蛋白变性后于－20 ℃保存。按SDS-PAGE凝胶后取每个样本60 μg进行电泳后，转移至PVDF膜，3%BSA封闭1 h，分别加入不同稀释比例的鼠来源β-actin抗体、Flag抗体；兔来源CyclinD1、Cdk2抗体后，于摇床上4 ℃低温过夜，室温孵育二抗1 h，发光液A液与B液按1 ∶1避光配比后曝光显影条带。以β-actin或GAPDH为内参蛋白，蛋白条带通过Image J软件进行分析。
1.2.9 JASPAR数据库预测在NCBI中以目的基因名称为“CyclinD1”、“Cdk2”，物种为“小鼠(小家鼠)”，搜索得到目的基因的基因组结构。判断它们的转录方向，以基因起点上游2 000 bp及下游100 bp为基因潜在启动子区域计算得到它们的启动子区域。在JASPAR数据库中检索转录因子名称为“Sox30”，物种为“小鼠(小家鼠)”，得到Sox30转录因子列表。设置分析阈值为80%，将NCBI中获得的CyclinD1、Cdk2的启动子区域序列导入JASPAR预测网站中，得到Sox30与CyclinD1、Cdk2可能的结合位点。
1.3 统计学分析采用SPSS 25.0统计软件进行分析，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 Sox30基因敲除小鼠模型基因鉴定结果一号和二号引物为纯合缺失Sox30基因型引物，三号引物为野生型引物。根据PCR结果判定小鼠基因型，当出现一号、二号引物未见扩增产物，三号引物有扩增产物时，鉴定为Sox30+/+(野生型)；当三对引物同时有扩增产物时，鉴定为Sox30-/+(杂合型)；引物一、二同时有扩增产物而三号引物扩增产物缺失，鉴定为Sox30-/-(纯合缺失型)。结果如图 1所示：样本6、7、8鉴定为Sox30+/+(野生型)；样本1、4、9鉴定为Sox30-/-(纯合缺失型)；样本2、3、5鉴定为Sox30-/+(杂合型)。
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| 1~9：为样本编号 图 1 Sox30敲除小鼠基因型鉴定结果 |
2.2 Sox30敲除小鼠睾丸组织病理形态及睾丸间质细胞增殖分析
前期课题组成功构建了Sox30敲除小鼠[14]，对10周龄Sox30敲除小鼠睾丸组织进行HE染色，通过光学显微镜进行病理形态学观察，发现Sox30+/+(野生型)和Sox30-/+(杂合型)小鼠睾丸组织的曲细精管形态规则呈圆形、类圆形，曲细精管外睾丸间质细胞分布均匀，曲细精管中含有大量的精子；而Sox30-/-(纯合缺失型)小鼠睾丸组织的曲细精管明显的发育不良，曲细精管中几乎不存在精子，睾丸间质细胞发现明显增生(图 2)。
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| 箭头示小鼠睾丸间质细胞阳性染色区域阳性 图 2 HE染色观察不同基因型小鼠睾丸间质细胞病理形态特征 |
2.3 Sox30敲除小鼠睾丸间质细胞免疫组化染色
为了明确Sox30基因敲除后小鼠睾丸间质细胞数目的改变，使用睾丸间质细胞特异性表达蛋白3β-HSD对10周龄Sox30敲除小鼠的睾丸组织进行免疫组化检测。结果显示，与Sox30+/+(野生型)和Sox30-/+(杂合型)相比，Sox30-/-(纯合缺失型)小鼠睾丸组织中表达3β-HSD的睾丸间质细胞增多，进一步证实Sox30基因敲除后睾丸间质细胞增殖异常(图 3)。
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| 箭头示小鼠睾丸间质细胞3β-HSD阳性染色区域 图 3 免疫组化染色观察Sox30敲除小鼠睾丸间质细胞特异表达蛋白3β-HSD变化 |
2.4 Sox30过表达TM3细胞模型的构建以及对增殖的影响 2.4.1 Sox30过表达TM3细胞模型的构建
为了进一步探讨体内Sox30敲除对小鼠睾丸间质细胞增殖的影响，利用体外小鼠睾丸间质细胞系TM3构建Sox30过表达细胞模型，并采用RT-qPCR对Sox30基因的mRNA表达水平进行检测。在构建Sox30基因过表达细胞过程中，光学和荧光显微镜观察显示，与Vector组相比，Sox30过表达组细胞数量相对减少(图 4A)。RT-qPCR结果显示，与Vector组比较，Sox30组的细胞中Sox30表达明显增高(P < 0.01，图 4B)；同时，Western blot检测结果显示，其蛋白水平与其mRNA表达水平一致(图 4C、D)。说明成功构建了Sox30基因体外过表达细胞模型，并可用于后续的实验。
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a: P < 0.01, 与Vector组比较 A: 光学显微镜、荧光显微镜观察Vector组和Sox30组TM3细胞数量变化；B：RT-qPCR检测Vector组和Sox30组Sox30 mRNA相对表达；C、D：Western blot检测Vector组和Sox30组中Sox30的蛋白表达及半定量分析 图 4 Sox30过表达TM3细胞模型的构建 |
2.4.2 Sox30过表达对TM3细胞增殖和周期的影响
基于上述Sox30过表达细胞模型，采用CCK-8对细胞增殖进行定量分析。与对照组相比，结果显示随着时间的增加，Sox30过表达组细胞存活率明显降低(P < 0.05，图 5A)，提示Sox30过表达可以抑制睾丸间质细胞的增殖能力。为了明确Sox30引起睾丸间质细胞增殖抑制的原因，使用PI荧光染色和流式细胞术检测Sox30过表达TM3细胞周期进展情况。结果显示，与空载体组比较，Sox30过表达TM3细胞G1期比例增高，差异具有统计学意义(P < 0.05)，提示Sox30过表达可诱导TM3细胞G1期阻滞。
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| a: P < 0.05，b: P < 0.01，与Vector组比较；A：CCK-8检测Vector组和Sox30组在不同时间的细胞存活率变化；B: 流式细胞术检测Vector组和Sox30组TM3细胞生长48 h后的周期分布情况 图 5 Sox30过表达对TM3细胞增殖和周期的影响 |
2.5 Sox30敲低TM3细胞模型的构建以及对增殖的影响 2.5.1 Sox30敲低TM3细胞模型的构建
为了进一步证实Sox30基因对小鼠睾丸间质细胞周期的调控作用，在Sox30过表达TM3细胞的基础上敲低了Sox30基因。在镜下发现，与Sox30基因过表达TM3细胞增殖抑制作用相反。结果显示，与Sox30-NC组相比，Sox30基因干扰后，其细胞数目增多，明显促进了TM3细胞增殖(图 6A)。同时，RT-qPCR(图 6B)和Western blot(图 6C、D)检测结果显示：与Sox30-NC组比较，siSox30-3组、siSox30-4组中Sox30基因的表达受到了抑制，尤其是siSox30-3的抑制更为显著，其差异具有统计学意义(P < 0.01)。因此，选用干扰效率最高的siSox30-3组进行后续研究。
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a: P < 0.01，与Sox30-NC组比较 A: 光学显微镜、荧光显微镜观察各组TM3细胞数量变化; B：RT-qPCR检测各组Sox30基因的mRNA相对表达; C、D: Western blot检测各组Sox30基因的蛋白表达及半定量分析 图 6 Sox30敲低TM3细胞模型的构建 |
2.5.2 Sox30敲低对TM3细胞增殖和周期的影响
进一步利用CCK-8对TM3细胞增殖进行了检测，与对照组相比(图 7A)，随着时间的增加，Sox30干扰组的细胞数量明显增加，其差异具有统计学意义(P < 0.01)。Sox30干扰细胞周期流式细胞术分析也表明，与Sox30-NC组比较(图 7C)，siSox30-3组(图 7D)细胞G1期比例降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)，提示Sox30敲低可部分恢复TM3细胞G1期阻滞，促进细胞从G1向S期转化。
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a: P < 0.05，b: P < 0.01, 与Sox30-NC组比较 A: CCK-8检测Sox30-NC组和siSox30-3组在不同时间的细胞存活率变化；B: 流式细胞术检测Sox30-NC组和Sox30-NC组TM3细胞生长48 h后的周期分布情况 图 7 Sox30敲低表达对TM3细胞增殖和周期的影响 |
2.6 Sox30差异表达对TM3细胞周期关键分子mRNA水平的影响
为了验证流式细胞术检测结果，进一步检测了调控细胞周期进展关键基因的mRNA水平表达情况。结果发现，与Vector组比较(图 8A)，Sox30过表达组Ccnd1、Cdk6(P < 0.05)，Cdk2、Cdk4(P < 0.01)的mRNA表达水平显著降低，Ccne1的mRNA表达水平无明显改变。敲低Sox30基因后，发现与Sox30-NC组相比(图 8B)，siSox30-3组的Ccnd1、Cdk6(P < 0.01)，Ccne1、Cdk2(P < 0.05)的mRNA表达水平都显著增加，Cdk4的mRNA表达水平无明显改变。
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a: P < 0.05，b: P < 0.01，与Vector组比较；c: P < 0.05，d: P < 0.01，与Sox30-NC组比较 A：RT-qPCR检测Vector组和Sox30组Ccnd1、Ccne1、Cdk2、Cdk4、Cdk6的mRNA相对表达；B: RT-qPCR检测Sox30-NC组和siSox30-3组Ccnd1、Ccne1、Cdk2、Cdk4、Cdk6的mRNA相对表达 图 8 Sox30差异表达对TM3细胞周期相关分子mRNA水平的影响 |
2.7 Sox30差异表达对TM3细胞周期相关分子蛋白水平的影响
结果显示，与Vector组比较(图 9A、B)，Sox30过表达组CyclinD1(P < 0.05)、Cdk2(P < 0.01)蛋白表达水平显著降低。敲低Sox30基因后，我们发现与Sox30-NC组相比(图 9C、D)，siSox30-3组的CyclinD1(P < 0.01)、Cdk2(P < 0.05)的蛋白表达水平显著增加。其结果提示，Sox30差异表达后CyclinD1、Cdk2的蛋白表达水平较为一致，推测它们可能是Sox30参与周期调控的下游关键分子。
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a: P < 0.05，b: P < 0.01，与Vector组比较；c: P < 0.05，与Sox30-NC组比较 A：Western blot检测Vector组和Sox30组CyclinD1、Cdk2的蛋白表达及半定量分析；B: Western blot检测Sox30-NC组和siSox30-3组CyclinD1、Cdk2的蛋白表达及半定量分析 图 9 Sox30差异表达对TM3细胞周期相关分子蛋白水平的影响 |
2.8 Sox30与细胞周期相关分子的启动子区结合位点预测
利用JASPAR数据库从分子水平预测Sox30是否与细胞周期关键分子CyclinD1、Cdk2的启动子区存在结合位点(表 4)。其中，预测评分的分值越高，预测结果越可信。结果发现，细胞周期关键分子CyclinD1、Cdk2的启动子区域均可能存在Sox30的结合位点，提示CyclinD1、Cdk2可能是Sox30调控的下游候选基因。
| 目的基因 | 转录因子的编号 | 转录因子的名称 | 预测评分 | 相对评分 | 起点 | 终点 | 正负链 | 预测的序列 |
| CyclinD1 | PB0070.1 | Sox30_1 | 9.52 | 0.84 | -775 | -790 | + | ACTAAATAATGGACGA |
| PB0070.1 | Sox30_1 | 9.34 | 0.83 | -1263 | -1278 | + | ATGAAATAATGGCCAC | |
| PB0174.1 | Sox30_2 | 11.04 | 0.82 | -835 | -850 | - | TAAGTTTATAATTTAT | |
| Cdk2 | PB0070.1 | Sox30_1 | 10.74 | 0.86 | -1682 | -1697 | - | AAAGAATAATGTATTT |
| PB0070.1 | Sox30_1 | 8.66 | 0.82 | -538 | -553 | + | CTTGAACAAATAAAAA | |
| PB0070.1 | Sox30_1 | 8.54 | 0.81 | -2043 | -2058 | - | TTGAAACAATGTTGCC |
3 讨论
细胞增殖是机体正常生长、发育、繁殖的生物基础，正常组织中特异性细胞增殖稳态的维持是组织器官功能正常执行的结构基础。睾丸间质细胞是位于男性性腺睾丸中的必需细胞，因此其正常增殖与数目的稳定对于睾丸功能具有重要的作用。
课题组前期研究发现，Sox30基因敲除小鼠的生精小管中几乎没有精子，同时在成年小鼠中重新表达Sox30基因，精子的发生有所恢复[15]。本研究发现, 与Sox30+/+(野生型)和Sox30-/+(杂合型)小鼠相比，Sox30-/-(纯合缺失型)小鼠睾丸组织曲细精管外睾丸间质细胞发生明显增生。在睾丸组织中3β-HSD是完全定位于睾丸间质细胞的，因此3β-HSD可以作为睾丸组织中间质细胞的特异性标志。通过对其睾丸组织进行3β-HSD蛋白的免疫组化染色处理，进一步证实Sox30基因敲除后小鼠睾丸组织中间质细胞数目显著增加。在前期研究中已证实，Sox30基因敲除可以导致小鼠睾丸组织匀浆液中睾酮水平下降，ANITHA等[16]在鱼类中也发现体内短暂沉默Sox30可导致血清睾酮水平下降。这些研究结果提示，Sox30基因敲除后可能打破了小鼠睾丸间质细胞原本相对稳定的增殖状态以及激素分泌功能的调控能力。尽管在Sox30基因敲除雄性小鼠睾丸间质细胞数目增加，但是整体的睾酮水平与野生型相比反而更低，提示Sox30基因敲除导致的睾丸间质细胞增生可能属于病理性异常增生，从而导致睾酮合成受阻。
为了进一步验证Sox30影响小鼠睾丸间质细胞增殖的体内实验结果，本研究利用TM3小鼠睾丸间质细胞构建Sox30差异表达细胞体外模型，结果证实Sox30对TM3细胞增殖调控与体内的观察结果一致。表现为与Vector组相比，Sox30组可导致TM3细胞存活率降低，G1期细胞周期阻滞。敲除Sox30基因后发生逆转，表现为siSox30-3组TM3细胞存活率增加，G1期细胞周期阻滞恢复。细胞分裂周期G1期的重要作用是对下一个阶段的S期建立有效的DNA复制条件，如果G1期出现了调控紊乱，则DNA复制可能受到损害以及出现基因组的不稳定，从而导致DNA损伤和肿瘤的发生[17]。目前，关于Sox30基因在细胞增殖过程中的作用研究主要集中在肿瘤细胞当中，例如肺腺癌[18]、前列腺癌[19]，表明在体外Sox30基因高表达后显著抑制肿瘤细胞的增殖和调控细胞周期。进一步证实Sox30基因可以通过影响细胞周期调控睾丸间质细胞的正常增殖。
细胞周期功能异常通常意味着细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)的表达改变以及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitor, CKI)的激活。在G1期早期进程中，有丝分裂原刺激哺乳动物细胞从静止状态进入分裂周期，并且触发了细胞周期蛋白D的产生，随后它可以结合并激活Cdk4和Cdk6蛋白激酶(即细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶4和6)。细胞周期蛋白D/Cdk4-6复合物通过单磷酸化其抑制剂Rb去抑制E2F的表达。在G1晚期进程中，编码细胞周期蛋白E被急剧激活，它可以结合并激活Cdk2蛋白激酶(即细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶2)，然后在正反馈过程中过度磷酸化并且失活Rb。有研究表明，Rb单磷酸化的14个主要位点可以介导E2F1转录调控的不同模式，表明G1期转录过程十分复杂[20]。通过RT-qPCR法检测发现，Sox30表达水平升高时，Ccnd1、Cdk2表达水平均出现不同程度的降低，对Sox30基因进行干扰后，可以少量恢复Ccnd1、Cdk2的表达。另外，本研究通过Western blot法对这些分子的蛋白水平进行检测，结果显示差异表达Sox30后，CyclinD1和Cdk2在蛋白水平出现明显的改变。这提示CyclinD1和Cdk2可能是Sox30基因对小鼠睾丸间质细胞G1期进程影响中的关键下游靶基因。Cyclin D1在有生长因子的情况下，首先被合成并于G1中期达到高峰，该基因的异常表达会改变细胞周期进程，且常发生在多种肿瘤当中，如肾癌发生[21]。Cdk2被称作细胞周期蛋白依赖性激酶2。有研究表明在雄性生殖细胞发育中Cdk2激酶活性的精确调节对于促性腺细胞向精子细胞的转化和长期的生精稳态发挥着重要的作用[22]。最后，本研究采用生物信息学方法对Sox30基因与细胞周期关键基因的启动子区结合位点进行预测发现，细胞周期关键基因CyclinD1、Cdk2的启动子区域均存在Sox30可能的结合位点。该结果提示，Sox30作为转录因子有可能特异性识别并结合于CyclinD1、Cdk2基因上游启动子区，进而调控这些基因的转录和表达。
此外，本研究还存在以下几个问题值得进一步探索：①细胞周期相关基因CyclinD1、Cdk2受Sox30调控，且启动子区存在Sox30的结合位点，但具体的分子调控机制还需要通过实验研究加以解析；②Sox30缺失后，除可通过间质细胞影响睾酮水平影响精子发生外，我们最新的研究也证实Sox30在生精细胞中表达，可以直接通过调控减数分裂影响精子的发生，但是二者之间的重要性和因果关系还需要更深入的研究；③本研究发现，Sox30基因敲除后小鼠睾丸组织匀浆中睾酮水平显著降低，然而Sox30缺失导致睾酮水平降低的具体原因和分子机制目前尚不清楚，仍需后续进一步的深入研究。
综上，本研究发现Sox30基因可能参与小鼠睾丸间质细胞正常增殖状态调控，其可能是通过转录调控CyclinD1、Cdk2的表达影响细胞周期G1期来实现。Sox30基因作为转录因子有可能通过转录调控影响相关分子的表达，后续我们将围绕转录调控机制开展更为详细的研究，为深入了解Sox30在男性生殖系统的功能和作用机制提供新的资料。
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