表1(Table 1)
AAV属原发性小血管炎，因部分疾病与抗中性粒细胞胞浆抗体(anti-neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA)密切相关，因而称之为ANCA相关性血管炎(ANCA-associated vasculitis，AAV)，ANCA是AAV的标志性自身抗体，它是抗中性粒细胞胞浆抗体的总称，ANCA通常按照其靶抗原的不同来分类，CHCC 2012分类标准依据ANCA的类型将AAV再细分为3类：MPO-ANCA相关性AAV、PR3-ANCA相关性AAV、ANCA阴性AAV[1]，酶免法、免疫印迹法、免疫荧光法是目前检测ANCA主要方法，但仍有少部分AAV患者无法检出ANCA，原因可能是存在目前常规方法无法检测到的ANCA，也可能是存在尚未发现的特异性ANCA。另外，AAV患者在接受激素或免疫抑制剂治疗后其ANCA浓度会降低甚至转阴，这对疾病的诊断会带来一些困难。IgG4相关疾病(IgG4-related disease，IgG4-RD)是近年来新发现的一组疾病，2010年才统一命名为IgG4-RD，临床上较多采用的诊断要素是：血清IgG4浓度大于1.35 g/L，病损组织中IgG4阳性细胞/IgG阳性细胞大于40%[2]。国内、外有个例报道称AAV患者血清中IgG4也有明显升高[3, 4]，病理检查显示局部组织也有IgG4+浆细胞浸润，本实验中我们将通过收集AAV患者血清，定量检测IgG4和及计算IgG4/IgG值，研究分析血清IgG4在AAV患者中的表达情况，探讨其在AAV中的诊断价值。
1 材料与方法 1.1 研究对象收集2016年7月至2018年6月于苏州大学附属第二医院接受治疗的AAV患者48例，其中男性19例，女性29例，年龄(28~88)岁，其中MPO-ANCA相关性AAV患者31例，PR3-ANCA相关性AAV患者14例，ANCA阴性AAV患者3例，所有AAV患者临床表现符合2012年Chapel Hill共识会议(Chapel Hill consensus conference，CHCC)的血管炎分类标准[5]。健康对照组为同期25名健康体检者，其中男性10例，女性15例，年龄(17~65)岁，患者均排除急慢性感染和风湿免疫性疾病，研究遵循的程序符合医学伦理委员会所制定的伦理学标准，并获得该委员会的批准，标本的采集均在获得受试者知情同意后完成。
1.2 实验方法 1.2.1 仪器与试剂 1.2.1.1 主要仪器离心机为安徽中科中佳科学仪器有限公司，TECAN Sunrise酶标仪为瑞士帝肯公司产品，SIEMENS全自动蛋白分析仪为德国西门子公司产品，Union免疫分析仪为深圳亚辉龙生物科技股份有限公司产品、37℃恒温孵育箱、移液器等。
1.2.1.2 试剂材料IgG4 ELISA检测试剂盒为艾莱萨生物科技(上海)有限公司产品，IgG检测试剂盒为西门子医疗系统有限公司产品，anti-MPO试剂盒和anti-PR3试剂盒为深圳亚辉龙生物科技股份有限公司产品。
1.2.2 方法和步骤IgG4的测定检测采用ELISA法，在预先包被抗IgG4抗体的微孔中，依次加入标准物、标本、HRP标记的二抗，经过温育后洗涤，用底物TMB显色，显色后用硫酸终止，颜色的深浅和样品中的IgG4浓度成正比，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，再根据标准品拟合回归曲线并计算出样本血清中IgG4浓度。血清IgG浓度测定采用免疫散射比浊法在SIEMENS全自动蛋白分析仪上自动完成。anti-MPO浓度和anti-PR3浓度在亚辉龙Union免疫分析仪上自动测定完成。
1.3 统计学分析数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以x±s表示，两组数据间比较用t检验，多组数据用单因素方差分析，两两间比较用LSD-t检验，两组间指标相关性分析用Pearson相关性分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 血清IgG、IgG4浓度及IgG4/IgG比值AAV患者组IgG4浓度为(1.17±0.58)g/L，明显高于健康对照组，差异有统计学意义(P < 0.01)，AAV患者组IgG4/IgG为(10.12±6.64)%，IgG4占IgG百分比明显高于健康对照组，差异有统计学意义(P < 0.01)，见表 1。
| 分组 | n | IgG/g·L-1 | IgG4/g·L-1 | IgG4/IgG(%) |
| AAV患者组 | 48 | 13.56±5.04 | 1.17±0.58a | 10.12±6.64a |
| 健康对照组 | 25 | 13.59±1.45 | 0.55±0.31 | 4.15±2.47 |
| t | -0.270 | 4.797 | 4.238 | |
| P | 0.979 | 0.000 | 0.000 | |
| a：P < 0.01, 与健康对照组比较 | ||||
2.2 MPO-ANCA相关性AAV患者与PR3-ANCA相关性AAV患者IgG、IgG4浓度及IgG4/IgG比值
48例AAV患者中MPO-ANCA相关性AAV为31例，IgG4浓度为(1.07±0.53)g/L，IgG4/IgG为(10.53±7.68)%、PR3-ANCA相关性AAV为14例，IgG4浓度为(1.38±0.65)g/L，IgG4/IgG为(9.21±3.43)%，分析表明IgG4及IgG4/IgG均高于健康对照组(P < 0.05)，但两组AAV亚型内没有明显差异(P>0.05)，因ANCA阴性AAV仅为3例，例数太少未纳入统计比较，见表 2。
| 病种 | n | IgG/g·L-1 | IgG4/g·L-1 | IgG4/IgG(%) |
| MPO-ANCA相关性AAV | 31 | 13.77±4.85 | 1.07±0.53a | 10.53±7.68a |
| PR3-ANCA相关性AAV | 14 | 13.10±5.61 | 1.38±0.65a | 9.21±3.43a |
| 健康对照组 | 25 | 13.59±1.45 | 0.55±0.31 | 4.15±2.47 |
| F | 2.649 | 13.119 | 9.047 | |
| P | 0.078 | 0.000 | 0.000 | |
| a：P < 0.01, 与健康对照组比较 | ||||
2.3 anti-MPO和anti-PR3浓度与IgG4浓度相关性分析
MPO-ANCA相关性AAV患者anti-MPO浓度与IgG4含量(r=0.155，P=0.405)和PR3-ANCA相关性AAV患者anti-PR3与IgG4含量(r=-0.292，P=0.311)均没有明显相关性(图 1)。
|
| A: anti-MPO, B: anti-PR3 图 1 anti-MPO和anti-PR3浓度与IgG4浓度相关性分析 |
3 讨论
本实验中AAV或其亚型患者的IgG4浓度及IgG4占总IgG的比例均明显高于健康对照组，ANCA阴性AAV因例数较少，未进行统计比较，但IgG4浓度也有明显升高。AAV是西方国家最常见的自身免疫性疾病之一，也是近10~20年来国内、外研究的热点，本病临床特点是发热、贫血、肺和肾功能损害、血沉增快等，根据组织病理学特点将AAV分为显微镜下多血管炎(MPA)、肉芽肿性多血管炎(GPA)、嗜酸性肉芽肿性多血管炎(EGPA)和单器官AAV[5]。ANCA是AAV重要的血清学诊断依据，研究表明，根据ANCA特异性而非临床诊断对AAV进行分类可以传达更有用的临床诊断信息[6]，GPA患者主要为anti-PR3阳性，而MPA患者主要为anti-MPO阳性，GPA在欧美多见[7]，而在我国则以anti-MPO阳性的MPA为主，与报道相同，本文收集的病例MPO-ANCA相关性AAV占总AAV近70%，这种差别被认为是由于ANCA亚型的地域差别造成的[8]。我们注意到，ANCA阴性AAV患者中尚无标志性自身抗体，需要进一步组织学和影像学检查，另外，患者在接受激素和免疫抑制剂治疗后ANCA浓度会降低甚至转阴，可能会导致漏诊、误诊，Sakairi T等报道一例ANCA阴性肾小血管炎合并IgG4阳性浆细胞间质浸润，此患者血清IgG4明显升高[9]，本实验结果表明在AAV中IgG4的也升高明显，但升高幅度不及IgG4-RD，且与ANCA的浓度和类型均无明显相关性，于峰等人的研究也表明IgG4浓度升高与AAV病情不同步[10]，血清IgG4在AAV患者中升高不易受ANCA影响，这一特征可以弥补ANCA不能检出时AAV的诊断，尤其在ANCA阴性AAV患者中更有诊断价值。
正常情况下健康人IgG4仅占总IgG的3%~6%，主要通过旁路途径激活补体，可以通过胎盘，且对于靶抗原亲和力较低，高表达的Th2型细胞因子包括IL-4，IL-5，IL-10和IL-13能同时伴高浓度的IgG4被检出[11-12]，IL-4是负责驱动Th2应答的主要细胞因子[13]，它最先被认为是诱导IgG4应答的主要细胞因子[14]。KUROKI等[15]发现，当有Th2细胞因子特别是IL-4存在时，特发性膜性肾病患者IgG4的表达显著升高，同时IL-6对IgG4的升高也有促进作用[16]。研究还表明由Th2细胞分泌IL-21在IgG4-RD患者淋巴结中生发中心的形成和IgG向IgG4亚型的类别转化中发挥关键作用[17]，另一项有报道称体外试验中刺激CD148+和CD148- B淋巴细胞，结果表明IgG4主要由CD148-B淋巴细胞产生[18]。AAV患者血清IgG4升高可能就在相关自身抗体、细胞因子和淋巴细胞相互作用下造成的，虽然不是一个特异性的抗体，但是在AAV中有明显升高，联合ANCA检查可以作为AAV的一个较好辅助诊断指标，IgG4在对疾病有无保护作用，还是只是炎症反应副产物需要进一步深入研究和积累更多临床资料。
IgG4是一个独特的免疫球蛋白亚型，本研究中AAV或其亚型患者血清IgG4浓度明显升高，且浓度升高与ANCA类型及浓度无明显相关性，因此，联合IgG4和ANCA检测有助于AAV的诊断，尤其是在ANCA阴性的AAV中更具有诊断价值。
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