肠球菌已逐渐成为院内感染的重要病原菌，尤以粪肠球菌和屎肠球菌多见。据2013年中国 CHINET 细菌耐药监测报道，肠球菌属细菌分离率高居阳性球菌第2位，其中屎肠球菌约占43.4%，且对所测试药物的耐药率均较高^[1]。随着我国糖肽类抗生素的广泛使用，万古霉素耐药肠球菌感染逐年增多。本研究通过对我院2012年1月至2014年2月收集到VREfm菌株其耐药基因和毒力基因检测、Tn1546结构分析、多位点序列分型、危险因素调查来初步探索耐万古霉素屎肠球菌的耐药机制和流行情况，为临床预防和控制菌株的流行与传播提供理论依据。

2012年1月至2014年2月在重庆医科大学附属第一医院收集的耐万古霉素屎肠球菌18株，均为非重复菌株。根据万古霉素的药物敏感性检测结果分为两组：①耐药组：万古霉素耐药的屎肠球菌18株；②敏感组：按耐药组与敏感组1 ∶4的比例，选取同一科室、同一病种、同期住院患者感染的万古霉素敏感屎肠球菌(vancomycin-susceptible Enterococcus faecium,VSEfm)72株作为对照组。以上全部菌株经Vitek2 Compact和Vitek MS全自动细菌鉴定系统鉴定。

从18株耐万古霉素屎肠球菌的送检科室来看，主要来源于神经内科7株，呼吸内科4株，胃肠外科、泌尿外科各2株，神经外科、肾内科、重症监护室各1株；从标本类型来看，尿液14株，分泌物2株，腹水和脑脊液各1株。

采用Vitek2 Compact全自动细菌鉴定系统以及配套AST-GP67药敏鉴定卡对18株耐万古霉素屎肠球菌用以下13种抗生素进行药敏检测：万古霉素(VAN)、替考拉宁(TEC)、利奈唑胺(LZD)、青霉素(PEN)、氨苄西林(AMP)、替加环素(TGC)、环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LEV)、奎奴普丁-达福普汀(Q/D)、红霉素(ERY)、四环素(TET)、高水平耐药的庆大霉素(HLG)、高水平耐药的链霉素(HLS)。采用微量肉汤稀释法对万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺的MIC进行检测，将万古霉素MIC≥32 mg/L的菌株判定为耐药，其判读标准及结果解释参照美国CLSI 2012年版规则^[2]。

用细菌基因组DNA试剂盒提取DNA，采用多重PCR方法对18株耐万古霉素屎肠球菌分别检测VanA、VanB、VanC1 和VanC2/3 四种耐药基因。同样采用多重 PCR方法分别对18株耐万古霉素屎肠球菌和72株万古霉素敏感屎肠球菌检测7种毒力基因：asa1、gelE、cylA、esp、hyl、sagA、acm。耐药基因及毒力基因引物按文献[3, 4, 5, 6, 7]设计，并由上海立菲生物有限公司进行合成。 PCR反应在PCR扩增仪中进行，反应体系的总体积为25 μL，其中10×buffer(含Mg²⁺) 2.5 μL、 dNTP(2.5 mmol/L) 2.0 μL、Taq DNA聚合酶(10 U/μL) 0.15 μL、正、反向引物(10 μmol/L)各1 μL、模板DNA 2 μL，最后用无菌蒸馏水补足。反应条件：预变性，95 ℃ 5 min；30个循环(变性：94 ℃ 30 s；退火：50 ℃ 1 min；延伸：72 ℃ 1 min)；延伸，72 ℃ 10 min。PCR 产物经上海立菲生物有限公司进行测序。

提取18株耐万古霉素屎肠球菌基因组DNA，用PCR方法分别扩增屎肠球菌7组管家基因(adk、atpA、ddl、gdh、gyd、pstS、purkS)。PCR产物均送至上海立菲生物有限公司进行双向测序，产物序列与肠球菌MLST数据库(http://www.mlst.net/)数据进行比对，每个管家基因可得到相应的等位基因号(allele number)，根据7个等位基因号的组合得到每株细菌的序列分型(sequence type，ST)。

采用重叠PCR方法扩增万古霉素耐药转座子Tn1546结构的基因片段，包括orf1-5、orf1-3、orf2-vanR、vanR-vanS、vanS-vanH、vanH-vanA-vanX、vanX-vanY和vanY-vanZ(各基因引物详见文献[3, 8])。扩增条件：反应体系的总体积为30 μL，包括Premix Taq 15 μL，正、反向引物(0.4 μmol/L)各1.2 μL，DNA 模板1.5 μL，最后用无菌蒸馏水补足。反应条件：预变性，94 ℃ 5 min；30个循环(变性：94℃ 30 s；退火：50℃ 30 s；延伸：72 ℃ 1 min)；延伸，72 ℃ 10 min。将以上扩增的PCR产物送至上海立菲生物有限公司进行双向测序，产物序列与屎肠球菌BM4147菌株的Tn1546转座子序列进行比对。

危险因素调查是针对我院2012年1月至2014年2月VREfm感染的患者病例资料进行回顾性分析。选取18例耐万古霉素屎肠球菌的感染患者为病例组，72例万古霉素敏感屎肠球菌的感染患者为对照组。患者相关病例资料信息均来自于我院电子病历系统和LIS系统。统计变量包括：年龄、性别、病房类型、ICU入住、慢性基础疾病、手术史、侵入性置管、肠外营养以及先前抗生素使用等。

采用SPSS 21.0统计软件进行分析。计数资料采用χ²检验或Fisher精确概率法，计量资料采用两独立样本t检验或非参数秩和检验进行单因素分析，计算 出P值、危险系数(OR值)和95%可信区间(95%CI)。 将以上单因素分析中P≤0.10的变量采用Logistic回归模型中逐步前进法(条件)进行多因素分析，并得出P值、OR值和95%CI。

18株耐万古霉素屎肠球菌对万古霉素和替考拉宁均呈现高水平耐药(VAN≥128 μg/mL、TEC≥32 μg/mL)。从药敏结果来看，所有菌株对青霉素、氨苄西林、环丙沙星、左氧氟沙星、红霉素表现耐药，对利奈唑胺、奎奴普丁达福普汀、替加环素表现敏感，其中14株对四环素表现为敏感，约占77.8%。所有菌株同时对3种以上抗菌药物表现为多重耐药(表 1)。

18株VREfm菌株经PCR反应扩增，均为VanA耐药基因阳性表达，其产物测序结果与GenBank序列数据库比对完全一致(GenBank M97297)，未检测到VanB、VanC1和VanC2/3等耐药基因表达。

将18株VREfm实验组和72株VSEfm对照组分别进行毒力基因检测，其结果显示7种毒力基因在两组中分布各不相同。从18株VREfm实验组来看，检出率最高的毒力基因分别为acm 94.4%(17/18)、esp 88.9%(16/18)、hyl 83.3%(15/18)、sagA 61.1%(11/18)、asa1 50.0%(9/18)，而gelE 和cylA的检出率仅为11.1%(2/18)和5.6%(1/18)。从基因分布来看，VREfm实验组中约有77.8 %(14/18)的菌株同时表达acm、esp和 hyl 3种毒力基因，相反，VSEfm对照组中3种基因同时表达阳性的菌株仅占36.1% (26/72)。此外，VSEfm对照组中约有14.5%(10/72)的菌株acm、esp和 hyl 3种毒力基因均未检出，而VREfm实验组中未检出上述3种基因的仅有一株。见表 2、图 1。

asa1：凝胶物质；gelE：明胶酶；cylA：细胞溶素；esp：肠球菌表面蛋白；hyl：透明质酸酶；sagA：分泌抗原；acm： 屎肠球菌胶原结合蛋白；VREfm：耐万古霉素屎肠球菌；VSEfm：万古霉素敏感屎肠球菌 图 1 7种毒力基因在VREfm组和VSEfm组的分布情况

图选项

MLST结果显示，18株耐万古霉素屎肠球菌共检出5种ST型别(ST17、ST18、ST78、ST262和ST341)，均属于克隆复合体CC17。其中11株(61.1%)为ST17，3株(16.7%)为ST18，2株(11.1%)为ST78，ST262 和ST341各1株，见表 3。通过MEGA软件对MLST结果进行进化树分析，其结果显示，11株ST17型别菌株属于同源，而ST18与ST262型别亲缘关系较近，分布于神经内科和呼吸内科；ST78与ST341型具有一定亲缘关系，分布于神经内科。

通过多对引物对耐药转座子Tn1546不同区域的扩增、拼接、测序和比对发现，18株耐万古霉素屎肠球菌可分为4种转座子类型，其中C型所占比例最多(8/18)，其余依次是D型(6/18)、A 型(2/18) 和B型(2/18)，见表 3。从转座子Tn1546结构类型来看，A型主要在orf1基因的下游存在部分缺失；B型与A型存在相似的缺失，但B型在vanX及vanY基因之间的8 731号位点处反向插入了1个插入序列1216V，该序列插入后造成了8 732~8 832区域片段的缺失；C型主要是存在orf1基因的完全缺失，并在8 745号位点处反向插入了相同的插入序列IS1216V，由于vanX与vanY基因之间存在不同的缺失片段，将C型分为C1和C2型，C1型为8 746~9 019区域片段的缺失，C2型为8 746~8 832区域片段的缺失；D型主要是存在orf1、orf2、vanR和vanS基因的完全缺失，并在8 684号位点处存在反向插入序列IS1216V以及8 685~8 828区域片段的缺失。

对18例实验组和72例对照组病例资料进行了相关危险因素的调查分析，其单因素分析结果显示：毒力基因(esp、hyl、acm)、转院患者、入住ICU、尿路感染、肠外营养、引流管和万古霉素使用等变量其差异具有统计学意义(P<0.05)，是耐万古霉素屎肠球菌感染的主要危险因素。将单因素分析中P≤0.10的变量代入Logistic回归中进行多因素分析，其结果显示：毒力基因esp(OR=6.65；P=0.027)，转院患者(OR=7.58；P=0.006)、尿路感染(OR=4.89；P=0.038)和万古霉素使用(OR=4.75；P=0.025)是耐万古霉素屎肠球菌感染的独立危险因素(表 4、5)。

肠球菌是临床较常见的一类条件致病菌，可导致人体多个部位的感染，近年来抗菌药物的广泛应用以及各种侵入性医用装置的使用，导致肠球菌对多种抗生素产生耐药以及其引起的医院感染逐渐增多^[9]。自从20世纪80年代英国伦敦首次报道分离出万古霉素耐药肠球菌(VRE)以来，其感染率呈逐渐上升趋势，继而多个国家都出现了VRE的报道，相关研究也显示VRE多见于屎肠球菌^{[10, 11, 17]}。目前万古霉素耐药肠球菌已成为医院感染的重要病原菌，而且该菌的传播流行对医院感染的预防和控制带来极大困难。

本研究初步探索了重庆医科大学附属第一医院2012年1月至2014年2月耐万古霉素屎肠球菌的耐药机制、菌株流行以及危险因素情况。本研究结果显示，18株实验菌均为VanA型耐药基因表达，从药敏结果来看，这些菌株对万古霉素和替考拉宁均表现高水平耐药，对青霉素、氨苄西林、环丙沙星、左氧氟沙星、红霉素均表现为耐药，值得注意的是，这些菌株对利奈唑胺、奎奴普丁-达福普汀、替加环素均表现为敏感。从MLST结果分析来看，18株实验菌共有5种ST型别(ST17、ST18、ST78、ST262和ST341)，均属于同一个克隆复合体(clonal complex)CC17。CC17复合克隆体是医院中存在的优势菌群，分布在世界各地，通常表现对氨苄西林及喹诺酮类抗生素耐药，同时是多种毒力因子的致病岛，可携带esp和 hyl等毒力基因，并且也有研究报道CC17复合克隆体与院内感染的爆发流行有关^[12]。国内相关报道也显示，中国地区CCl7复合克隆体的流行多与肠球菌对万古霉素获得性耐药有关^[13]。此外，从菌株进化分析结果来看，ST17型菌株所占比例最高，达61.1%(11/18)，来源于不同的临床科室，呈现散在的分布趋势，属于优势克隆。在其余7株实验菌型别中ST18(3株)与ST262(1株)型别亲缘关系较近，且主要分布在神经内科和呼吸内科；而ST78(2株)与ST341(1株)型别亲缘关系较近，均分布于神经内科，提示这4种型别存在相对集中的分布趋势。值得注意的是，神经内科所分离的耐万古霉素屎肠球菌比例高达44.4%(8/18)，菌株之间具有一定的亲缘关系，这也提示我院神经内科耐万古霉素屎肠球菌分布相对较集中，建议临床应加强相关感染的控制和预防，从而进一步控制细菌耐药的产生和传播。

肠球菌对万古霉素的耐药是基于细胞壁肽糖前体末端的D-丙氨酸-D-丙氨酸发生变化，导致万古霉素无法与之结合而不能抑制细胞壁的合成。根据VRE对万古霉素和替考拉宁的耐药水平、诱导性及转移性的不同，可将VRE基因型分为6种：VanA、VanB、VanC (C1、C2、C3)、VanD、VanE和VanG。其中VanA型是对万古霉素及替考拉宁均为高水平耐药，VanB型是对万古霉素存在不同水平耐药，而对替考拉宁表现敏感，目前临床上爆发的VRE多属于VanA型^{[14, 15]}。由于VanA型耐药基因位于转座子Tn1546上，导致其更容易转移至其他肠球菌，从而促使万古霉素耐药在不同菌株之间传播和流行。有研究表明，虽然VanA型耐药基因在不同菌株之间是高度保守的，但其转座子Tn1546的整体结构上已存在不同的插入序列(IS)元件的插入和相关区域片段的缺失^[16]。在本研究中发现，不同的克隆型别中均存在orf1基因的部分和完全缺失，同样vanX 和vanY基因之间均存在IS1216V的反向插入，这说明在转座子中存在基因的水平转移和结构重排。然而，国外文献中广泛报道的在orf1基因中IS1216V序列的反向插入^[3]以及orf2与 vanR基因之间IS1542的插入^[8]，并没有在此次研究中发现。值得注意的是，我们发现了3种新的Tn1546转座子型别(A、C和D型)，目前这3种型别在国内外文献中尚未报道。

我们通过对7种毒力基因的检测发现，在VREfm实验组中，esp、hyl和acm的检出率明显高于VSEfm对照组，其差异具有统计学意义。这说明屎肠球菌的上述3种毒力因子与其耐药存在相关性。国外研究报道，esp基因是导致肠球菌感染和耐药的重要毒力因子^[18]，与本研究中危险因素调查结果一致。该基因是临床菌株中最普遍存在的毒力因子，同时也是致病岛(pathogenicity，PAI)上重要的组成部分，相关实验也进一步证实了该基因能在尿路感染中发挥重要作用^[17]。本研究结果显示，esp基因在VREfm临床分离株中检出率达88.9%，此外，esp基因阳性的菌株均对3种以上抗生素表现出多重耐药，这与国外相关报道一致^[18]。

回顾性病例资料结果显示，转院患者是导致VREfm感染风险系数最高的独立危险因素(P=7.58；P=0.006)，从病例分析来看，约占77.8%的患者有先前院外治疗史，这类患者通常有住院时间长、基础疾病多且重、临床治愈率较低的特点，此外，在不同医院的治疗环境中，功能状态较差患者更容易受到多种院内致病菌的感染，其原因也可能与抗生素的选择性压力有关。因此，建议临床医生应更加谨慎地为转院患者选择抗生素种类以及制定感染防治措施。本研究还显示在万古霉素耐药组中存在尿路感染的患者比率高达77.8%，差异具有统计学意义，其原因可能与患者接受泌尿系统的侵入性操作有关，如长期卧床患者接受导尿管留置，该操作可能会破坏患者机体的防御功能，促进定植菌的转移，从而增加耐药菌株感染的机会。临床资料也显示，18例患者中有9例明确使用过万古霉素进行抗感染治疗，使用率高达50%，此外，从药房数据分析来看，2012-2013年我院神经内科的万古霉素使用量明显增加，也与VREfm菌株在神经内科分布最多(38.89%，7/18)相一致。其原因可能是由于位于接合性质粒上VanA耐药基因能够通过水平转移增加其传播性,而且长期使用该药也能增加肠球菌对万古霉素的耐药性。由此可见，万古霉素的不合理使用可能是导致耐药菌株出现的一个重要外因。

综上所述，本研究分析了我院分离的耐万古霉素屎肠球菌的耐药表型、毒力基因分布、转座子类型以及危险因素特点。18株VREfm基因型和表型均为VanA型，且均属于克隆复合体CC17，同时本研究还发现毒力基因esp、转院患者、尿路感染和万古霉素使用是万古霉素耐药肠球菌感染的独立危险因素。因此，我们建议临床医生应严格把握抗菌药物的适应证，注重抗生素的合理使用，同时不断深入探究耐万古霉素肠球菌耐药机制和区域流行病学特点，从而加强耐药监控工作，为临床正确选择抗菌药物，提高临床治愈率，控制细菌耐药的产生和传播提供重要指导建议。