表1(Table 1)
2. 400042 重庆, 陆军特色医学中心野战外科研究所特殊环境战伤防治研究室;
3. 400010 重庆, 重庆市中医骨科医院骨科
2. Department of Special Environmental Warfare Injury Prevention and Control, Institute of Surgery Research, Army Characteristic Medical Center, Chongqing, 400042;
3. Department of Orthopedics, Chongqing Orthopedic Hospital of Traditional Chinese Medicine, Chongqing, 400010, China
星形胶质细胞是中枢神经系统中含量最丰富，分布最广的一类神经胶质细胞，在突触形成、控制神经递质释放和摄取、营养因子的产生和控制神经元存活等方面起着重要作用[1]，可介导诸如阿尔茨海默症[2]、癫痫[3]等多种中枢神经系统疾病的病变进程。中枢神经系统通常需要快速高效的氧化代谢运转，当氧化代谢异常时会出现氧化应激反应，通过损伤细胞脱氧核糖核酸、碳水化合物、蛋白质和脂质，从而引发细胞毒性导致中枢神经系统细胞损伤[4]。在发生氧化应激反应时，探讨如何保护中枢神经系统细胞中占据重要份额的星形胶质细胞，已成为中枢神经系统疾病基础研究领域的热点之一[5]。川芎嗪(tetra methyl pyrazine，TMP)是中药川芎中的活性生物碱成分，现代药理学研究表明TMP具有阻滞钙离子通道、抗氧化、保护神经、抑制血小板凝集、抗炎等作用[6]。临床上主要用于治疗脑缺血、脑梗死、冠心病等缺血性心血管疾病[7]。相关研究表明，TMP能抑制自由基介导的神经元凋亡在缺血性中风中发挥神经保护的作用[8]，另有研究表明TMP可以通过抑制氧化应激反应参与脑缺血再灌注损伤的神经保护[9]。TMP对于治疗中枢神经系统疾病有巨大潜力，但是对星形胶质细胞氧化应激损伤的保护作用至今尚不清楚。因此，本研究以大鼠星形胶质细胞为研究对象，体外模拟氧化应激损伤环境，探讨TMP对氧化应激所致大鼠星形胶质细胞损伤的保护作用。
1 材料与方法 1.1 实验动物、试剂与设备SPF级新生24~48 h Sprague-Dawley大鼠，购自陆军军医大学大坪医院实验动物中心，动物生产许可证号SCXK(渝)2012-0005。所有操作按照《医学实验动物管理实施细则》要求，符合动物福利与伦理原则。
实验试剂包括：TMP(纯度≥98%)、过氧化氢溶液、无菌细胞爬片、L-多聚赖氨酸、CCK-8、DAPI、DyLight488标记山羊小鼠二抗(北京索莱宝公司)；胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)；高糖DMEM培养基、磷酸盐缓冲液(PBS)、青霉素+链霉素双抗、0.25%胰酶(美国HyClone公司)；PI3K一抗、AKT一抗、p-AKT一抗、Caspase-3一抗(美国Abcam公司)；兔多克隆抗胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗体(美国Invitrogen公司)；Bax一抗、HRP标记山羊抗兔二抗、HRP标记驴抗山羊二抗、HRP标记山羊抗小鼠二抗、HRP山羊抗大鼠二抗(武汉塞维尔生物科技有限公司)；Bcl-2一抗(武汉三鹰生物技术有限公司)；乳酸脱氢酶(LDH)含量检测试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定、蛋白上样缓冲液、RIPA细胞裂解液、ECL发光测试盒(上海碧云天公司)；10%蛋白电泳预制胶、MOPS电泳液(南京金斯瑞公司)；Annexin V-FITC/PI(天津三箭生物技术有限公司)。RNAiso Plus、PCR逆转录试剂盒、SYBR(日本TaKaRa公司)。
实验设备包括：激光共聚焦显微镜(德国Leica公司)；荧光显微镜(日本Olympus公司)；细胞培养箱、酶标仪、-80 ℃冰箱(美国Tmermo Fisher Scientific公司)；蛋白电泳、电转仪、T100梯度PCR仪、CFX Connect型Real-Time PCR仪(美国Bio-Rad公司)；Odyssey FC近红外双色激光和化学发光功能成像系统(德国LI-COR公司)。
1.2 大鼠星形胶质细胞原代及传代培养取24 h内的新生SD大鼠，用体积为75%的乙醇溶液麻醉5 min，眼科剪快速取全脑置于含预冷的PBS培养皿中，充分清洗后仔细剥除脑膜和血丝，轻轻夹取大脑皮质至另一含预冷DMEM的培养皿中，清洗过后将大脑皮质置于培养皿中，用眼科剪剪成1 mm3左右小块，加入0.25%胰蛋白酶置于37 ℃培养箱中消化20 min，加入等体积的FBS，终止消化，轻轻吹散，充分混匀，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入含10%FBS终培养基重悬细胞，70 μm细胞筛过滤为单细胞悬液；1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入体积分数为10%FBS的培养基重悬细胞，计数，以2×105/mL接种于预先被L-多聚赖氨酸包被的6 cm2培养皿中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，差速黏附处理30 min，轻轻翻转培养皿，吸出未贴壁细胞悬液接种至另一培养皿中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中，每2~3天半量换液，7~8 d传代。传代时，加入0.25%胰蛋白酶，37 ℃消化5~10 min，用含体积分数为10%FBS的培养基终止消化，1 000 r/min离心5 min，弃上清，重悬，计数，以2×105/mL接种于预先被L-多聚赖氨酸包被的6 cm2培养皿中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，差速黏附处理30 min，轻轻翻转培养皿，吸出未贴壁细胞悬液接种至另一培养皿中，机械置于37 ℃、5%CO2培养箱中，每2~3天半量换液。7~8 d再次传代。
1.3 细胞分组培养的星形胶质细胞分为5组:空白对照组、模型组、TMP低剂量组、TMP中剂量组、TMP高剂量组。其中空白对照组用正常的细胞培养液培养，模型组用100 μmol/L的H2O2培养24 h，TMP低、中、高剂量组分别加入25、50、100 μmol/L的TMP预处理48 h后，再加入100 μmol/L H2O2作用24 h。
1.4 CCK-8检测细胞活性取对数生长期星形胶质细胞以5×103/mL接种于96孔培养板，每孔100 μL。按照1.3分组方法处理细胞后，培养基中加入10 μL CCK-8原液，继续在培养箱孵育3.5 h，酶标仪在450 nm处测定光密度值[D(450)]，并计算细胞存活率。
1.5 GFAP染色观察细胞形态
取适量细胞接种于放有爬片的6孔板中，按照1.3分组方法处理细胞后，去除培养基，PBS洗2次；4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗5 min×3次；免疫染色封闭液37 ℃封闭1 h，甩干。加入兔抗小鼠GFAP一抗(1 :500)4 ℃湿盒，避光孵育，过夜。次日室温复温30 min，PBS洗5 min×3次；加入Dylight488标记山羊抗小鼠二抗(1 :500), 37 ℃避光孵育1 h，PBS洗5 min×3次；DAPI染核10 min，PBS洗5 min×3次；抗荧光淬灭剂封片，激光共聚焦观察。
1.6 流式细胞术检测细胞凋亡率取适量细胞接种于6孔板中，按照1.3分组方法处理细胞后，用0.25%的胰酶消化细胞，以1 000 r/min离心5 min收集细胞，PBS清洗细胞2次；加入100 μL Binding Buffer、2 μL Annexin V-FITC在加入2 μL PI轻柔混匀，温室避光孵育5 min，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。
1.7 ELISA检测LDH、SOD取适量细胞接种于6孔板中，按照1.3分组方法处理细胞后，收集细胞上清液，按照试剂盒说明书操作步骤，分别检测LDH的活性和SOD的含量。
1.8 Real-time PCR检测细胞PI3K、AKT、Caspase-3、Bax和Bcl-2 mRNA的表达取适量细胞接种于6孔板中，按照1.3分组方法处理细胞后，PBS洗2次，每孔加入1 mL的RNAiso Plus，按照试剂说明提取总RNA, 检测其浓度和纯度。采用逆转录试剂盒，根据说明42 ℃，2 min去除基因组DNA后，37 ℃，15 min；85 ℃，5 s逆转录为cDNA。然后进行PCR扩增反映，以β-actin为内参，采用2-△△ct法计算目的基因mRNA的相对表达量。引物序列由北京擎科新业生物技术有限公司合成。PI3K(140 bp)：上游5′-CTCATTAGCGTGATTGTGCAT-3′; 下游5′-GCAATTCCCCATGAACTCACC-3′。AKT(133 bp)：上游5′-CTTCTATGGTGCGGAGATTGT-3′; 下游5′-CAGCCCGAAGTCCGTTATC-3′。Caspase-3(145 bp):上游5′-GTGCAGCTACCTCAACTTCG-3′; 下游5′-CATAGTATCGCCAAATCTTGCT-3′。Bax(99 bp)：上游5′-TGGTTGCCCTCTTCTACTTTGC-3′; 下游5′-AGTCCAGTGTCCAGCCCAT-3′。Bcl-2(172 bp):上游5′-GACAGAAGATCATGCCGTCCT-3′; 下游5′-ATCCGCTACAAGTTACACGTT-3′。β-actin(87 bp):上游5′-GACTCCTATGTGGGTGACGA-3′; 下游5′-CCAGTTGGTAACAATGCCAT-3′。
1.9 Western blot检测细胞PI3K、AKT、p-AKT、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达取适量细胞接种于6孔板中，按照1.3分组方法处理细胞后，PBS洗2次，将细胞置于冰上加入RIPA细胞裂解液裂解30 min，细胞刮收集细胞裂解液，4 ℃，12 000 r/min，离心20 min取上清，采用BCA法测定蛋白浓度；取各组蛋白样品与上样缓冲液煮沸变性后，上样，每孔20 μg；140 V恒压电泳，根据各个蛋白分子量切胶；300 mA恒流，1.5 h，转移到活化的PVDF膜上，转膜结束后5%脱脂牛奶室温封闭2 h，TBAT洗3次，每次10 min。加入PI3K一抗(1 :1 000)、AKT一抗(1 :10 000)、p-AKT一抗(1 :10 000)、Caspase-3一抗(1 :500)、Bax一抗(1 :500)、Bcl-2一抗(1 :1 000)、β-actin一抗(1 :5 000)，4 ℃孵育过夜；TBAT洗3次，每次10 min；根据一抗的种属不同，分别加入HRP标记山羊抗兔二抗(1 :5 000)、HRP标记驴抗山羊二抗(1 :5 000)、HRP标记山羊抗小鼠(1 :5 000)、HRP标记山羊抗大鼠(1 :5 000)。温室孵育2 h，TBST洗3次，每次10 min；ECL化学发光剂反应成像。使用Image J分析各个条带的灰度值，以β-actin为内参，计算目的蛋白与内参的灰度比值，p-AKT与AKT的灰度比值。
1.10 统计学分析采用SPSS 26.0统计软件，计量资料以x±s表示，多组间采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验，检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 TMP预处理对各组星形胶质细胞存活率的影响与空白对照组比较，H2O2干预后星形胶质细胞存活率明显下降(P < 0.05)；与模型组比较，TMP低剂量组、中剂量组、高剂量组细胞存活率明显增高，其中中剂量组(50 μmol/L)最明显(P < 0.05，表 1)。
| 组别 | 细胞存活率(%) |
| 空白对照组 | 100.00 |
| 模型组 | 49.43±2.98a |
| TMP低剂量组 | 65.69±4.93b |
| TMP中剂量组 | 84.38±4.23b |
| TMP高剂量组 | 73.93±3.89b |
| a：P < 0.05，与空白对照组比较; b：P < 0.05，与模型组比较 | |
2.2 TMP预处理对各组星形胶质细胞形态的影响
荧光显微镜下观察，空白对照组细胞生长状态良好，细胞分布均匀，轮廓清晰，核呈圆形或椭圆形，胞体较大呈扁平状胞体又伸出许多突起。模型组细胞形态发生明显变化，胞体空洞失去了完整性的结构，突触缩回，细胞核呈萎缩状。经TMP预处理后，细胞数量增加，胞体和突触逐渐恢复，尤其是在TMP中剂量组(50 μmol/L)接近空白对照组的细胞生长状态, 见图 1。
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| A：空白对照组；B：模型组；C：TMP低剂量组; D：TMP中剂量组; E：TMP高剂量组 图 1 荧光显微镜下各组星形胶质细胞形态观察(×100) |
2.3 TMP预处理对各组星形胶质细胞凋亡的影响
与空白对照组相比，模型组细胞凋亡明显升高(P < 0.05)。TMP低、中、高剂量组细胞凋亡较模型组显著降低，其中中剂量组最明显，但仍然低于空白对照组(P < 0.05, 图 2)。
|
| A~E:流式细胞仪检测结果；F:各组细胞凋亡率(n=3) 1：空白对照组; 2：模型组; 3：TMP低剂量组; 4：TMP中剂量组; 5：TMP高剂量组；a：P < 0.05，与空白对照组比较; b：P < 0.05，与模型组比较 图 2 流式细胞仪检测各组星形胶质细胞凋亡率 |
2.4 TMP预处理对各组星形胶质细胞LDH、SOD活性的影响
与空白对照组比较，模型组细胞上清液中LDH活性显著升高(P < 0.05)；与模型组比较，TMP低、中、高剂量组细胞上清液中LDH活性有不同程度的降低(P < 0.05)。与空白对照组比较，模型组中SOD的活性显著降低(P < 0.05)；与模型组比较，TMP低、中、高剂量组能不同程度地升高SOD的活性(P < 0.05，表 2)。
| 组别 | LDH/U·L-1 | SOD/U·L-1 |
| 空白对照组 | 61.71±8.94 | 32.01±0.51 |
| 模型组 | 151.21±27.84a | 15.89±1.32a |
| TMP低剂量组 | 104.37±20.57b | 19.04±1.13b |
| TMP中剂量组 | 82.59±9.55b | 28.42±0.21b |
| TMP高剂量组 | 97.19±3.32b | 23.01±0.37b |
| a: P < 0.05, 与空白对照组比较；b: P < 0.05, 与模型组比较 | ||
2.5 TMP预处理对各组星形胶质细胞PI3K、AKT、Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA表达的影响
与空白对照组比较，模型组PI3K、AKT和Bcl-2 mRNA表达下调(P < 0.05)；与模型组比较，TMP低、中、高剂量组PI3K、AKT和Bcl-2 mRNA表达上调(P < 0.05)。与空白对照组比较，模型组Bax、Caspase-3 mRNA表达上调(P < 0.05)；与模型组比较，TMP低、中、高剂量组Bax、Caspase-3 mRNA表达下调(P < 0.05, 图 3)。
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| a: P < 0.05, 与空白对照组比较；b: P < 0.05, 与模型组比较 图 3 Real-time PCR检测各组星形胶质细胞PI3K、AKT、Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA表达 |
2.6 TMP预处理对各组星形胶质细胞PI3K、AKT、p-AKT、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达的影响
与空白对照组比较，模型组PI3K、p-AKT和Bcl-2蛋白表达明显降低(P < 0.05)；与模型组比较，TMP低、中、高剂量组可上调PI3K、p-AKT和Bcl-2的蛋白表达，其中中剂量组最为明显(P < 0.05)。与空白对照组比较，模型组Bax、Caspase-3蛋白表达明显升高(P < 0.05)；与模型组比较，TMP低、中、高剂量组Bax、Caspase-3蛋白表达明显降低(P < 0.05，图 4)。
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| A：Western blot检测各组相关蛋白表达 1：空白对照组; 2：模型组; 3：TMP低剂量组; 4：TMP中剂量组; 5：TMP高剂量组；B：各组蛋白定量分析(n=3)；a: P < 0.05, 与空白对照组比较；b: P < 0.05, 与模型组比较 图 4 Western blot检测各组星形胶质细胞PI3K、AKT、p-AKT、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达 |
3 讨论
氧化应激损伤是指体内活性氧的产生与抗氧化体系的清除能力严重失调的一种病理状态，通常对需氧量大、抗氧化水平偏低的中枢神经系统具有高危性[10-11]。有研究表明，在中枢神经系统生理与病理变化中占据重要份额的星形胶质细胞，同样也对氧化应激损伤相当敏感[12]。TMP作为抗氧化保护剂在各领域研究中日益广泛，相关研究表明，TMP对氧化应激所致的大鼠视网膜神经节细胞[13]、大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株[14-15]损伤具有保护作用，因此为TMP对星形胶质细胞的潜在保护作用提供了理论依据。
过氧化氢是一种活性氧分子，作为一种可以通过增加细胞内的活性氧含量发挥对细胞氧化损伤的强氧化剂，参与许多神经系统疾病的发病机制，常常用来模拟细胞体外氧化应激损伤模型[16]。本研究参考既往研究中神经样细胞的造模方案[17-18]并结合前期预实验，最终选择100 μmol/L的H2O2培养24 h，提示造模成功，细胞形态明显改变，存活率约50%。而经适宜浓度TMP预处理后，细胞形态明显改善且存活率升高，反映细胞氧化损伤程度的LDH漏出率降低，细胞抗氧化酶类物质SOD含量升高，结合流式细胞术也证明细胞凋亡显著减少。
细胞凋亡是一个多环节、多因素决定的复杂过程，可能通过激活或抑制多条信号通路，与调控凋亡蛋白家族的表达有关[19]。Bcl-2蛋白家族中的重要成员有Bcl-2和Bax蛋白等，分别为抗凋亡和促凋亡蛋白。细胞接受凋亡信号时，Bax蛋白表达增高，Bcl-2却降低，造成线粒体跨膜电位下降，可进一步激活Caspase家族[20]。而Caspase-3是Caspase级联反应的凋亡执行因子，可直接介导细胞的凋亡[21]。本研究通过Real- time PCR与Western blot检测探讨了TMP保护作用与调控凋亡家族蛋白的联系，发现适宜浓度TMP预处理后，细胞中Bcl-2的mRNA与蛋白表达显著上升，Caspaase-3、Bax的mRNA与蛋白表达显著降低。本研究初步探讨了PI3K/AKT信号通路中的关键蛋白表达与TMP保护作用的联系，该信号通路可能通过激活通路中的配体蛋白PI3K，促进AKT蛋白的磷酸化，而磷酸化的AKT蛋白在通路的中游位置，可以进一步影响下游凋亡家族蛋白的表达，从而影响细胞的凋亡，决定细胞的命运[22]。以往研究表明，TMP可能通过激活PI3K/Akt细胞存活途径机制参与脑缺血缺氧损伤后的神经保护效应[8]。与以往的结果相似，本研究结果显示，H2O2诱导的星形胶质细胞PI3K、p-AKT蛋白表达水平显著降低，而经过适宜TMP预处理后PI3K、p-AKT蛋白表达显著升高。
综上，本研究提示过氧化氢可产生氧化应激损伤并诱导星形胶质细胞凋亡，适宜浓度TMP可抑制因氧化损伤所致的星形胶质细胞凋亡，发挥保护作用，该作用可能通过调控凋亡家族蛋白中Bax、Bcl-2、Caspaase-3表达，与激活PI3K/AKT通路上的关键蛋白PI3K、p-AKT表达有关。然而上述结论仍需体内实验进一步论证。本研究有助于了解TMP在星形胶质细胞层面抗氧化应激损伤中的保护作用，为临床深入应用奠定了理论基础。
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