2. 100853 北京, 中国人民解放军总医院第一医学中心肝胆胰外科医学部研究所
2. Institute of Hepato-Pancreato-Biliary Surgery, The First Medical Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing, 100853, China
历史上的几次流感大流行给人类健康和生命财产安全造成了严重危害，累计数亿人感染和数千万人死亡[1]。接种疫苗仍然是预防和控制流感最有效的措施。世界卫生组织(World Health Organization，WHO)与全球多家机构合作，检测世界各地流感的活动情况，每半年根据南北半球流感病毒流行情况更新流感病毒疫苗组分。据美国疾病控制中心(Center for Disease Control，CDC)统计，2004-2019年，流感疫苗的保护效力在10%~60%[2]。流感疫苗保护效力低下可能的原因有以下2个方面：①流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA) 是诱导流感病毒特异性保护抗体的关键抗原，也是疫苗设计的关键靶点。HA空间结构可分为头部和茎部两部分，当前季节性流感疫苗目的在于引起HA头部特异性中和抗体反应[3]。然而，HA头部结构域易突变导致抗原漂移[4]，导致季节性流感疫苗预防新突发流感病毒的作用有限[5]。②目前获批的流感疫苗大多数是以鸡胚为介质生产的，极易诱发病毒的适应性突变，降低疫苗的有效性[6-7]。因此，研制具有持久免疫效应和广泛交叉免疫反应的通用流感疫苗是亟待解决的科学问题。目前有多种新型流感疫苗处于临床前或临床试验阶段，如病毒载体疫苗、纳米颗粒疫苗和核酸疫苗等，其中mRNA疫苗因具有安全性高、研发周期短和生产成本低等优势备受青睐。
mRNA疫苗是指将编码一种或多种抗原的mRNA递送到细胞中，在细胞质内直接翻译产生相应的抗原，诱导机体产生特异性免疫应答。mRNA疫苗经历长达30年的发展历程，与灭活疫苗相比，mRNA疫苗可以通过无细胞的生产方式进行，生产进程更快[8]。研究表明，相比病毒载体疫苗或DNA疫苗，mRNA疫苗不会整合到宿主的基因组中[9]。从原理上来讲，mRNA疫苗可以在体内快速表达所编码的抗原，迅速引起机体的免疫应答。但单链mRNA不稳定、体内递送效率低下等因素限制着mRNA疫苗的研究进展。但通过优化mRNA序列、开发更加有效的递送载体、控制外源mRNA的炎症反应等方法，mRNA疫苗的翻译和递送效率稳定提升。
本研究拟制备表达HA、NP、3M2e的流感mRNA疫苗，并在动物模型Balb/c小鼠上进行全面评价，为候选通用流感mRNA疫苗的设计和免疫策略的制定提供实验和理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料质粒小提试剂盒QIAprep® Spin Miniprep Ki购自德国QIAGEN公司；限制性核酸内切酶EcoR1及DNA纯化试剂盒Product Monarch® PCR & DNA Cleanup Kit (5 μg)购自美国NEB公司；体外转录试剂盒T7 High Yield RNA Transcription Kit (N1-Me-Pseudo UTP)和mRNA纯化试剂盒VAHTS RNA Clean Beads购自南京诺维赞生物科技有限公司；加帽试剂盒Vaccinia Capping Enzyme、mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase及加尾试剂盒E.coli Poly(A) Polymerase购自苏州近岸蛋白质科技股份有限公司；脂质体购自艾伟拓(上海)医药科技有限公司；HA、NP、M2e抗体购自美国GeneTex公司；流式抗体(CD45、CD3、CD4、CD8和IFNγ)购自美国BioLegend公司。
1.2 细胞系及病毒293T、犬肾(Madin-Darby canine kidney，MDCK)细胞系购自美国细胞培养物收藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)细胞库；流感H1N1亚型病毒株(A/Beijing/501/2009)由解放军总医院第一医学中心肝胆胰外科医学部实验室分离并鉴定，-80 ℃保存备用。
1.3 mRNA制备选用A/California/04/2009流感病毒株为研究对象，将该毒株的HA、NP及3个串联的M2e(3M2e)作为流感mRNA疫苗的抗原序列。将HA (A/California/04/2009)、NP (A/California/04/2009) 和3个串联的M2e构建在表达质粒(pcDNA3.1)上[由生工生物工程(上海)股份有限公司合成]。用限制性内切酶EcoRⅠ将质粒线性化作为体外转录模板。线性化的DNA模板通过体外转录、酶学加帽、酶促加尾和纯化，获得高纯度的mRNA；将阳离子脂质体、辅助型脂质、胆固醇和聚乙二醇化磷脂以摩尔比50 ∶38.5 ∶10.5 ∶1溶于无水乙醇，mRNA按一定比例用柠檬酸钠溶液稀释，3种mRNA溶液与脂质体按3 ∶1体积通过微流控设备包封，测定粒径和电位。
1.4 细胞爬片将14 mm玻片(NEST 801010)置于24孔板中，以每孔1×105个细胞的密度接种293T细胞，24 h后将合成的HA-mRNA、NP-mRNA和3M2e-mRNA通过lip3000(赛默飞)转染293T细胞，24 h后进行免疫荧光鉴定表达。
1.5 免疫荧光弃去细胞培养基，用PBS清洗，再加入4%多聚甲醛固定20 min，接着加入0.5% Triton X-10通透20 min，再用5% BSA封闭30 min。4 ℃过夜孵育HA、NP和M2e一抗(美国GeneTex公司，1 ∶50)。次日用PBST清洗玻片，孵育二抗1 h。PBST清洗玻片，用镊子小心地取出玻片，并将玻片置于含有DAPI抗荧光率灭封片液(北京华兴博创基因技术有限公司, HXJ3109)的载玻片上。在正置荧光显微镜下拍照。
1.6 实验动物28只6周龄雌性Balb/c小鼠(体质量为18~22 g)，从北京斯贝福实验动物技术有限公司订购(动物合格证号：110324220103903064)。动物在中国人民解放军总医院第五医学中心SPF级动物房中饲养。动物房昼夜12 h光暗交替，相对湿度40%~70%，环境温度设定为20~25 ℃，食水自由摄取。
1.7 动物免疫将mRNA-HA、mRNA-NP及mRNA-3M2e共3种LNP-mRNA等比例混合，命名为Comb-mRNA。小鼠按简单随机分组法分为LNP(n=14)和Comb-mRNA(n=14)2组，分别肌肉注射接种LNP和Comb-mRNA，Comb-mRNA组每只小鼠注射4.5 μg mRNA，LNP组每只小鼠注射等体积LNP。第0、28天免疫2次，初次免疫第-1、27天及加强免疫第13天经小鼠内眦静脉采血，分离血清-80 ℃保存备用。
1.7.1 血凝抑制(hemagglutination inhibition，HI)血清与受体破坏酶以1 ∶4比例混合，37 ℃水浴18 h，通过56 ℃水浴30 min将受体破坏酶灭活。用PBS于96孔V型板2倍稀释(1 ∶10~1 ∶1 280，每孔25 μL)，每孔加入25 μL的4个血凝单位的H1N1病毒静置30 min，每孔再加入50 μL的鸡红细胞孵育30 min，以完全血凝抑制的最高稀释度为血凝抑制抗体滴度，并计算几何平均滴度(geometric mean titer，GMT)。
1.7.2 微量中和(microneutralization，MN)接种MDCK细胞于96孔板中，培养24 h，同时用受体破坏酶处理血清并灭活。将血清在孔板中用DMEM培养基2倍稀释(1 ∶10~1 ∶1 280，每孔100 μL)，每孔加入100 μL经胰酶(trypsin，TPCK)处理的100 TCID50/100 μL病毒，37 ℃孵育1 h。加至贴壁单层MDCK细胞中，继续孵育3 d，观察细胞病变情况，于第3天通过血凝实验判定血清中和抗体滴度并计算GMT。
1.7.3 流式细胞术小鼠接种疫苗后第12天，将脾脏研磨并裂解红细胞，分离脾淋巴细胞，加入刺激剂(1 μL/1×106个细胞)孵育4 h，再加入CD45、CD3、CD4和CD8抗体(5 μL/1×106个细胞)4 ℃孵育30 min，加入固定液(fixation buffer)固定细胞，再加入IFNγ抗体室温孵育30 min，PBS清洗并重悬细胞上机检测。
1.7.4 攻毒保护性评价LNP组和Comb-mRNA组小鼠于加强免疫后第14天，经滴鼻给予5LD50流感H1N1亚型活病毒攻击，每天测量小鼠体质量并观察小鼠生存期，观察时间为2周。于病毒攻击后第4天检测小鼠肺病毒载量。
1.8 统计学分析所有实验至少重复3次，数据均服从正态分布，以x±s表示，2组间比较采用独立样本t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 流感mRNA疫苗抗原制备及表达能力鉴定将HA、NP、3M2e序列构建在pcDNA3.1载体上(图 1)，提取质粒。再将质粒通过限制性内切酶线性化成为体外转录模板。利用修饰的核苷酸及模板合成HA、NP、3M2e序列的mRNA，并加帽加尾，通过琼脂糖凝胶电泳对mRNA-HA、mRNA-NP、mRNA-3M2e进行鉴定(图 2)，mRNA-HA分布于1 800 bp，mRNA-NP分布于1 000 bp, mRNA-3M2e分布于500 bp。将合成的mRNA通过lip3000转染至293T细胞，通过免疫荧光实验验证mRNA-HA、mRNA-NP、mRNA-3M2e可在细胞中翻译表达对应的蛋白质(图 3)。
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| 图 1 流感mRNA疫苗抗原序列构建示意图 |
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| 图 2 琼脂糖凝胶电泳检测mRNA-HA、mRNA-NP、mRNA-3M2e基因片段 |
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| 图 3 免疫荧光检测mRNA-HA、mRNA-NP、mRNA-3M2e的蛋白表达 |
2.2 流感mRNA疫苗剂型确定
经测定所有mRNA的包封率大于95%，平均粒径大小为(119.53±6.5)nm，电位为(-8.23±1.3) mV(图 4)。
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| A：LNP-mRNA粒径分布；B：LNP-mRNA电位分布 图 4 LNP-mRNA粒径及电位分布 |
2.3 流感mRNA疫苗可激发小鼠体液免疫反应
为检测中和抗体水平，测定A/Beijing/501/2009毒株的HI和MN滴度(图 5)。结果显示，初次免疫第27天血抑效价GMT值为89.8，加强免疫后第14天血抑效价GMT值为179.6；而微量中和滴度GMT分别为100.8和201.6。
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a：P＜0.01，与第27天LNP组比较；b：P＜0.01，与第42天LNP组比较 A：LNP和Comb-mRNA组血凝抑制效价比较；B：LNP和Comb-mRNA组微量中和滴度比较 图 5 流感mRNA疫苗激发小鼠体液免疫反应(n=6, x±s) |
2.4 流感mRNA疫苗可激发小鼠细胞免疫反应
为了评价mRNA疫苗诱导的细胞免疫反应，检测了CD4+和CD8+T细胞应答。结果发现，Comb-mRNA疫苗可诱导CD4+T细胞比例达11.4% (图 6A)，IFNγ+CD8+T细胞比例达13.24%，与LNP组比较，差异具有统计学意义(P < 0.01，图 6B)。
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a：P＜0.001，与LNP组比较 A: LNP和Comb-mRNA组CD4+ IFNγ+T细胞比例；B：LNP和Comb-mRNA组CD8+IFNγ+T细胞比例 图 6 流感mRNA疫苗激发小鼠细胞免疫反应(n=5, x±s) |
2.5 流感mRNA疫苗可有效保护小鼠免受流感病毒的攻击
通过用H1N1流感病毒感染Balb/c小鼠的方法，评价mRNA疫苗的保护效力。LNP组小鼠在第8天存活率为66.7%，第9天存活率为16.7%，第10天存活率为0。而Comb-mRNA组存活率100%，2组相比差异具有统计学意义(P＜0.001，图 7A、B)。同样的，与LNP组比较，Comb-mRNA组小鼠肺组织第4天病毒载量明显下降(P＜0.001，图 7C)。
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a：P＜0.001，与LNP组比较 A：LNP和Comb-mRNA组小鼠感染H1N1后体质量变化(n=6, x±s)；B: LNP和Comb-mRNA组小鼠感染H1N1后存活率(n=6, x±s)；C: LNP和Comb-mRNA组小鼠感染H1N1后第4天肺病毒载量(n=3, x±s) 图 7 流感病毒攻击后小鼠体质量变化及存活率 |
3 讨论
mRNA疫苗具有安全性高、研发周期短、抗原序列快速优化等优势，因此mRNA疫苗已成为传染病疫苗领域的研究热点。目前新型冠状病毒、人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒等mRNA疫苗均取得良好的临床前研究进展。但季节性流感疫苗主要根据HA头部特异性结构域设计，而HA头部结构域易突变，导致季节性流感疫苗保护效力有限。因此，研究通用mRNA流感疫苗是十分必要的。
流感病毒HA是介导病毒入侵宿主细胞的关键蛋白，也是流感病毒中和抗体的主要靶点。HA包含HA1和HA2两个亚单位，以三聚体突刺形式分布于病毒囊膜表面。HA三聚体从结构上可分为头部和茎部两部分, 头部突变位点较多，茎部相对保守[10]，根据HA头部不同的突变位点将流感病毒分为18种亚型。目前mRNA流感疫苗临床试验集中在季节性流感疫苗，难以应对新突发流感大流行，因此通用流感疫苗仍然是目前研究的主流趋势。通用流感mRNA疫苗最关键的是其编码的抗原在所有亚型的流感病毒中广泛存在。最新研究发现，用mRNA编码了20种HA抗原全长序列，针对性诱导每种抗原的特异性免疫反应，使小鼠和雪貂免受流感病毒的致命攻击[11]。但目前更多的研究是通过mRNA编码流感病毒的保守抗原[12-13]，诱导交叉免疫反应，以获得更全面的保护。
本研究旨在构建通用流感mRNA疫苗，通过选用HA全长序列作为流感疫苗抗原，增强疫苗的免疫原性；选择在不同毒株高度保守的NP及M2e蛋白作为流感疫苗抗原，增加流感疫苗的通用性。FREYN等[14]研究发现，只接种流感病毒基质蛋白2(matrix protein，M2)的保护效力有限，且M2e是M2的胞外区，序列较短，因此本研究将M2e重复3次，通过linker串联，以达到加强疫苗免疫原性的目的。再将mRNA-HA、mRNA-NP和mRNA-3M2e混合成Comb-mRNA去免疫小鼠，以全面评价其免疫原性及免疫保护效果。
既往研究发现，接种名为Cal09 HA-mRNA的流感疫苗，HI的GMT为160，且可提供对致死剂量野生毒株攻击的保护[15]；给小鼠接种10 μg A/Cal09 HA mRNA-LNP，HI的GMT可达320。VAN等[13]研究发现，小鼠免疫NP+M1+PB1mRNA疫苗，诱导IFNγ+ CD4+T细胞比例达10%，IFNγ+CD8+T细胞比例为20%。与前期研究报道类似，本研究Comb-mRNA组的小鼠均能产生中和抗体，最高可达320，与LNP组相比差异具有统计学意义。进一步攻毒实验发现，LNP组小鼠在5LD50的毒株攻击后陆续死亡，病毒感染后第4天肺组织病毒载量较高。Comb-mRNA组的小鼠感染H1N1病毒后体质量变化不明显，表明疫苗具有良好的免疫保护效果。本课题组将在下一步用不同亚型的流感病毒感染小鼠，全面评价其交叉免疫保护效果，并在雪貂等敏感动物模型进一步验证其有效性及交叉保护性。
综上所述，本研究制备了包含HA、NP和3M2e的流感通用mRNA疫苗候选株，能够激发机体产生较强的体液和细胞免疫反应，可保护小鼠抵抗致死剂量的野生型流感病毒攻击，有望成为极具潜力和发展前景的流感通用疫苗候选株。
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