2. 400038 重庆，陆军军医大学(第三军医大学)药学与检验医学系药剂学教研室
2. Department of Pharmacy, Faculty of Pharmacy and Laboratory Medicine, Army Medical University(Third Military Medical University), Chongqing, 400038, China
小胶质细胞是中枢神经系统的先天免疫细胞，对神经发育和功能起着关键作用，与突触可塑性、神经支持、化学趋化、神经发生与炎症调节等密切相关[1-2]。在健康状态下，小胶质细胞以静息态存在，其主要功能是维持神经组织的稳定和清除代谢产物。然而，在神经炎症过程中，小胶质细胞可发生极化而分为两个亚型：M1型和M2型[3]。M1型小胶质细胞释放促炎因子，如TNF-α和IL-1β，加剧炎症反应；而M2型小胶质细胞释放抗炎因子，如IL-10和IL-4，具有神经保护作用[4-5]。这2种亚型小胶质细胞之间的平衡调控着神经炎症的进程。近年来，研究者们致力于探讨小胶质细胞极化的分子机制，以期为神经炎症的治疗提供新靶点。有研究报道，某些药物和生物分子可以通过调控小胶质细胞的极化，减轻神经炎症反应[6-8]，如中医药中的某些具有抗炎和神经保护作用的成分，可能通过调节小胶质细胞的极化发挥作用。
小白菊内酯(parthenolide, PTL)是草本类植物艾菊中提取分离的一种倍半萜内酯，具有多种药理作用，包括抗炎、抗氧化、抗肿瘤、促进坐骨神经的再生等[9]。PTL能显著降低M1型小胶质细胞的活化和促炎因子的释放，从而减轻神经炎症和神经元损伤，并能部分逆转LPS诱导所致的M2表型标志物表达的下降，增强其抗炎和神经营养作用，保护神经[10]。尽管有研究提示，其可能的机制与PTL可以调节小胶质细胞的JNK、NF-κB等信号通路有关[9, 11]，但PTL对小胶质细胞作用的研究仍不够充分，需要进一步探讨其作用机制和临床应用价值。
Siglec-E是一种唾液酸结合型免疫球蛋白样凝集素，主要在免疫细胞表达，通过结合以唾液酸为末端的特异性聚糖结构，调节免疫细胞的活化和功能，降低炎症反应[12-13]。有研究报道：炎症及损伤可以诱导小胶质细胞高表达Siglec-E，抑制小胶质细胞的吞噬作用的同时，发挥重要的抗炎和神经保护作用[14]。作为具有抗炎作用的外源性药物PTL与内源性分子Sigelec-E是否共享相同的抗炎信号传导通路，PTL是否经Siglec-E发挥抗炎作用尚不清楚。本研究拟通过体内外实验明确PTL抗炎作用的发挥与Siglec-E表达之间的关系，为进一步开发基于PTL及Siglec-E的抗神经炎症药物提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 生物信息学分析从基因表达综合(gene expression omnibus，GEO)数据库下载注册号为GSE212616的小鼠小胶质细胞scRNA-seq数据，使用R 4.1.3版本软件的edgeR包对数据进行标准化处理，并且进行差异分析，按照P＜0.05且|LogFC|＞0.1对差异基因进行筛选。使用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对差异基因进行富集分析，按照FDR值＜0.05且count值＞2筛选显著性富集结果。基因本体论(Gene Ontology，GO)注释相关条目使用ggplot2可视化为柱状图，展示前10个显著性相关条目。京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路使用ggplot2可视化为气泡图。
1.2 细胞培养及药物处理小鼠小胶质细胞系BV2(中国莱博斯生物公司)常规培养于含10%胎牛血清(美国Hyclone公司)和1%青-链霉素的DMEM高糖培养基(美国Hyclone公司)中，培养至对数生长期后，置换为含1%胎牛血清的DMEM高糖培养基处理12 h后，给予1 μmol/L PTL(美国MCE公司)处理2 h，而后给予1 μg/mL LPS刺激。
1.3 BV2细胞Siglec-E敲低模型构建shRNA克隆载体编号：plvx-shRNA2-Zsgreen-T2A-puro，元件顺序：U6-MCS-Zsgreeen-T2A-puro。NC-shRNA插入序列：TTCTCCGAACGTGTCACGT，Siglec-shRNA插入序列：ACGGAGTACTCAGAGATAAAG。以2.5×105/孔接种BV2细胞于24孔板中过夜培养，每孔培养总体积1 mL。按照LipofectamineTM 3000(美国Invitrogen公司)说明书进行转染，48 h后通过观察荧光判断转染效率并加入2 mg/mL嘌呤霉素筛选培养基，每天更换新鲜的筛选培养基直至所有细胞都带绿色荧光信号，换为常规完全培养基后扩增细胞用于实验。将得到的NC-shRNA和Siglec-shRNA细胞分为Control组、LPS组、PTL组和PTL+LPS组。
1.4 动物模型建立与干预C57 WT小鼠(购自陆军军医大学动物实验中心)和Siglecefl/fl×Cx3cr1cre小鼠(购自美国赛业生物公司的Siglecefl/fl和Cx3cr1cre小鼠交配繁殖获得)均在无病原体的条件下饲养，温度保持在22~25 ℃，12 h/12 h的光/暗周期，可自由获取水和食物。所有动物实验按照机构指南进行，并已获得陆军军医大学实验动物伦理委员会批准(AMUWEC20211295)。出生4 d的雄性WT和Siglecefl/fl×Cx3cr1cre小鼠各9只，体质量约为2 g，设置Control组、LPS组和PTL+LPS组，每组3只。从出生后第4天，每天给幼鼠腹腔注射20 mg/kg PTL(Control组和LPS组注射等体积玉米油)，2 h后腹腔注射250 μg/kg LPS(Control组注射等体积生理盐水)，第8天注射完后6 h收取脑组织样本固定于4%多聚甲醛中，依次用15%、30%蔗糖梯度脱水后包埋制备冰冻切片。
1.5 RT-qPCR检测细胞/组织用TRIzol试剂(中国天根公司)提取总RNA。依照HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR试剂(中国诺唯赞公司)说明书去除基因组DNA，然后反转录制备cDNA。根据Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒(中国诺唯赞公司)说明书进行定量PCR。本研究使用2-ΔΔCt法计算目的基因表达变化。用GAPDH基因对结果进行归一化处理。引物序列见表 1。
| 基因 | 引物序列(5′→3′) | 产物长度/bp |
| GAPDH | 上游：TGGATTTGGACGCATTGGTC | 20 |
| 下游：TTTGCACTGGTACGTGTTGAT | 21 | |
| iNOS | 上游：CAGGGAGAACAGTACATGAACAC | 23 |
| 下游：TTGGATACACTGCTACAGGGA | 21 | |
| IL-1β | 上游：TGAAAACACAGAAGTAACGTCCG | 23 |
| 下游：CCCAGGAGGAAATTGTAATGGGA | 23 | |
| IL-6 | 上游：GGCGGATCGGATGTTGTGAT | 20 |
| 下游：GGACCCCAGACAATCGGTTG | 20 | |
| Siglece | 上游：GGAGGGTCAGAACCCCCAA | 19 |
| 下游：TGAGATAGGAGAAGTTACAGGGC | 23 |
1.6 Western blot分析
细胞/组织中加入细胞裂解缓冲液(中国碧云天公司)后在冰上裂解，蛋白质变性后用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(德国Millipore公司)上，用5%脱脂牛奶密封1 h。与一抗在4 ℃的低速摇床孵育过夜，用TBST洗涤3次，10 min /次。与二抗在室温下孵育2 h，用TBST洗3次，然后与发光液混合显色。抗体信息见表 2。
| 抗体名称 | 品牌 | 使用浓度 |
| JNK | Zen Bio (中国) | 1∶2 000 |
| p-JNK | Zen Bio (中国) | 1∶2 000 |
| ERK | Zen Bio (中国) | 1∶2 000 |
| p-ERK | Zen Bio (中国) | 1∶2 000 |
| P38 | Zen Bio (中国) | 1∶2 000 |
| p-P38 | Zen Bio (中国) | 1∶2 000 |
| IκB | Zen Bio (中国) | 1∶2 000 |
| p- IκB | Zen Bio (中国) | 1∶2 000 |
| GAPDH | Proteintech(中国) | 1∶5 000 |
1.7 免疫荧光
细胞爬片/脑组织切片在含有0.05% TritonX-100和10%山羊血清(中国碧云天公司)的PBS中浸泡封闭1 h后孵育一抗。将一抗兔抗IBA1(1 ∶100，中国艾方生物公司)、鸡抗GFP (1 ∶500，英国abcom公司)、山羊抗Siglec-E (1 ∶200，美国R&D公司)、兔抗p-NF-κB (1 ∶300，美国CST公司) 4 ℃孵育过夜，用DPBS洗涤3次，然后于室温避光孵育二抗2 h，用DAPI (1 ∶100，中国Solarbio公司)进行核染色。图像采集选择蔡司荧光显微镜。
1.8 统计学分析本研究中生物信息学分析及图像绘制使用R软件(4.1.3版本)。用Image J软件测定并记录Western blot条带灰度值。采用Graghpad Prism 9.0软件进行数据分析及柱状图绘制，计量资料以x±s表示，t检验用于2组之间的数据分析，单因素方差分析用于比较多组数据间差异。P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 下调Siglec-E可能影响小胶质细胞极化从GEO数据库下载的单细胞测序数据野生型组(n=3)和敲除组(n=4)获取小胶质细胞的差异表达基因。火山图展示差异情况，得到上调基因966个，下调基因1 393个，其中包含了iNOS、IL-1β等与小胶质细胞极化相关的标志基因(图 1A)。KEGG通路富集分析提示Siglec-E与NF-κB信号通路、TLR信号通路等相关(图 1B)。GO相关注释提示，Siglec-E与IκB/NF-κB通路、IL-1β/IL-6的表达、ERK1/2级联反应等相关，且与核糖体功能关系密切(图 1C)。
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| A：差异基因火山图；B：KEGG通路富集气泡图；C：GO注释图 图 1 差异表达基因的筛选及富集分析 |
2.2 敲低/敲除模型中Siglec-E表达显著减少
利用shRNA技术敲低BV2细胞中Siglec-E的表达从而构建Siglec-E低表达小胶质细胞模型，通过RT-qPCR技术检测其mRNA表达水平。NC-shRNA组细胞与野生型BV2细胞的Siglec-E表达无明显差异。与NC-shRNA组比较，Siglece-shRNA组下降约70%(P < 0.01，图 2A)，免疫荧光结果同样证实Siglec-E的表达显著降低(图 2B)。相较于WT小鼠，Siglecefl/fl×Cx3cr1cre小鼠小胶质细胞中Siglec-E的mRNA表达处于极低水平(P < 0.01，图 2C)，且脑组织蛋白中Siglec-E表达也明显降低(图 2D)，但小鼠整体生长发育无明显异常。冰冻切片免疫荧光显示，Siglecefl/fl×Cx3cr1cre小鼠小胶质细胞几乎不表达Siglec-E(图 2E)。
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| A：RT-qPCR检测Siglec-E在细胞株中mRNA表达水平 a：P < 0.01，与NC-shRNA组比较；B：免疫荧光检测Siglec-E在NC-shRNA和Siglece-shRNA细胞中表达情况；C：原代小胶质细胞Siglec-E的mRNA表达水平 a：P < 0.01，与WT组比较；D：小鼠脑组织蛋白Siglec-E表达情况；E：小鼠脑组织下丘皮层处小胶质细胞和Siglec-E共定位免疫荧光图像 △：示IBA1和Siglec-E双阳性；红色：Siglec-E；绿色：IBA1；蓝色：DAPI 图 2 shRNA干扰细胞株/Siglece敲除动物中Siglec-E的表达情况(n=3，x±s) |
2.3 下调小胶质细胞Siglec-E的表达减弱PTL对其M1型极化的抑制作用
RT-qPCR结果显示：Control组中检测到较少的促炎因子iNOS、IL-1β和IL-6。在LPS刺激下M1型小胶质细胞分泌的iNOS、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平显著升高(P < 0.01)。单纯加入PTL对以上促炎因子的表达无明显影响，而在PTL合并LPS的条件下，PTL能显著抑制LPS所致小胶质细胞M1型极化作用(P < 0.05，图 3A)，但对于Siglec-E敲低的BV2细胞(Siglece-shRNA BV2细胞)，尽管PTL也能诱导IL-6的表达水平显著降低，但是降低程度低于NC-shRNA BV2细胞。同时，iNOS和IL-1β的表达水平并未显著减少(图 3B)。
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| 1：Control组；2：LPS组；3：PTL组；4：PTL+LPS组；a：P < 0.01，与Control组比较；b：P < 0.05，与LPS组比较 图 3 各组NC-shRNA细胞(A)和Siglece-shRNA BV2细胞(B)的iNOS、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平(n=3，x±s) |
2.4 下调Siglec-E会减弱PTL经MAPK/NF-κB通路对M1极化抑制作用
LPS刺激4 h后，NC-shRNA和Siglece-shRNA BV2细胞中JNK和IκB蛋白的磷酸化水平都明显升高(P < 0.01)，但ERK和P38蛋白磷酸化水平未受到明显影响。给予PTL预处理的NC-shRNA细胞中，经LPS诱导的p-JNK和p-IκB的水平显著降低(P < 0.01)；而在Siglece-shRNA BV2细胞中没有显著差异(图 4A~C)。根据p-NF-κB免疫荧光结果，LPS刺激1 h后磷酸化的NF-κB聚集于小胶质细胞核内，而在刺激前给予PTL的NC-shRNA BV2细胞中磷酸化NF-κB主要存在于细胞质。与之相反，刺激前给予PTL处理的Siglece-shRNA BV2细胞中磷酸化的NF-κB仍大量聚集于细胞核内(图 4D)。研究结果表明：PTL可以通过抑制MAPK信号通路中的JNK蛋白以及NF-κB信号通路中的IκB蛋白磷酸化，抑制NF-κB核转位，从而减轻LPS诱导的小胶质细胞炎性反应，但Siglec-E的表达降低会减弱这一作用。
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| A：Western blot检测；B~C：半定量分析(n=3，x±s) a：P < 0.01，与Control组比较；b：P < 0.05，与LPS组比较；D：p-NF-κB的核转位情况 绿色：GFP；红色：Siglec-E；蓝色：DAPI 图 4 下调Siglec-E后相关蛋白表达水平及NF-κB的核转位情况 |
2.5 Siglec-E缺失导致PTL对小胶质细胞NF-κB磷酸化抑制作用减弱
WT和Siglecefl/fl×Cx3cr1cre小鼠从出生第4~8天，每天给予LPS刺激2 h前腹腔注射PTL予以保护，第8天灌注取脑组织样本制备冰冻切片。脑冰冻切片下丘皮层处IBA1和p-NF-κB免疫荧光共染结果显示，与Control组比较，LPS组小胶质细胞p-NF-κB表达水平显著增加，且主要在细胞核内。而在PTL+LPS组中，尽管p-NF-κB表达都有所减少，但WT小鼠明显表达更低，结果提示Siglec-E缺失导致PTL对小胶质细胞NF-κB抑制作用减弱(图 5)。
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| △：示细胞结构较完整的小胶质细胞；绿色: p-NF-κB；红色：IBA1；蓝色：DAPI 图 5 小鼠下丘皮层处IBA1和p-NF-κB免疫荧光共染图像 |
3 讨论 3.1 Siglec-E缺失导致PTL对小胶质细胞M1极化抑制作用减弱
神经炎症逐渐成为众多神经系统疾病发病机制中的关键因素。其显著特点之一是胶质细胞激活，尤其是小胶质细胞激活[14]。激活的小胶质细胞会释放各种破坏性促炎因子，累积之后会导致周围神经元损伤，而神经元的持续损伤及死亡又会进一步激活小胶质细胞，形成恶性循环，导致长期的神经炎症和神经元的进行性丢失[15]，从而引发各种神经系统疾病。因此，抑制小胶质细胞激活，或者说抑制其M1极化，进而减轻神经炎症，可能成为一种有前景的神经保护的治疗策略。本研究探讨了Siglec-E在小胶质细胞极化中的作用及其对PTL抗炎效应的影响。通过生物信息学分析发现，Siglec-E与小胶质细胞极化相关，而后利用shRNA干扰技术构建了Siglec-E敲低的BV2细胞株模型，并通过转基因小鼠交配获得了小胶质细胞特异性Siglec-E缺失的动物模型。通过RT-qPCR及免疫荧光技术验证了敲除效果，并通过Western blot方法研究了Siglec-E如何影响PTL抑制小胶质细胞M1极化的机制。有研究发现，PTL显著抑制小胶质细胞促炎细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的释放，并增加IL-10水平[14]。本研究也发现，PTL降低了BV2细胞促炎细胞因子iNOS、IL-6、IL-1β的mRNA水平，证实PTL具有抑制小胶质细胞经LPS激活向M1极化的作用，而siglec E的缺失在一定程度上减弱了PTL的抗炎效应。
3.2 Siglec-E经NF-κB通路影响PTL的抗炎作用本研究发现，尽管敲低细胞株/敲除动物模型的Siglec-E表达显著减少，但在正常情况下对细胞和小鼠的生长并无明显影响。其原因其在于Siglec-E的作用可能主要是针对小胶质细胞所处微环境的变化而发生。有研究已经证实在没有外界刺激的情况下大脑中的Siglec-E呈低表达状态，但在炎症或损伤刺激下，其表达会迅速而强烈地被诱导提高[15]。提示Siglec-E的表达与小胶质细胞炎症反应相关。通过分析GEO数据库中野生型和敲除型小鼠脑组织单细胞测序数据揭示了Siglec-E在小胶质细胞中的潜在作用。GO分析中，生物学过程(biological process, BP)分析提示，Siglec-E影响LPS的反应、调节炎症反应、IL-1β/IL-6的表达等。KEGG富集分析表明Siglec-E参与NF-κB和Toll样受体通路等相关信号通路。NF-κB信号传导通路与小胶质细胞极化之间存在密切关系。正常情况下，NF-κB以与IκB蛋白结合的二聚体形式存在于细胞质中，处于静息状态。当小胶质细胞受到炎症刺激时，IκB激酶复合物被激活，进而磷酸化IκB蛋白，导致IκB蛋白被泛素化并降解，从而释放出NF-κB，使其转位入核，并能够结合到特定的DNA序列上，启动相关基因的转录，进而调控炎症因子的产生[16]。激活的NF-κB可以诱导M1型小胶质细胞释放促炎细胞因子(如IL-1β、TNF-α等)、趋化因子、氧自由基和一氧化氮等神经毒性物质，从而加重炎症反应和神经元损伤[17]。PTL能够抑制IκB激酶的活性，从而阻止IκB的磷酸化及之后的泛素化降解过程，导致NF-κB无法被释放并进入细胞核，进而降低了炎症基因的表达。除此之外，PTL还能抑制组蛋白去乙酰化酶1的活性[18]，而这一酶的抑制有助于维持IκB蛋白的稳定性，进一步抑制NF-κB的活化。另一方面，抑制NF-κB信号通路可以促使小胶质细胞从M1促炎表型向M2抗炎表型极化。M2型小胶质细胞释放抗炎性细胞因子、神经营养因子，具有抗炎和促进组织修复重塑的作用，有助于清除细胞碎片、保护神经元和促进神经再生[19]。本研究结果显示，下调Siglec-E的表达后，PTL对NF-κB通路的抑制作用减弱，证实Siglec-E通过NF-κB通路影响PTL的抗炎作用。
3.3 Siglec-E经MAPK通路影响PTL的抗炎作用MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)信号传导通路在小胶质细胞极化过程中也起着重要作用。在小胶质细胞中，MAPK信号通路主要涉及ERK(细胞外信号调节激酶)、JNK(c-Jun氨基末端激酶)和p38 MAPK三个亚家族，激活的ERK信号通路可以促进小胶质细胞的增殖和活化，从而促使小胶质细胞向M1促炎表型极化。而JNK和p38 MAPK信号通路的激活则主要参与小胶质细胞的炎症反应和细胞应激过程[4]。有研究报道PTL可以通过AKT/MAPK/NF-κB信号通路减少活性氧的产生[15]。研究证实PTL可以通过抑制MEK(MAPK激酶)的活性阻断ERK(细胞外信号调节激酶)的激活。ERK信号通路在小胶质细胞的增殖、迁移等过程中发挥重要作用。JNK信号通路在小胶质细胞的应激、炎症反应和凋亡等过程中起重要作用，PTL也可以阻断JNK信号通路的激活[20]。本研究的结果也证实PTL可以降低LPS刺激诱导的磷酸化JNK蛋白表达水平，这与报道的内容一致。这些研究为Siglec-E经MAPK通路影响PTL的抗炎作用提供依据。另一方面，Siglec E作为一种模式识别受体，能够识别并结合特定的聚糖配体，进而调控小胶质细胞活化、增殖、极化和迁移等各种生物学功能[13, 21]。既往报道M1表型巨噬细胞具有捕获、吞噬功能[22]。有研究显示，Siglec-E能抑制小胶质细胞对神经元碎片的吞噬，阻止小胶质细胞分泌促炎细胞因子和产生超氧阴离子，而Siglec-E基因的敲除则增加了神经碎片的吞噬[12]，考虑到JNK通路的激活与小胶质细胞的吞噬作用密切相关[23]，PTL可能在一定程度上通过Siglec-E影响JNK通路抑制小胶质细胞的吞噬功能发挥抗炎作用。
此外，作为聚唾液酸的受体，当小胶质细胞受到LPS刺激后，它会通过细胞膜内吞，向高尔基体方向移动与聚唾液酸结合，从而负向调节小胶质细胞的激活[24]。PTL与Siglec-E的分子对接得分为-6.4，实际的结合能力需要验证。本研究的生物信息学分析结果中细胞内组分和分子功能分析均提示siglec E和核糖体关系密切。也有研究提示LPS促进Siglec-E内吞向高尔基体移动[12]，核糖体作为承担翻译功能的细胞器，高尔基体作为翻译后蛋白修饰的重要场所，Siglec-E参与炎症相关蛋白分子的正常翻译与修饰的作用也值得研究。因此，Siglec-E的表达影响PTL抗炎作用的具体机制还需要更深入的研究来揭示。综上所述，本研究证实了Siglec-E对炎症反应的重要作用，完善了PTL发挥抗炎作用的可能机制，为进一步开发基于PTL及Siglec-E的抗神经炎症药物提供了实验依据。
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