2. 400038 重庆，第三军医大学西南医院：老年科
2. Department of Geriatrics, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China
放射性肺损伤是在对胸部恶性肿瘤(肺癌、乳腺癌、食管癌等)进行放射治疗时引起的肺组织损伤。根据放射性肺损伤发生在放疗后的时间不同分为：放疗后90 d内出现的急性放射性损伤(acute radiation-induced pneumonitis，ARP)和放疗90 d后出现的放射性肺纤维化(radiation-induced pulmonary fibrosis，RPF)[1]。放射性肺损伤早期应用糖皮质激素有效[2]，但一旦出现后期的RPF，则缺乏特效治疗，因此寻找一个确切有效的治疗手段势在必行。
间充质干细胞(esenchymal stem cells，MSC)是一种具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，广泛用于组织修复与再生研究。我们采用的UC-MSC较骨髓和脂肪来源的MSC有免疫源性更低、增殖克隆能力更强[3]、分泌更多抗炎因子[4-5]、定向趋化[6]、直接分化为气道上皮细胞[7]等优势。Chang等[8]证实经气管内给药治疗具有抗纤维化效果，而且是安全的；Antunes等[9]也进一步证实气管内给药治疗优于静脉给药治疗。基于以上临床前研究，我们观察了UC-MSC气管内给药治疗RPF前后临床症状和相关指标的变化，初步判定UC-MSC治疗RPF的安全性和有效性。
1 对象与方法 1.1 研究对象2014年1月至2016年6月在西南医院呼吸科、西南医院和新桥医院放疗中心筛选放疗病人1 829例，根据纳入标准共入组8例RPF患者，患者具体筛选流程图见图 1，其中2例乳腺癌，6例肺癌，年龄44~70(61.5 ±5.13) 岁，入组患者基本信息见表 1。本研究经医院伦理委员会评审通过[伦理批号：2014年科研第(48) 号]，并在ClinicalTrials.gov上注册(NCT02277145)。
|
| 图 1 UC-MSC治疗RPF患者筛选流程 |
| 编号 | 性别 | 年龄(岁) | 肿瘤类型 | 放疗日期(年-月) | UC-MSC治疗日期(年-月-日) | UC-MSC植入部位 |
| 1 | 女 | 44 | 乳腺癌 | 2014-04 | 2015-04-21 | 右中叶外侧段 |
| 2 | 女 | 60 | 乳腺癌 | 2014-09 | 2015-04-23 | 左上叶前段 |
| 3 | 男 | 70 | 小细胞肺癌 | 2014-09 | 2015-05-12 | 右下叶后外基底段 |
| 4 | 男 | 64 | 肺黏液腺癌 | 2011-05 | 2015-06-08 | 左侧背段 |
| 5 | 男 | 64 | 肺腺癌 | 2015-06 | 2015-09-30 | 左舌叶下段和左下叶 |
| 6 | 男 | 65 | 肺鳞癌 | 2015-08 | 2015-12-15 | 左上肺 |
| 7 | 男 | 65 | 肺鳞癌 | 2014-12 | 2016-02-23 | 左下叶外侧 |
| 8 | 女 | 60 | 肺腺癌 | 2016-01 | 2016-04-26 | 左舌叶, 左下叶背段 |
1.1.1 纳入标准
① 年龄18~70岁；② 有明确的恶性肿瘤病史；③ 至少3个月前有明确的胸部放射治疗病史；④ 确诊RPF；⑤ 签署知情同意书。
1.1.2 排除标准① 合并其他系统严重疾病者；② 不愿参与本项研究者；③ 临床病历资料相关信息不全。
1.2 方法 1.2.1 实验室检查治疗前采血送本院检验科查血常规、C反应蛋白、肝肾功检查。
1.2.2 测定肺功能指标使用德国耶格肺功能测定仪测定患者第1秒用力呼出量(forced expiratory volume in one second，FEV1)、一氧化碳的弥散功能(carbon monoxide diffusion function，DLO)、每分钟最大通气量(minute ventilation volume，MVV)、残气量(residual volume，RV)等指标。
1.2.3 测定6MWD按照6MWD测试标准[10]操作规程进行。
1.2.4 测定SGRQ按圣乔治呼吸问卷评分量表[11]进行。
1.2.5 UC-MSC治疗患者平卧位，在局麻下经鼻纤支镜用温热生理盐水局部缓慢灌洗病灶附近叶或段支气管，共计500~1 000 mL。回收支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)50 mL，将回收液体用双层无菌纱布过滤除去黏液，立即送实验室，-80 ℃超低温冰箱保存，避免反复冻融。灌洗结束后，经纤支镜以1×106 /kg注入UC-MSC(北京中科院动物和遗传发育研究所提供，中国食品药品检定研究所检测报告编号：SH201401380) 悬液至病灶部位。细胞在出库前需行细胞活性和细菌病原学检查满足出库标准后，使用当天由专人从北京中科院送至西南医院纤支镜室。
1.2.6 ELISA采10 mL血样在室温下静置30 min后，4 000 r/min离心10 min分离血清，将血清置于Eppendorf管中，-80 ℃超低温冰箱保存，避免反复冻融。采用酶联免疫吸附法测定血清和BALF中上述细胞因子水平。酶标仪为德国拜耳仪器公司生产，各检测试剂盒均购自武汉优尔生科技有限公司，具体检测步骤严格按照试剂盒说明书进行。检测IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α、TGF-β1、基质金属蛋白酶-1(mysterious motorist progr-am-1，MMP-1)、基质金属蛋白酶-7(mysterious motorist program-7，MMP-7) 等指标。
1.2.7 CT肺密度直方图分析每例患者在4个不同时间点(放射治疗前、UC-MSC治疗前、治疗后第3个月，治疗后第6个月)截取RPF中心病灶肺部CT图片及中心病灶上下每间隔0.2 cm再各取三张图片，每个时间点共7张图片，每例患者共28张图片。将患者的肺部CT图片数据传至Image-Pro Plus软件上，用红色线条圈出测量范围，在选好的范围中进一步计算白色范围总面积(图 2)。计算每例患者每个时间点7张图片的白色范围面积值的均数和标准差，并做柱状图分析结果[12-13]。
|
| A：放射治疗前；B：UC-MSC治疗前；C：UC-MSC治疗后第3个月；D：UC-MSC治疗后第6个月 图 2 放射性肺纤维化肺部病灶CT诊断结果 (5号患者，男性，64岁，左肺腺癌放射治疗3个月后出现放射性肺纤维化。经UC-MSC治疗前后病灶变化情况，红色区域示病灶区) |
1.3 评价指标
UC-MSC治疗前后的血常规、肝肾功指标的变化评估安全性，UC-MSC治疗前后临床症状、CT肺密度、肺功能指标、SGRQ、6MWD、血清和BALF炎症因子水平的变化评估有效性。
1.4 统计学分析统计分析采用R软件分析，计量资料以x±s表示，采用重复测量方差分析。
2 结果 2.1 安全性观察UC-MSC治疗前和治疗后第3天、第3个月和第6个月主要血液指标变化不明显，各均值在正常范围内波动(表 2)。1例患者在UC-MSC治疗前肝功轻微异常，UC-MSC治疗后未见肝损害加重。
| 观察时间 | 白细胞(×109/L) | 红细胞(×1012/L) | 血红蛋白(g/L) | 血小板(g/L) | C反应蛋白(mg/L) | 谷丙转氨酶(U/L) | 谷草转氨酶(U/L) | 尿素氮(μmol/L) | 肌酐(μmol/L) | 尿酸(μmol/L) |
| 治疗前 | 5.16±0.65 | 4.02±0.46 | 129.25±14.09 | 159.62±63.59 | 3.57±2.58 | 26.32±12.08 | 27.91±7.08 | 5.43±1.49 | 66.12±9.09 | 358.00±47.06 |
| 治疗后第3天 | 5.45±1.04 | 3.79±0.34 | 120.12±14.34 | 165.00±41.46 | 12.89±3.06 | 21.25±6.80 | 26.01±5.31 | 6.33±3.04 | 65.46±8.65 | 334.87±66.33 |
| 治疗后第3个月 | 6.84±3.38 | 4.16±0.59 | 132.66±17.90 | 175.16±27.25 | 3.78±2.12 | 34.16±35.16 | 32.80±19.93 | 4.71±1.21 | 64.83±9.66 | 346.83±52.04 |
| 治疗后第6个月 | 6.31±2.16 | 3.90±0.65 | 123.12±24.42 | 209.00±90.90 | 13.66±19.74 | 23.78±8.04 | 26.77±7.13 | 5.01±1.66 | 62.52±14.55 | 339.48±79.13 |
2.2 有效性观察 2.2.1 临床症状
8例患者均能够耐受UC-MSC治疗，随访观察期间无严重不良反应。1例患者在UC-MSC治疗后第1天出现咽喉部不适，经口服含片处理后很快缓解；1例多处骨转移、左前胸壁皮肤转移的肺癌患者出现胸背痛症状加重和左上肢活动受限；6例患者自觉气促、咳嗽等症状有所好转。
2.2.2 CT肺密度变化因每例患者病灶大小不一，故不能对8例患者进行整体统计学分析，仅能比较每例患者自身前后病灶区域肺CT密度值的变化情况。CT肺密度值越大，表示肺纤维化程度越重。放疗前各患者CT肺密度低，经放疗照射形成RPF，CT肺密度上升，经UC-MSC治疗后第3个月和第6个月CT肺密度较治疗前下降(图 3)。
|
| 图 3 8例放射性肺纤维患者各病灶区域CT肺密度值 |
2.2.3 肺功能变化
肺功能指标FEV1和MVV在UC-MSC治疗后第6个月有一定程度的改善，DLCO在UC-MSC治疗后第3个月增加，RV在UC-MSC治疗后第6个月下降，但整体分析FEV1、MVV、DLCO、RV在治疗前后各时间点比较差异无统计学意义(P＞0.05，表 3)。
| 观察时间 | FEV1 | MVV | DLCO | RV |
| 治疗前 | 90.35±16.91 | 90.47±23.07 | 67.70±9.65 | 106.23±18.39 |
| 治疗后第3个月 | 87.41±18.07 | 92.16±11.57 | 77.46±21.43 | 112.97±10.22 |
| 治疗后第6个月 | 91.06±14.11 | 91.70±16.63 | 67.38±20.38 | 92.81±23.38 |
2.2.4 SGRQ和6MWD
8例患者UC-MSC治疗RPF前后比较SGRQ有差异(P＜0.05)，但6MWD差异无统计学意义(P＞0.05，表 4)。
| 观察时间 | SGRQ | 6MWD(m) |
| 治疗前 | 28.50±6.88 | 460.12±34.35 |
| 治疗后第3个月 | 20.50±8.66a | 450.50±56.90 |
| 治疗后第6个月 | 17.57±7.78a | 467.57±41.47 |
| a：P＜0.05，与治疗前比较 | ||
2.2.5 细胞因子变化
血清中IL-6、TNF-α、MMP1、MMP7在UC-MSC治疗后第3天降低，在治疗后第3月恢复，抗炎因子IL-10在UC-MSC治疗后增加，在治疗后第3月增加最明显，TGF-β1在UC-MSC治疗后下降，UC-MSC治疗后第3天下降最明显，但整体分析无差异(P＞0.05，表 5)。BALF中上述细胞因子在UC-MSC治疗前和治疗后第6月比较无差异(P＞0.05)。
| 观察时间 | IL-6 | IL-8 | IL-10 | IL-12 | TNF-α | TGF-β1 | MMP1 | MMP7 |
| 治疗前 | 2.93±0.49 | 40.07±19.37 | 5.26±3.00 | 12.12±6.03 | 4.18±5.06 | 16.79±10.14 | 1.61±1.10 | 0.77±0.53 |
| 治疗后第3天 | 3.25±1.14 | 30.85±16.98 | 5.37±1.74 | 9.31±5.26 | 3.76±7.84 | 6.53±3.59 | 1.28±1.39 | 0.42±0.32 |
| 治疗后第3个月 | 4.89±3.48 | 43.95±5.51 | 8.42±2.68 | 8.56±3.86 | 3.36±2.00 | 11.77±8.47 | 1.03±0.80 | 0.60±0.42 |
| 治疗后第6个月 | 2.96±1.87 | 23.73±19.52 | 5.28±2.59 | 11.44±4.63 | 4.00±2.53 | 9.21±6.98 | 1.63±1.24 | 4.57±9.79 |
3 讨论
RPF是胸部恶性肿瘤行放射治疗导致的后期不可逆肺组织损伤，严重的RPF常因弥漫性病灶导致限制性通气功能障碍增加患者的死亡风险，现有医疗技术缺乏对RPF有效的治疗手段。近年来，MSC临床应用的发展为治疗放射性肺纤维化提供了新的思路。目前国内外已陆续开展了一些MSC治疗肺部疾病(特发性肺纤维化[14]、慢性阻塞性肺疾病[15]、肺泡支气管发育不良[16]等)的初步临床研究，但尚无UC-MSC治疗RPF的相关报道。
本组病例显示UC-MSC治疗前后血常规、肝肾功指标均在正常范围波动，且未发生过敏、心血管疾病等严重不良事件。仅1例患者在治疗前肝功轻微异常，分析可能与其服用辅助抗肿瘤药物他莫昔芬导致药物性肝损害有关，在UC-MSC治疗后未见肝损害加重；该患者在治疗后第2天出现咽喉部不适，考虑纤支镜检查导致局部黏膜受损所致，经对症处理后很快缓解。另1例出现胸背痛症状加重和左上肢活动受限，考虑可能与左上肺原发肺癌多处骨转移、左前胸壁皮肤转移密切相关。
CT肺密度在影像学上可以定量、客观、可重复地评价RPF的组织破坏区域，为RPF的治疗效果评估提供了直接依据[12]。本组8例患者病变范围的肺CT密度值在放射治疗前为330~1 135 HU，放疗3个月后形成RPF，导致CT肺密度值增加至818~6 125 HU。本研究发现，在放射后3~6个月内接受UC-MSC治疗的5、6、8号3例患者CT肺密度值变化显著，但在放射治疗6个月后接受UC-MSC治疗的3、4、7号患者变化不明显，这与急性期或肺损伤早期进行UC-MSC治疗更能有效抑制纤维化[17]的基础研究吻合，是否提示RPF患者需要早期UC-MSC干预治疗？另外2例乳腺癌患者治疗前后变化亦不明显，我们推测可能与自身纤维化病灶偏小有关。
8例患者UC-MSC治疗前后肺功能各指标变化不明显，反应心肺功能的6MWD无改变，而评价呼吸困难的SGRQ治疗前后有差异，分析原因可能是因为RPF病灶局限，其余正常肺组织足够大，能够完全代偿所致。Chambers等[14]在UC-MSC治疗特发性肺纤维化的研究中发现，肺功能指标(FEV1、DLCO)在治疗前后也无明显改变，或许UC-MSC治疗肺部疾病也可能是通过提高肺耐量，并非增加通气和换气功能而发挥作用。
目前研究表明MSC通过分泌IL-10等抗炎因子和减少IL-6，IL-8、TNF-α促炎因子等发挥组织修复功能，且多种细胞因子在RPF的形成中有重要作用，包括：TGF-β、TNF-α、IL-1、IL-6、MMP、SDF-1等[18-20]。其中TGF-β1在纤维化发生、发展过程中起十分重要的作用。在体外实验中，TGF-β1作为促纤维化因子直接抑制MSC向上皮分化，并刺激MSC大量增殖，活化为肌成纤维细胞。TGF-β1在放射损伤的第1天即开始表达，在放射损伤的第6~8周显著增加[1]，且随放射时间的推移TGF-β1继续缓慢增加[21]。本组结果显示TGF-β1在UC-MSC治疗后下降，推测UC-MSC可能是通过减少TGF-β1抑制纤维化的发生。
综上所述，UC-MBC治疗RPF无严重的不良反应，且能够降低CT肺密度和改善临床症状。我们首次观察到UC-MSC治疗RPF是相对安全和有效的，并推测UC-MSC是通过减少TGF-β1抑制纤维化的形成。但因本研究入组病例偏少，同时可能存在原发肿瘤的影响，需要扩大样本以进一步证实UC-MSC治疗RPF的确切效果。
志谢: 感谢中国科学院戴建武教授团队对本课题提供的干细胞培养、储存、运输等技术指导。| [1] | Giridhar P, Mallick S, Rath G K, et al. Radiation Induced Lung Injury: Prediction, Assessment and Management[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2015, 16(7): 2613–2617. DOI:10.7314/APJCP.2015.16.7.2613 |
| [2] | Medhora M, Gao F, Jacobs E R, et al. Radiation damage to the lung: Mitigation by angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitors[J]. Respirology, 2012, 17(1): 66–71. DOI:10.1111/j.1440-1843.2011.02092.x |
| [3] | Jin H J, Bae Y K, Kim M, et al. Comparative Analysis of Human Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Adipose Tissue, and Umbilical Cord Blood as Sources of Cell Therapy[J]. Int J Mol Sci, 2013, 14(9): 17986–18001. DOI:10.3390/ijms140917986 |
| [4] | Ahn S Y, Chang Y S, Sung D K, et al. Cell type-dependent variation in paracrine potency determines therapeutic efficacy against neonatal hyperoxic lung injury[J]. Cytotherapy, 2015, 17(8): 1025–1035. DOI:10.1016/j.jcyt.2015.03.008 |
| [5] | Zhao Y F, Luo Y M, Xiong W, et al. Mesenchymal stem cell-based FGF2 gene therapy for acute lung injury induced by lipopolysaccharide in mice[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2015, 19(5): 857–865. |
| [6] | Dong L H, Jiang Y Y, Liu Y J, et al. The anti-fibrotic effects of mesenchymal stem cells on irradiated lungs via stimulating endogenous secretion of HGF and PGE2[J]. Sci Rep, 2015, 5: 8713. DOI:10.1038/srep08713 |
| [7] | Chang Y S, Choi S J, Sung D K, et al. Intratracheal transplantation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells dose-dependently attenuates hyperoxia-induced lung injury in neonatal rats[J]. Cell Transplant, 2011, 20(11-12): 1843–1854. DOI:10.3727/096368911X565038 |
| [8] | Chang Y S, Ahn S Y, Yoo H S, et al. Mesenchymal Stem Cells for Bronchopulmonary Dysplasia: Phase 1 Dose-Escalation Clinical Trial[J]. J Pediatr, 2014, 164(5): 966–972. DOI:10.1016/j.jpeds.2013.12.011 |
| [9] | Antunes M A, Abreu S C, Cruz F F, et al. Effects of different mesenchymal stromal cell sources and delivery routes in experimental emphysema[J]. Respir Res, 2014, 15: 118. DOI:10.1186/s12931-014-0118-x |
| [10] | Enright P L, Sherrill D L. Reference equations for the six-minute walk in healthy adults[J]. Am J Respir Crit Care Med, 1998, 158(5 Pt 1): 1384–1387. DOI:10.1164/ajrccm.158.5.9710086 |
| [11] | Jones P W, Quirk F H, Baveystock C M, et al. A self-complete measure of health status for chronic airflow limitation. The St. George's Respiratory Questionnaire[J]. Am Rev Respir Dis, 1992, 145(6): 1321–1327. DOI:10.1164/ajrccm/145.6.1321 |
| [12] | Duman I E, Cimsit C, Yildizeli S O, et al. Parenchymal density changes in acute pulmonary embolism: Can quantitative CT be a diagnostic tool A preliminary study[J]. Clinical Imaging, 2017, 41: 157–163. DOI:10.1016/j.clinimag.2016.11.005 |
| [13] | Schroeder J D, Mckenzie A S, Zach J A, et al. Relationships Between Airflow Obstruction and Quantitative CT Measurements of Emphysema, Air Trapping, and Airways in Subjects With and Without Chronic Obstructive Pulmonary Disease[J]. AJR Am J Roentgenol, 2013, 201(3): W460–W470. DOI:10.2214/AJR.12.10102 |
| [14] | Chambers D C, Enever D, Ilic N, et al. A phase 1b study of placenta-derived mesenchymal stromal cells in patients with idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Respirology, 2014, 19(7): 1013–1018. DOI:10.1111/resp.12343 |
| [15] | Weiss D J, Casaburi R, Flannery R, et al. A placebo-controlled, randomized trial of mesenchymal stem cells in COPD[J]. Chest, 2013, 143(6): 1590–1598. DOI:10.1378/chest.12-2094 |
| [16] | Chang Y S, Ahn S Y, Yoo H S, et al. Mesenchymal stem cells for bronchopulmonary dysplasia: phase 1 dose-escalation clinical trial[J]. J Pediatr, 2014, 164(5): 966–972. DOI:10.1016/j.jpeds.2013.12.011 |
| [17] | Chang Y S, Choi S J, Ahn S Y, et al. Timing of umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells transplantation determines therapeutic efficacy in the neonatal hyperoxic lung injury[J]. PLoS One, 2013, 8(1): e52419. DOI:10.1371/journal.pone.0052419 |
| [18] | Nadire D, Benjamin W, Qun Z. Mechanisms of the alternative activation of macrophages and non-coding RNAs in the development of radiation-induced lung fibrosis[J]. World J Biol Chem, 2016, 7(4): 231–239. DOI:10.4331/wjbc.v7.i4.231 |
| [19] | Shu H K, Yoon Y, Hong S, et al. Inhibition of the CXCL12/CXCR4-axis as preventive therapy for radiation-induced pulmonary fibrosis[J]. PLoS One, 2013, 8(11): e79768. DOI:10.1371/journal.pone.0079768.eCollection2013 |
| [20] | Sun Z, Wang C, Shi C, et al. Activated Wnt signaling induces myofibroblast differentiation of mesenchymal stem cells, contributing to pulmonary fibrosis[J]. Int J Mol Med, 2014, 33(5): 1097–1109. DOI:10.3892/ijmm.2014.1672 |
| [21] | Wei J, Xu H, Liu Y, et al. Effect of captopril on radiation-induced TGF-β1 secretion in EA.Hy926 human umbilical vein endothelial cells[J]. Oncotarget, 2007. DOI:10.18632/oncotarget.15356 |