2. 400038 重庆, 第三军医大学大坪医院野战外科研究所癌症中心;
3. 400038 重庆, 第三军医大学西南医院全军肝胆外科研究所
2. Cancer Center, Institute of Surgery Research, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400042;
3. Department of Hepatobiliary Surgery, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上发病率和病死率都较高的一种恶性肿瘤, 是世界范围内肿瘤致死的主要原因之一[1-2]。资料显示全世界50%以上的新发和死亡肝癌患者均发生在中国, 在我国其病死率居第二, 而HBV感染是我国肝细胞癌发生的最主要致病因素[2]。关于HBV引发肝癌的发病机制虽有很多报道, 但仍需进一步研究。
长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA[3-4]。研究表明lncRNA在基因表达剂量补偿效应、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥着重要作用[5-6]。近期研究报道了一些在肝细胞癌发生过程中具有关键作用的lncRNA[7-11], 但是lncRNA在HBV相关肝细胞癌中的作用研究才刚刚开始。最近有报道lncRNA-DANCR在HBV相关肝细胞癌中具有重要作用[12], 但关于HBV相关肝细胞癌进展过程中的关键lncRNA谱及其在肝细胞癌发生中的作用尚未深入分析。本研究通过对GEO(GSE54238)[12]数据库中HBV感染导致肝硬化、早期肝癌和晚期肝癌的数据进行挖掘, 构建lncRNA-mRNA共表达网络, 获得该网络中的关键lncRNA。并进一步使用另一GEO数据(GSE14520)[13]分析与关键lncRNA LINC01018、EHHADH-AS1、F11-AS1共表达的mRNA与肝细胞癌患者生存时间的相关性, 进一步明确关键lncRNA在肝细胞癌进展中的作用。
1 材料与方法 1.1 LncRNA和mRNA基因芯片表达谱数据的选择通过美国国立生物信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)的GEO(Gene Expression Omnibus)数据库, 获取2个基因表达谱数据集GSE54238和GSE14520, 其中GSE54238[12]包含10个正常人以及被HBV感染的10个肝硬化、13个早期肝细胞癌和13个晚期肝细胞癌患者的肝组织芯片数据, 用于构建lncRNA-mRNA共表达网络、Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)富集分析。GSE14520[13]选择其中216例HBV阳性的肝癌患者芯片数据用做mRNA生存相关性分析。
1.2 筛选差异基因使用R语言中的limma包[14]对数据进行标准化后, 将正常组与肝硬化组、早期肝细胞癌组和晚期肝细胞癌组分别比较获得差异表达基因(Differential expressed gene, DEG)。改变倍数在2倍以上(|Fold Change| ≥ 2)并且校正后P值(FDR)≤ 0.05的基因即为差异表达基因。
1.3 lncRNA-mRNA共表达网络构建选取在肝硬化、早期和晚期肝细胞癌患者均差异表达的非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA), 并通过对比The Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE)数据库[15-16]和Coding-Potential Assessment Tool(CPAT)软件[17]预测lncRNA编码蛋白潜力, 获取经ENCODE注释且无编码能力的lncRNA谱。通过计算经ENCODE注释的lncRNA与mRNA的皮尔森相关系数(Pearson correlation coefficient, PCC), 选取相关系数的绝对值(|correlation|, |cor|)≥ 0.9, 且P < 0.05的lncRNA-mRNA对, 构建lncRNA-mRNA共表达网络[18]。
1.4 统计学方法使用DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)[19]进行GO富集分析; 采用R语言clusterProfiler包进行KEGG富集分析[20]。使用R语言Survival包行Kaplan-Meier法生存分析和Log-rank检验[21]。
2 结果 2.1 差异基因mRNA和差异ncRNA的鉴定选取改变倍数(|Fold Change|)≥2倍或≤-0.5倍, 校正后P值(FDR)≤0.05的mRNA和ncRNA作为差异基因。与健康人相比, 肝硬化组有1 875个差异mRNA、524个差异ncRNA; 早期肝癌患者有1 758个差异mRNA、1 151个差异ncRNAs; 晚期肝癌患者有1 940个差异mRNA、845个差异ncRNAs(图 1)。
|
| 图 1 差异基因mRNA和差异ncRNA的火山图 |
2.2 ENCODE注释lncRNA的获取
目前报道的ncRNA种类繁多, 但大部分ncRNA通过RNA测序后拼接获得, 因此部分ncRNA不一定具有ncRNA的属性。而经ENCODE注释和CPAT软件预测的lncRNA更为准确和可靠。为探索lncRNA在肝硬化、早期肝癌和晚期肝癌这一疾病进展中的作用, 我们通过对比ENCODE数据库, 得到11个被ENCODE注释的差异lncRNA, 并通过CPAT工具确定它们均无编码蛋白的能力。其中2个lncRNA在肝硬化、早期和晚期肝癌中均显著上调, 9个lncRNA在肝硬化、早期和晚期肝癌中均显著下调(表 1, FDR ≤ 0.05)。
| 基因名 | ENCODE ID | UCSC或RefSeq登录号 | 表达改变倍数[log2] | ||
| 肝硬化 | 早期肝细胞癌 | 晚期肝细胞癌 | |||
| LINC00152 | ENST00000409054.1 | NR_024373 | 1.30 | 1.55 | 2.19 |
| MAPKAPK5-AS1 | ENST00000428207.4 | uc001tsy | 1.16 | 1.78 | 1.96 |
| EHHADH-AS1 | ENST00000417720.1 | uc003fpe | -2.68 | -1.58 | -2.73 |
| F11-AS1 | ENST00000505103.5 | uc003izb | -2.93 | -1.73 | -2.73 |
| LOC157273 | ENST00000520390.1 | uc003wsq | -2.91 | -2.52 | -2.88 |
| FAM99A | ENST00000382167.2 | uc009ycz | -3.12 | -2.95 | -3.21 |
| CPB2-AS1 | ENST00000606991.5 | uc001vau | -2.41 | -2.45 | -2.57 |
| HNF4A-AS1 | ENST00000452481.1 | uc002xlx | -2.34 | -1.67 | -1.90 |
| A1BG-AS1 | ENST00000595302.1 | AY927604 | -2.89 | -1.81 | -2.95 |
| LOC100422737 | ENST00000436659.5 | AJ420564 | -2.56 | -1.53 | -2.15 |
| LINC01018 | ENST00000505626.5 | uc003jdr | -3.28 | -2.08 | -3.79 |
| LINC01018 | ENST00000505626.5 | NR_024424 | -2.48 | -1.67 | -2.95 |
| LINC01018 | ENST00000505626.5 | uc003jdq | -4.01 | -2.58 | -3.63 |
2.3 lncRNA-mRNA共表达网络分析
通过构建的lncRNA-mRNA共表达网络[lncRNA-mRNA共表达系数的绝对值(|cor|)≥0.90]发现有5个ENCODE数据库注释的lncRNA(LINC01018、EHHADH-AS1、F11-AS1、A1BG-AS1和LOC100422737)与81个mRNA具有高度的共表达关系。LINC01018、EHHADH-AS1和F11-AS1居于lncRNA-mRNA共表达网络的核心位置, 与众多mRNA均具有共表达关系, 且相互之间也有共表达关系(图 2、表 2)。
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| 绿色矩形方框代表lncRNA, 蓝色矩形方框代表mRNA; 直线两端连接的两mRNA或lncRNA之间具有共表达关系。矩形方框越大, 表明与其有共表达关系的基因越多。共表达系数的绝对值(|cor|)≥0.90。虚线表示负相关, 实线表示正相关 图 2 lncRNA-mRNA共表达网络 |
| lncRNA | 共表达基因(括号内为共表达相关系数) |
| A1BG-AS1 | CD97(0.9)、RPAP3(0.9)、RHOG(0.9)、EIF2S2(0.9)、LSM7(0.91)、ZC3H4(0.91)、ARL6IP5(0.91)、ABI2(0.91)、C20orf43(0.91)、DENND4B(0.91)、FAM208A(0.92)、MICAL1(0.93)、C1orf38(0.93) |
| EHHADH-AS1 | LPCAT1(-0.92)、DMGDH(0.9)、CYP4F3(0.9)、ASPDH(0.9)、ACSL1(0.9)、TP53INP2(0.9)、ENTPD5(0.9)、SLC2A2(0.9)、FMO5(0.9)、GATM(0.9)、ABCB11(0.91)、NR1I2(0.91)、NR1I3(0.91)、ACSM3(0.91)、ALDH6A1(0.91)、ETFDH(0.91)、FMO4(0.91)、ASPDH(0.91)、SHMT1(0.91)、G6PC(0.91)、CYP4F2(0.91)、GLYAT(0.91)、SCP2(0.91)、ANG(0.91)、ANKRD56(0.91)、SERPING1(0.91)、DPYS(0.91)、CYB5A(0.91)、SLC38A4(0.91)、GPLD1(0.91)、SCP2(0.92)、RORC(0.92)、INHBC(0.92)、PCK2(0.92)、MASP1(0.92)、ABAT(0.92)、EHHADH(0.92)、CPN2(0.92)、ACOX1(0.93)、CYB5A(0.93)、FMO5(0.93)、MOSC2(0.94)、F11(0.94)、ADH6(0.94) |
| F11-AS1 | NR1I3(0.9)、PON1(0.9)、ALDH6A1(0.9)、ACOX1(0.9)、CYP2C9(0.9)、GYS2(0.9)、CFHR3(0.9)、ACSM2A(0.91)、SERPINA4(0.91)、ALB(0.91)、FTCD(0.91)、HAAO(0.91)、CFHR4(0.91)、ALDOB(0.92)、ADH6(0.92)、AFM(0.92)、GLYAT(0.92)、ANXA10(0.92)、PBLD(0.93)、G6PC(0.93)、TAT(0.93)、SLCO1B1(0.93)、ABAT(0.93)、F11(0.94) |
| LINC01018 | LPCAT1(-0.91)、AKR7A3(0.9)、DMGDH(0.9)、LECT2(0.9)、PCK1(0.9)、SERPING1(0.9)、ASPDH(0.9)、ABAT(0.9)、FMO5(0.9)、CYP4A22(0.9)、ABAT(0.91)、ASPDH(0.91)、ANXA10(0.91)、CYP2C9(0.91)、GBP7(0.91)、ALDOB(0.91)、MASP1(0.91)、GPLD1(0.91)、CYP4F2(0.91)、CFHR3(0.91)、GYS2(0.91)、LECT2(0.91)、CYP2C19(0.91)、CYP4A11(0.91)、SLCO1B1(0.91)、GLYATL1(0.92)、CFHR3(0.92)、SLC10A1(0.92)、G6PC(0.92)、SLCO1B1(0.92)、CYP4F2(0.92)、DMGDH(0.92)、ADH6(0.92)、ASPDH(0.92)、CFHR4(0.92)、ABAT(0.92)、GLYAT(0.92)、ANXA10(0.92)、CFHR4(0.93)、G6PC(0.93)、ANXA10(0.93)、CYP2C9(0.93)、TAT(0.93)、SLC10A1(0.93)、ALDOB(0.93)、MASP1(0.93)、GPLD1(0.93)、CYP4F2(0.93)、GLYATL1(0.93)、CFHR3(0.93)、GLYAT(0.93)、GYS2(0.93)、ABAT(0.94)、CYP2C19(0.94)、G6PC(0.94)、GYS2(0.94)、CFHR4(0.94)、GLYAT(0.94)、F11(0.94)、TAT(0.94)、F11(0.95) |
| LOC100422737 | CD97(0.9)、FAM20B(0.91)、QSOX2(0.91)、SDCBP(0.92) |
2.4 lncRNA-mRNA共表达网络中mRNA的GO、KEGG分析
GO分析发现lncRNA-mRNA共表达网络中的mRNA主要参与氧化还原(GO:0055114~oxidation reduction)、呼吸电子链传递(GO:0009055~electron carrier activity)、辅因子结合(GO:0048037~cofactor binding)、羧酸分解过程(GO:0046395~carboxylic acid catabolic process)、脂肪酸代谢过程(GO:0006631~fatty acid metabolic process)等(图 3A)。KEGG分析发现lncRNA-mRNA共表达网络中的mRNA主要参与PPAR信号转导(PPAR signaling pathway)、药物代谢-细胞色素P450酶(drug metabolism -cytochrome P450)、脂肪酸降解(fatty acid degradation)、过氧化物酶体(peroxisome)、糖酵解和糖异生(glycolysis/gluconeogenesis)等(图 3B)。上述分析说明这5个lncRNA在从肝硬化到早期肝细胞癌和晚期肝细胞癌的进展过程中可能有重要作用。
|
| 图 3 GO分析(A)和KEGG信号通路富集(B)分析 |
2.5 与关键lncRNA LINC01018、EHHADH-AS1、F11-AS1共表达的mRNA与肝细胞癌患者生存曲线的相关性
为进一步探讨上述发现的关键lncRNA在肝细胞癌发生、发展中的作用, 选取lncRNA-mRNA共表达网络中最为核心的3个lncRNA(LINC01018、EHHADH-AS1、F11-AS1)作为研究对象, 使用GEO(GSE14520)数据, 分析与它们具有高相关性的mRNA与肝细胞癌患者生存预后的关系。生存曲线分析发现有15个共表达的mRNA与HBV相关肝细胞癌患者生存率具有显著相关性(P < 0.05, 表 3)。其中6个mRNA与HBV相关肝细胞癌患者生存率具有高度相关性, 如SLC2A2、PCK2(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶2)、EHHADH(烯酰辅酶A水合酶和3-羟酰辅酶A脱氢酶)、F11(凝血因子11)、FMO4(黄素单加氧酶4)、NR1I3(雄甾烷X受体蛋白)(P < 0.01, 图 4)。
| lncRNA | 关联基因mRNA | Pa |
| EHHADH-AS1 | SLC2A2 | 2.32×10-5 |
| EHHADH-AS1 | PCK2 | 0.0002 |
| EHHADH-AS1 | EHHADH | 0.0005 |
| EHHADH-AS1, F11-AS1, LINC01018 | F11 | 0.0007 |
| EHHADH-AS1 | FMO4 | 0.0007 |
| F11-AS1, EHHADH-AS1 | NR1I3 | 0.0007 |
| LINC01018 | CYP4A11 | 0.0010 |
| LINC01018, F11-AS1 | ALDOB | 0.0016 |
| EHHADH-AS1, LINC01018, F11-AS1 | G6PC | 0.0017 |
| LINC01018 | SLC10A1 | 0.0018 |
| LINC01018, EHHADH-AS1 | GPLD1 | 0.0021 |
| EHHADH-AS1, F11-AS1, LINC01018 | GLYAT | 0.0028 |
| EHHADH-AS1 | CYP4F3 | 0.0036 |
| EHHADH-AS1 | ACSM3 | 0.0042 |
| F11-AS1, EHHADH-AS1 | ACOX1 | 0.0048 |
| a:Log-rank检验 | ||
|
| A:SLC2A2;B:PCK2;C:EHHADH; D:F11;E:FMO4;F:NR1l3 数据来自GEO数据库(GSE14520) 图 4 核心lncRNA相关的mRNA与肝细胞癌患者生存曲线的相关性 |
3 讨论
近年来众多研究表明HBV涉及肝细胞的癌变、侵袭及转移, 在肝癌的发生和发展过程中具有关键作用[22]。近期研究报道lncRNA在多种肝细胞癌发生过程中具有重要作用[7-11], 且发现lncRNA在HBV相关肝细胞癌中也具有一定的作用, 如lncRNA-DANCR增强癌细胞的干细胞特性(stemness features)从而加剧肝细胞癌的恶性程度[12]。我们前期研究发现了多个lncRNA以内源性竞争性RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)的方式调控HBV相关肝细胞癌发生的关键基因[23]。
lncRNA通过调控靶基因mRNA的转录、稳定性等多种方式影响其靶基因的表达[5-6]。lncRNA-mRNA共表达网络是分析lncRNA功能和调控机制的重要方式[24]。本研究通过深度数据分析呈现了在HBV相关肝细胞癌由肝硬化向早期、晚期肝癌进展过程中的差异lncRNA表达谱和lncRNA-mRNA共表达网络。GO和KEGG分析发现lncRNA-mRNA共表达网络中的差异mRNA主要影响氧化还原、呼吸电子链传递、辅因子结合、羧酸分解过程、脂肪酸代谢过程等GO功能和PPAR信号转导、药物代谢-细胞色素P450酶、脂肪酸降解、过氧化物酶体、糖酵解和糖异生等KEGG信号通路。这进一步说明本研究发现的lncRNA-mRNA共表达网络中关键lncRNA在HBV相关肝细胞癌的发生、发展中具有关键作用, 为全面了解和进一步研究lncRNA在HBV相关肝细胞癌发生、发展中的改变情况和作用提供了新的思路。
我们发现的关键lncRNA在肝细胞癌或者其他肿瘤中均有不同程度的报道。如近期研究发现与正常肝组织相比, lnc01018(SRHC)在肝癌组织和肝癌细胞系中的表达均出现显著下调。lnc01018显著抑制肝癌细胞株SMMC-7721、HCC-LM3细胞的活力、增殖和克隆形成能力, 与我们预测结果[25]一致。文献报道F11-AS1在胰腺导管腺癌的各种细胞系中均表达降低[26], 与我们在HBV相关性肝细胞癌中的发现一致, 但其作用和功能还有待进一步研究。本研究发现EHHADH-AS1可能在肝癌中有重要作用, 并预测了其功能。EHHADH-AS1是EHHADH的反义链lncRNA, 而EHHADH主要参与代谢相关通路, 是转移性肝癌细胞中的一种新的分泌蛋白, 可以作为肝癌的独立的预后分子[27-28]。作为EHHADH的反义链lncRNA, EHHADH-AS1极有可能参与调控EHHADH的表达。因为反义lncRNA可通过与邻近基因形成RNA-RNA二聚体以提高mRNA稳定性, 正向调控基因的表达效率[29-31]。因此未来对EHHADH-AS1作用和机制的深入研究, 将有望成为一个全新的HBV相关性肝细胞癌诊断和预后标志物。
生存曲线分析可以反映基因的表达与患者预后的关联[32]。本研究发现与最为关键的3个lncRNA相关的mRNA中, 共有15个基因与HBV相关肝细胞癌患者的生存率具有显著相关性, 且其中6个基因具有高度相关性(P < 0.01)。如EHHADH主要参与代谢有关通路, 最近有研究报道它是转移性肝癌细胞中的一种新的分泌蛋白, 可以作为肝癌的独立预后分子[27-28]。PCK2主要与有氧糖酵解通路有关, 其低表达对维持肿瘤再生细胞的生长和成瘤至关重要; 过表达PCK2后肿瘤再生细胞体外生长受到抑制, 且体内致瘤能力减弱[33], 和我们预测的PCK2和代谢通路相关且其高表达有利于患者生存的结果相一致。FMO4是一种重要的药物相关代谢酶[34], 其高表达可提高复发性胶质母细胞瘤患者的生存时间[35], 与我们的预测基本一致。NR1I3是核受体家族的重要一员, 是外源性和内源性代谢的关键调节器[36]。有报道发现NR1I3的表达可影响抗肿瘤药物的代谢, 有望成为一种新的肿瘤标志物[37]。SLC2A2(溶质转运家族2成员2)是调节细胞对葡萄糖摄取的重要蛋白。有报道发现丙肝病毒感染可抑制SLC2A2的表达, 降低细胞对葡萄糖的摄取, 引发糖尿病, 降低患者存活时间[38], 这与我们在HBV相关肝细胞癌的发现类似。进一步证实本研究发现的关键lncRNA在HBV相关肝细胞癌的发生、发展中具有极其关键的作用。
综上所述, 本研究全面分析了HBV相关肝细胞癌进展过程中的关键lncRNA谱, 并且发现了一个新的可能在HBV相关肝细胞癌进展过程中具有重要作用的lncRNA EHHADH-AS1。因此进一步研究上述发现的关键lncRNA在HBV相关肝细胞癌的发生、发展中的作用及机制, 有望为HBV相关肝细胞癌的诊断、治疗和预后提供新的分子和潜在的新靶标。
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