动脉粥样硬化是一种与血脂代谢紊乱相关的慢性疾病，目前发病率逐年上升，严重影响人类的生存质量。泡沫细胞形成是动脉粥样硬化的主要标志及核心环节。以往观点认为，泡沫细胞的形成主要由低密度脂蛋白(LDL)诱导，经细胞膜上的清道夫受体如SR-A、CD36等介导入胞而形成[1]。但也有研究显示，基因敲除清道夫受体或应用受体抑制剂，并不能阻止高脂饮食诱导的主动脉根部粥样硬化病灶中的泡沫细胞形成[2]。由此，我们推测，除了清道夫受体介导的泡沫细胞形成外，非受体摄取的方式可能也是细胞内吞LDL并形成泡沫细胞的重要途径。
研究发现，大胞饮机制是巨噬细胞摄取脂质的一个重要途径，多种刺激因子如phorbol 12-myristate 13-acetate、细胞集落刺激因子均可诱导巨噬细胞通过大胞饮摄取天然低密度脂蛋白(nLDL)而形成泡沫细胞[3-4]。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)是晚期粥样斑块中的泡沫细胞的主要来源[5]，粥样斑块中的VSMC具备了多种巨噬细胞的特性，如活跃的增殖迁移能力，分泌炎症因子等，但是否也具有大胞饮的作用，目前尚不清楚。
动脉粥样硬化是一种慢性低度炎性血管性疾病，炎症反应可发生于动脉粥样硬化的各个阶段。既往研究显示炎症与VSMCs增殖、转移及泡沫细胞形成密切相关[5]。但炎症反应是否诱导VSMCs发生大胞饮并参与动脉粥样硬化的发生发展尚不清楚。脂多糖(LPS)为革兰阴性菌细胞壁的主要成分，能引起机体一系列炎性反应。本研究观察在LPS诱导的炎症状态下体外培养的VSMCs对nLDL的摄取，以及明确VSMCs是否可通过大胞饮途径摄取脂质，进而形成泡沫细胞。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物4~6周龄C57BL /6J雄性小鼠18只，15~20 g，SPF级，购自北京化阜康生物科技股份有限公司。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。
1.1.2 主要试剂胎牛血清(FBS)、DMEM细胞培养基、青链霉素溶液、胰酶购自美国HyClone公司，DiI标记的nLDL(DiI-nLDL)购自上海翊圣生物科技有限公司，人源nLDL、氧化低密度脂蛋白(oxLDL)购自广州奕源生物科技有限公司，脂多糖(LPS)、Lucifer Yellow(LY)、LY294002、油红O购自美国Sigma公司，α-SMA一抗购自英国Abcam公司，Alexa Fluor 647标记驴抗兔IgG(H+L)二抗购于美国life technology公司，其余试剂均为国产或进口分析纯。
1.2 方法 1.2.1 VSMCs原代培养采用组织块贴壁培养法培养小鼠原代VSMCs[6]，小鼠麻醉后迅速取胸主动脉，用含20% FBS和1%青-链霉素的DMEM培养基培养，10~15 d后进行传代培养。选取第2~6代生长良好的细胞用于实验。
1.2.2 原代VSMCs鉴定取第3代VSMCs，细胞以0.5×106个/孔接种于预置盖玻片的12孔板，细胞贴壁后，4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗涤，0.3%Triton X-100破膜5 min，PBS洗涤，α-SMA一抗于4 ℃孵育过夜，PBS洗涤，予以Alexa Fluor 647标记驴抗兔IgG(H + L)二抗室温避光孵育1 h，DAPI避光染核5 min，PBS洗涤，抗荧光淬灭封片剂封片，激光共聚焦显微镜下观察及拍照。
1.2.3 实验分组及平滑肌源性泡沫细胞模型的构建实验分为空白组、LPS组、oxLDL组、nLDL组及LPS+nLDL组。oxLDL(50 μg/mL)、nLDL(50、200、800 μg/mL)和LPS(200 ng/mL)刺激培养VSMCs 24 h构建泡沫细胞模型。
1.2.4 油红O染色观察VSMCs内脂滴聚集细胞爬片后，nLDL和(或)LPS干预24 h，4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗涤，油红O染液于37 ℃避光染色30 min，苏木精常温染核3 min，自来水洗涤，甘油明胶封片，正置显微镜下观察及拍照。
1.2.5 流式细胞术检测VSMCs的大胞饮情况细胞以0.5×106个/孔接种于12孔板，贴壁后，LPS(200 ng/mL)刺激VSMCs 6 h，同时加入DiI-LDL(200 μg/mL)或LY(50 μg/mL)。收集细胞移入EP管，PBS洗涤重悬，使用成像流式细胞仪检测VSMCs对LY(激发波长：428 nm，发射波长：540 nm)及对DiI-nLDL(激发波长：488 nm，发射波长：565 nm)的摄取。
1.2.6 抑制剂LY294002对VSMCs大胞饮的作用细胞以0.5×106/孔接种于12孔板，胞饮抑制剂LY294002(33 μmol/L)加入nLDL(200 μg/mL)及LPS(200 ng/mL)中共同刺激培养VSMCs 6、24 h。
1.3 统计学分析采用SPSS17.0统计软件进行分析，每项实验至少重复3次，计量资料以x±s表示，两组间的比较采用t检验。
2 结果 2.1 原代VSMCs培养及鉴定组织块贴壁培养法培养原代VSMCs，正置相差显微镜下观察到原代VSMCs从组织块边缘游出，细胞呈带状三角形、菱形、梭形等多种形态(图 1)。经细胞免疫荧光染色提示，肌动蛋白α-SMA在VSMCs内丰富表达(红色荧光，图 2)，证实培养的原代细胞为VSMCs，符合实验要求。
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| 图 1 正置相差显微镜下观察培养第10天的原代VSMCs (×100) |
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| A：DAPI; B：α-SMA; C：融合图 图 2 细胞免疫荧光染色鉴定原代VSMCs |
2.2 LPS促进VSMCs对nLDL的摄取，并激活细胞内大胞饮途径
单独予以50 μg/mL oxLDL刺激培养VSMCs 24 h后，经油红染O色显示，VSMCs内可见明显脂滴聚集(图 3); 而单独予以50 μg/mL nLDL刺激培养VSMCs 24 h，VSMCs内未见明显脂滴聚集，同时予以200 ng/mL LPS刺激培养VSMCs 24 h后，VSMCs内可见脂滴聚集，且随着nLDL浓度增加，VSMCs内脂滴聚集明显增多(图 4)。
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| A：空白组; B：oxLDL组 图 3 油红O染色检测oxLDL刺激下VSMCs内脂滴聚集 |
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| 图 4 油红O染色检测nLDL刺激下VSMCs内脂滴聚集 |
200 ng/mL LPS与200 μg/mL DiI-nLDL共同刺激培养VSMCs 6 h后，经流式细胞术检测证实，VSMCs对DiI-nLDL的摄取增加76%(P < 0.01)，提示LPS刺激可促进培养的VSMCs对nLDL的摄取。
为进一步明确LPS刺激下VSMCs对nLDL的摄取方式，我们应用LY作为大胞饮的示踪剂。结果显示，200 ng/mL LPS刺激可使得VSMCs对LY的摄取增加75%(P < 0.01)。提示LPS可诱导VSMCs大胞饮途径的激活(图 5-8)。
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| 图 5 成像流式观察VSMCs内DiI-nLDL摄取 |
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| 图 6 成像流式观察VSMCs内大胞饮发生 |
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| A：空白组; B：DiI-nLDL组; C：DiI-nLDL+LPS组 图 7 流式细胞术检测VSMCs内DiI-nLDL摄取 |
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| A：空白组; B：LY组; C：LY+LPS组 图 8 流式细胞术检测VSMCs内大胞饮发生 |
2.3 胞饮抑制剂可显著减少nLDL诱导的VSMCs内脂滴聚集
应用流式细胞术检测发现，大胞饮抑制剂LY294002(33 μmol/L)使LPS诱导的VSMCs对DiI-nL DL的摄取下降约29%(P < 0.01，图 9)。200 ng/mL LPS与200 μg/mL nLDL共同刺激培养VSMCs 24 h，同时加入33 μmol/L LY294002干预后，经油红O染色证实，LY294002抑制大胞饮后，VSMCs内脂滴聚集明显减少(图 10)。
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| 图 9 成像流式观察抑制大胞饮后VSMCs内DiI-nLDL摄取 |
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| A：空白组; B：LPS + nLDL组; C：LY294002 + LPS + nLDL组 图 10 油红O染色检测抑制大胞饮后VSMCs内脂滴聚集 |
3 讨论
泡沫细胞形成是动脉粥样硬化的主要病理改变，此外，还与粥样斑块的稳定性密切相关[1]，因此抑制泡沫细胞形成对动脉粥样硬化疾病的预防及治疗有十分重要的意义。泡沫细胞主要来源于巨噬细胞及平滑肌细胞，各种致动脉粥样硬化因素可促进细胞对脂质的摄取，使得细胞内胆固醇酯化和胆固醇流出失衡，导致胞内脂质代谢紊乱，脂质负荷增多，从而促进细胞的泡沫化[1]。
传统的观点认为，修饰型的低密度脂蛋白(如氧化型或乙酰化的低密度脂蛋白)是诱导泡沫细胞形成的重要脂质成分，主要在清道夫受体的介导下被摄取入胞; 而nLDL的摄取由低密度脂蛋白受体介导，由于其存在着剂量饱和现象，在泡沫细胞的形成中不起主要作用[7]。同样，我们的研究结果也证实，低浓度oxLDL(50 μg/mL)可诱导VSMCs内大量脂滴聚集，相比之下，大剂量nLDL(800 μg/mL)也仅诱导细胞内少许脂滴聚集。但另有研究报道，粥样斑块中nLDL的浓度非常高，可达2 mg/mL，明显高于受体介导nLDL入胞的饱和浓度[8]。那么，如此高浓度的nLDL是经过何种途径进入粥样斑块内的细胞中的，值得进一步探讨。
研究证实，动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病[9]。我们之前的研究也证实，炎症反应与平滑肌源性泡沫细胞的形成密切相关[10-11]。LPS是经典的炎症诱导因子，可触发细胞的炎性信号通路并诱导炎症反应[9]。在本研究中，我们使用LPS和nLDL共同刺激培养VSMCs后，细胞内脂滴聚集显著增加，且呈现浓度依赖的方式。说明，LPS启动VSMCs内炎症反应后，进一步促进nLDL诱导的细胞内脂滴聚集。
胞饮是物质进入细胞的方式之一，包括微胞饮及大胞饮两种方式。大胞饮为一种依赖于肌动蛋白的非受体内吞途径，可发生在多种细胞内，当细胞激活后，细胞膜发生皱裂，形成直径为0.2~5 mm的胞饮体，进而参与各种病理生理变化[8]。研究提示，大胞饮在细胞免疫反应、肿瘤细胞营养摄取以及神经变性疾病中均发挥作用[12-13]。此外，大胞饮还与动脉粥样硬化发生发展过程中泡沫细胞的形成有关。既往研究提示，细胞集落刺激因子刺激LDL受体基因敲除的小鼠巨噬细胞后，细胞通过大胞饮途径摄取nLDL，并呈浓度依赖性增加，引起细胞内脂滴聚集及泡沫细胞形成[14]。VSMCs是晚期动脉粥样斑块中泡沫细胞的主要来源，具有许多巨噬细胞样特性，如：分泌多种基质，增殖迁移能力增强等[15]。另有研究提示，炎症与大胞饮的发生也相关，炎症反应可刺激巨噬细胞通过大胞饮途径快速摄取结核分枝杆菌至溶酶体，进而有效清除病原菌感染[16]。故我们推测，炎症反应促进VSMCs通过大胞饮途径摄取nLDL，诱导平滑肌源性泡沫细胞形成。
为明确促炎症因子LPS诱导下VSMCs对nLDL的摄取方式，本研究应用荧光染料LY作为大胞饮示踪剂，采用流式细胞术半定量方法检测细胞的大胞饮情况。结果提示，LPS刺激下，VSMCs对大胞饮示踪剂LY的摄取明显增加，证实LPS刺激可诱导VSMCs大胞饮途径激活。为进一步明确LPS刺激下，VSMCs是否通过大胞饮途径摄取nLDL，我们应用LY294002抑制VSMCs内大胞饮后，经油红O染色及流式细胞术测结果提示，VSMCs摄取DiI-nLDL减少，细胞内脂滴聚集亦明显减少。
LY294002为常用大胞饮抑制剂，既往研究显示其浓度在100 μmol/L时抑制效应最大[17]，但在本实验中，该浓度对细胞毒性较大，为此实验中其浓度予以减量。我们给予小剂量大胞饮抑制剂后可部分抑制VSMCs对nLDL的摄取，说明nLDL除经受体途径外，还可通过大胞饮途径进入VSMCs，进而证实了在LPS刺激下VSMCs可通过大胞饮途径摄取nLDL引起胞内脂滴聚集，促进VSMCs发生泡沫样变。
本研究结果是对平滑肌源性泡沫细胞形成机制的补充，为今后动脉粥样硬化预防和治疗提供新的思路。在接下来的研究工作中，将进一步研究LPS刺激下，VSMCs发生大胞饮的分子病理机制。
| [1] | YU X H, FU Y C, ZHANG D W, et al. Foam cells in atherosclerosis[J]. Clin Chim Acta, 2013, 424: 245–252. DOI:10.1016/j.cca.2013.06.006 |
| [2] | MOORE K J, KUNJATHOOR V V, KOEHN S L, et al. Loss of receptor-mediated lipid uptake via scavenger receptor A or CD36 pathways does not ameliorate atherosclerosis in hyperlipidemic mice[J]. J Clin Invest, 2005, 115(8): 2192–2201. DOI:10.1172/JCI24061 |
| [3] | KRUTH H S, JONES N L, HUANG W, et al. Macropinocytosis is the endocytic pathway that mediates macrophage foam cell formation with native low density lipoprotein[J]. J Biol Chem, 2005, 280(3): 2352–2360. DOI:10.1074/jbc.M407167200 |
| [4] | KRUTH H S. Fluid-phase pinocytosis of LDL by macrophages: a novel target to reduce macrophage cholesterol accumulation in atherosclerotic lesions[J]. Curr Pharm Des, 2013, 19(33): 5865–5872. DOI:10.2174/1381612811319330005 |
| [5] | JOHNSON J L. Emerging regulators of vascular smooth muscle cell function in the development and progression of atherosclerosis[J]. Cardiovasc Res, 2014, 103(4): 452–460. DOI:10.1093/cvr/cvu171 |
| [6] |
曹小洁, 张莉莉, 郭露, 等. oxLDL通过PPARγ-ABCG1通路促进血管平滑肌细胞泡沫化[J].
第三军医大学学报, 2015, 37(4): 325–329.
X J, ZHANG L L, GUO L, et al. OxLDL promotes vascular smooth muscle cells to form foam cells through PPARγ-ABCG1 signal pathway[J]. J Third Mil Med Univ, 2015, 37(4): 325–329. DOI:10.16016/j.1000-540.201409084 |
| [7] | CHISTIAKOV D A, MELNICHENKO A A, OREKHOV A N, et al. How do macrophages sense modified low-density lipoproteins?[J]. Int J Cardiol, 2017, 230: 232–240. DOI:10.1016/j.ijcard.2016.12.164 |
| [8] | KRUTH H S. Receptor-independent fluid-phase pinocytosis mechanisms for induction of foam cell formation with native low-density lipoprotein particles[J]. Curr Opin Lipidol, 2011, 22(5): 386–393. DOI:10.1097/MOL.0b013e32834adadb |
| [9] | JIANG D, YANG Y, LI D. Lipopolysaccharide induced vascular smooth muscle cells proliferation: A new potential therapeutic target for proliferative vascular diseases[J]. Cell Prolif, 2017, 50(2): e12332. DOI:10.1111/cpr.12332 |
| [10] | YIN Y W, LIAO S Q, ZHANG M J, et al. TLR4-mediated inflammation promotes foam cell formation of vascular smooth muscle cell by upregulating ACAT1 expression[J]. Cell Death Dis, 2014, 5: e1574. DOI:10.1038/cddis.2014.535 |
| [11] | GUO L, CHEN C H, ZHANG L L, et al. IRAK1 mediates TLR4-induced ABCA1 downregulation and lipid accumulation in VSMCs[J]. Cell Death Dis, 2015, 6: e1949. DOI:10.1038/cddis.2015.212 |
| [12] | BUCKLEY C M, KING J S. Drinking problems: mechanisms of macropinosome formation and maturation[J]. FEBS J, 2017. DOI:10.1111/febs.14115 |
| [13] | ZEINEDDINE R, YERBURY J J. The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases[J]. Front Physiol, 2015, 6: 277. DOI:10.3389/fphys.2015.00277 |
| [14] | ANZINGER J J, CHANG J, XU Q, et al. Murine bone marrow-derived macrophages differentiated with GM-CSF become foam cells by PI3Kgamma-dependent fluid-phase pinocytosis of native LDL[J]. J Lipid Res, 2012, 53(1): 34–42. DOI:10.1194/jlr.M018887 |
| [15] | DEMASI M, LAURINDO F R. Physiological and pathological role of the ubiquitin-proteasome system in the vascular smooth muscle cell[J]. Cardiovasc Res, 2012, 95(2): 183–193. DOI:10.1093/cvr/cvs128 |
| [16] | BOSEDASGUPTA S, PIETERS J. Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens[J]. PLoS Pathog, 2014, 10(1): e1003879. DOI:10.1371/journal.ppat.1003879 |
| [17] | MICHAEL D R, DAVIES T S, LAUBERTOVA L, et al. The phosphoinositide 3-kinase signaling pathway is involved in the control of modified low-density lipoprotein uptake by human macrophages[J]. Lipids, 2015, 50(3): 253–260. DOI:10.1007/s11745-015-3993-0 |
