2. 400037 重庆，陆军军医大学(第三军医大学)第二附属医院肿瘤科;
3. 610064 成都，四川大学生命科学学院生长代谢衰老研究中心;
4. 201318 上海，上海仁东医学检验所有限公司;
5. 400037 重庆，肿瘤免疫治疗重庆市重点实验室
2. Department of Oncology, Second Affiliated Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400037;
3. Center of Growth, Metabolism and Aging, College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu, Sichuan Province, 610064;
4. Glorious Med Clinical Laboratory Co., Ltd, Shanghai, 201318;
5. Chongqing Key Laboratory of Immunotherapy, Chongqing, 400037, China
黑色素瘤是一种侵袭性和致命性的皮肤癌[1]。尽管黑色素瘤具有较高的免疫原性，但由于多种免疫逃逸机制导致其易扩散和转移[1]。利用免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor，ICI)靶向如程序性细胞死亡-1(programmed death 1，PD-1)及其配体(programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4)等来诱导抗肿瘤免疫反应，为黑色素瘤提供了有效的治疗方法；然而，即使是联合治疗，多数黑色素瘤患者对ICI仍然反应不佳[1-2]。因此，亟需新的疗效预测生物标志物来指导黑色素瘤的免疫治疗。
蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是一个多基因家族，包括常规(c)PKCs[PKCα (PRKCA)、PKCβⅠ (PRKCB)、PKCβⅡ (PRKCSH)和PKCγ (PRKCG)]、新型(n) PKCs[PKCδ (PRKCD), PKCε (PRKCE)、PKCθ (PRKCQ)、PKCη (PRKCH)和PKCμ(PRKCP)]以及典型(a) PKCs[PKCι (PRKCI)和PKCζ (PRKCZ)][3-4]。PRKCH是新型(n)PKCs家族的独特成员，与多种癌症的发生和进展有关[5]。然而，PRKCH在不同肿瘤类型中显示出不同的预后[6-10]。有研究揭示PRKCH在T细胞稳态维持和活化中发挥重要作用[11]。但是，PRKCH的表达是否影响CD8+T细胞抗肿瘤免疫功能，以及PRKCH的表达能否预测黑色素瘤免疫治疗效果有待进一步研究。
本研究分析黑色素瘤免疫治疗队列以及肿瘤基因组图谱(TCGA)数据中PRKCH在黑色素瘤中的表达及其与总生存期(overall survival，OS)的相关性，采用单细胞RNA测序(single-cell RNA-sequencing，scRNA-seq)数据分析PRKCH的细胞表达群体，通过体外实验和动物模型观察PRKCH的表达对CD8+T细胞功能及肿瘤生长的影响，探讨PRKCH诱导抗肿瘤免疫应答的机制。
1 材料与方法 1.1 公共数据收集收集4个黑色素瘤ICI治疗队列(Van Allen队列[12]：n=41；Riaz队列[13]：n=51；Gide队列[14]：n=73；Liu队列[15]：n=121)的RNA-seq数据和临床数据。皮肤黑色素瘤(skin cutaneous melanoma，SKCM)的RNA-seq数据从TCGA下载。正常皮肤的RNA-seq数据从GTEx数据库收集。PRKCH的免疫组织化学染色图像从HPA数据库下载。黑色素瘤的scRNA-seq数据从TISCH2数据库中收集[16]。CD8+T细胞亚群PRKCH的表达数据集来自公开发表文献[17-19]。STRING网站用于分析蛋白质相互作用网络。
1.2 生存分析基于Kaplan-Meier生存分析，将队列分为PRKCH高、低表达组(最佳截断值由“surv_cutpoint”算法确定)来分析PRKCH表达与SKCM患者生存预后的关系。单因素Cox分析计算PRKCH风险比。ROC曲线评估PRKCH预测TCGA中SKCM患者OS的准确性，根据生成曲线的曲线下面积(Aera Under Curve, AUC)评价预测价值，AUC＜0.5则无预测价值，AUC＞0.5为有预测价值，且该值越大，预测价值越高。
1.3 基因富集分析采用基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)ICI队列和TCGA数据集中黑色素瘤免疫相关基因的富集情况(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp)。JAK-STAT信号通路、MAPK信号通路、T细胞受体信号通路和TNF信号通路从KEGG(https://www.genome.jp/kegg/)数据库下载。T细胞增殖和免疫记忆过程的基因集是从GO(http://geneontology.org/)中获得。
1.4 细胞株和主要试剂小鼠黑色素瘤细胞B16来源于ATCC(CRL-6475)。HEK293T细胞由陆军军医大学第一附属医院刘新东教授课题组馈赠。DMEM高糖培养基购于赛默飞世尔科技公司。CD3和CD28抗体购于Bioxcell公司。细胞因子IL-2购于PeproTech公司。CD8+T细胞分选试剂盒购于Miltenyi Biotec公司。CFSE染料、抗小鼠IFN-γ抗体、抗小鼠Granzyme B抗体购于Biolegend公司。
1.5 质粒构建和病毒包装逆转录过表达质粒pRVKM和pCL-Eco来自陆军军医大学第一附属医院刘新东教授课题组馈赠，逆转录shRNA质粒载体pMKO.1 GFP购于Addgene公司。小鼠PRKCH-CDS(擎科生物公司)构建到pRVKM上。小鼠shRNA序列(擎科生物公司)构建到pMKO.1GFP上(shRNA序列分别为nc：5′-CCGGGCGAAG-ACGAGTCCATCAAGTCTCGAGACTTGATGGACTCGTT-TCGCTTTTTT-3′；shRNA1：5′-CCGGGGATGCCAAGA-TTGCAGAACACTCGAGTGTTCTGCAATCTTGCATCCT-TTTTT-3′；shRNA2：5′-CCGGGCAGATTCGGCATCGAC-AACTCTCGAGAGTTGTCGATGCCGAATCTGCTTTTTT-3′；shRNA3：5′-CCGGGGTTCTCCGAACGTGTCACGTCTCG-AGACGTGACACGTTCGGAGAACCTTTTTT-3′)。pRVKM-PRKCH和pMKO.1-shRNA质粒分别与pCL-Eco共转染HEK293T细胞，48 h后收集上清获取逆转录病毒。
1.6 实验动物野生型C57BL/6小鼠购自北京华阜康公司，6~8周龄，雌性，体质量20 g。OT-1 C57BL/6小鼠购自赛业生物公司，6~8周龄，雌性，体质量20 g。
1.7 T细胞感染和qPCR运用PBS稀释CD3和CD28抗体，1 μg/mL包被培养板，4 ℃ 12~24 h；运用CD8分选试剂盒分选野生型C57BL/6小鼠脾脏CD8阳性T细胞，并进行CFSE染色，添加20 ng/mL的IL-2，种于预包被CD3、CD28的培养板中。24 h后，将获得的过表达或敲减逆转录病毒小心滴于培养体系中，离心机温度调整至32 ℃，900×g离心90 min，培养箱放置2 h后，小心弃掉上层培养基，补充含IL-2的新鲜培养基，48 h后流式细胞术检测CFSE、IFN-γ、Granzyme B表达，采用FlowJo V10软件处理数据；qPCR检测PRKCH过表达和敲减效率(m-Actb上游：5′-GCACCACACCTTCTACAATG-AG-3′，下游：5′-GTACGACCAGAGGCATACAG-3′；m-PRKCH上游：5′-CATCTGGGGAGTATTTGGGAAAC-3′，下游：5′-GCAAGTGCAGGCTGTAACAAT-3′)。
1.8 细胞分选和小鼠黑色素瘤模型按照CD8+T细胞分选试剂盒说明书步骤，从OT-1 C57BL/6小鼠脾脏中分选出OT-1 CD8+T细胞(特异性识别OVA肽的CD8+T细胞)。在野生型C57BL/6小鼠右侧背部接种1×106 B16-OVA细胞，肿瘤接种第10天尾静脉分别回输2×106 OT-1 CD8+T细胞和PRKCH过表达的OT-1 CD8+T细胞，对照组回输200 μL PBS，每组6~8只。每3天测量1次肿瘤长径和短径，记录并计算肿瘤体积(体积=长径×短径×短径×0.5)。
1.9 统计学分析用GraphPrism8.0软件进行统计数据分析，计量资料以x±s表示，两组比较采用非配对t检验，相关性采用Spearman相关性分析，根据相关系数(r)确定是否有相关关系，|r|＜0.2为无相关性，0.2≤|r|＜0.4为弱相关，0.4≤|r|＜0.6为中等相关，r≥0.6为强相关。P < 0.05认为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 ICI黑色素瘤队列中PRKCH表达与OS呈正相关为探讨PKC家族(11个基因) 在黑色素瘤ICI治疗中的潜在作用，分析接受抗CTLA-4或/和抗PD-L1的黑色素瘤患者的转录组数据和临床数据(Van Allen和Riaz队列，图 1)。对PKC家族中10个基因的OS分析(PRKCP在上述队列中未检测到)发现只有PRKCH与上述2个队列的OS均呈正相关(P < 0.05，图 1)。Van Allen队列：39.5 vs 9.0个月(P=0.004，图 2A)。Riaz队列：23.6 vs 12.2个月(P=0.015，图 2A)。将Van Allen和Riaz队列合并后，发现PRKCH高表达的患者OS更长(23.9 vs 9.0个月，P=0.001，图 2A)。此外，Van Allen队列[HR(95% CI)=0.33(0.15~0.73)]、Riaz队列[HR(95%CI)=0.38 (0.17~0.85)]和合并队列[HR(95% CI)=0.41(0.18~ 0.83)，图 2A]中，PRKCH高表达显著降低了风险比(hazard ratio，HR)。另外，评估PRKCH表达与ICI治疗的响应率，虽然差异无统计学意义，但PRKCH高表达的患者的响应率高于PRKCH低表达的患者(Van Allen：36.4% vs 31.6%，P=0.747；Riaz：52.3% vs 42.9%，P=0.641，图 2B)。以上数据表明，PRKCH高表达预示着接受ICI治疗的黑色素瘤患者具有更好的预后。
为扩大黑色素瘤样本来研究PRKCH的预测作用，纳入另外2个ICI治疗队列：Gide (anti-PD-1单药或者联合anti-CTLA-4)和Liu (anti-PD-1)。结果显示高PRKCH显著延长了Gide (未达到vs 22个月，P=0.002，图 2C)、Liu(未达到vs 17.4个月，P=0.008，图 2C)和合并队列(29.0 vs 3.8个月，P=0.001，图 2C)中黑色素瘤患者的OS。此外，PRKCH的高表达降低Gide [HR(95%CI)=0.30(0.14~0.78)]、Liu [HR (95%CI) =0.42(0.22~0.81)] 和合并队列[HR(95%CI)=0.35(0.21~0.75)，图 2C]的HR。并且PRKCH表达高的患者响应率较高(Gide：75.6% vs 62.5%，P=0.226；Liu：75.8% vs 44.2%，P=0.002，图 2D)。因此，综合以上队列分析数据，PRKCH可能是ICI治疗黑色素瘤的OS预测生物标志物。
2.2 TCGA和scRNA-seq分析PRKCH的表达分别在TCGA和GTEx数据库收集人的SKCM样本和正常样本数据并进行分析。发现PRKCH在肿瘤组织中的表达(471个样本)显著低于正常组织(812个样本)(P < 0.001，图 3A)。此外，HPA数据集中免疫组织化学染色图片显示PRKCH蛋白在黑色素瘤中高表达(图 3B)。同样地，SKCM中PRKCH高表达患者具有更长的OS (164.3 vs 67.6个月，P=0.009，图 3C)。ROC曲线分析结果显示曲线下面积(AUC)为0.684 (图 3D)。进一步从TISCH2下载3个黑色素瘤scRNA-seq数据集。其中，GSE72056是全肿瘤组织测序数据，分析发现PRKCH主要表达在T、NK、内皮细胞，很少表达在肿瘤细胞(图 3E)。另外，GSE123139数据集也提示PRKCH主要表达在CD8 Tex、CD4 Tconv和T prolif细胞(图 3F)。进一步利用免疫细胞数据集GSE120575发现PRKCH可以表达在CD4 Tn、CD8 Tcm、CD8 Tem、CD8 Tex、NK、Tfh、Th1、Tprolif和Treg细胞(图 3G)。将以上数据集中的T细胞单独进行分析发现PRKCH广泛表达于CD8+T细胞的各个亚群(图 3H)。结果表明T细胞是PRKCH的重要表达群体。
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| A: PRKCH在SKCM(TCGA)与正常组织(GTEX)中的基因表达；B: PRKCH蛋白在SKCM(HPA)中的免疫组化染色图片；C: Kaplan-Meier法计算TCGA中SKCM高PRKCH组和低PRKCH组的OS曲线图；D: ROC曲线评估PRKCH预测SKCM患者OS的准确性。E~G: TISCH2分析PRKCH在黑色素瘤scRNA-seq数据集中不同细胞群体的表达。H：PRKCH在CD8+T细胞scRNA-seq数据集中各个细胞亚群的表达 图 3 TCGA和scRNA分析PRKCH的表达 |
2.3 PRKCH的表达与CD8+T细胞的活化和细胞毒性相关
首先在整个肿瘤组织水平，GSEA分析揭示CD8+T细胞活化、干扰素反应、干扰素相关基因集均显著富集在PRKCH高表达的前述黑色素瘤患者中(图 4A)。另外，基因相关性分析发现，CD8a、GZMB、IFNG、PRF1在ICI队列和SKCM中均与PRKCH的表达呈显著正相关(图 4B~F)。说明PRKCH高表达患者ICI疗效更好的原因可能是促进CD8+T细胞的活化和细胞毒性。进一步利用STRING数据库中的PPI和GSEA分析研究PRKCH高表达与CD8+T细胞活化和细胞毒性相关可能的机制。发现HRAS/MAPK与PRKCH之间存在很强的相互作用(图 5A)。将这些靶基因放入GO数据库中，发现这些靶基因参与信号通路包括T细胞受体、JAK-STAT、MAPK和TNF信号通路(表 1)，且这些调控T细胞活化、增殖和细胞毒性的信号通路在PRKCH高表达的SKCM患者中显著富集(JAK-STAT：NES=2.57，P < 0.001，图 5B；MAPK：NES=2.10，P < 0.001，图 5C；T细胞受体：NES=2.34，P < 0.001，图 5D；TNF：NES=2.39，P < 0.001，图 5E)。同时，本研究发现T细胞增殖(NES=2.55，P < 0.001，图 5F) 和免疫记忆过程基因集(NES=2.13，P < 0.001，图 5G) 在SKCM的PRKCH高表达组中显著富集。最后，在T细胞水平，ICI治疗的黑色素瘤队列(GSE120575)的scRNA-seq数据中，响应者PRKCH在细胞毒性T细胞中略高于无响应者(P=0.084，图 5H)，在记忆性T细胞中显著升高(P=0.0043，图 5I)。总之，PRKCH可能诱导更多的细胞毒性和记忆性T细胞促进抗肿瘤免疫。
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| A: CD8+T细胞活化(Activated CD8+T Cell)、干扰素反应(Hallmark Interferon Gamma Response)、干扰素相关基因集(IFN-γ Immune Related Signature)在ICI治疗队列和SKCM中的基因富集分析；B~F: PRKCH与CD8A、GZMB、IFNG和PRF1在ICI治疗队列和SKCM中的相关性分析 图 4 PRKCH的表达与CD8+T细胞的活化和细胞毒性相关 |
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| A: STRING数据集中PRKCH的蛋白质相互作用网络；B~G: JAK-STAT，MAPK，T细胞受体(T cell receptor)和TNF信号通路以及T细胞增殖(T cell proliferation)和免疫记忆过程(Immunological memory process)基因集在SKCM中的基因富集分析；H、I: ICI治疗的响应者和无响应者之间的细胞毒性T细胞和记忆性T细胞中PRKCH的表达(GSE120575) 图 5 PRKCH可能诱导细胞毒性和记忆性T细胞促进抗肿瘤免疫 |
| 相关基因 | 信号通路 |
| HRAS | T cell receptor signaling pathway |
| JAK-STAT signaling pathway | |
| MAPK signaling pathway | |
| MAPK | TNF signaling pathway |
| MAPK signaling pathway |
2.4 PRKCH过表达增强CD8+T细胞抑制肿瘤能力
基于上述生物信息学分析，开展体外实验和小鼠黑色素瘤模型验证PRKCH的表达与CD8+T细胞功能和抗瘤能力。首先利用逆转录病毒在CD8+T细胞上过表达PRKCH(图 6A)，CD8+T细胞的增殖、IFN-γ、Granzyme B增加(图 6B~D)，而利用shRNA减少PRKCH的表达同样也减少了CD8+T细胞的增殖、IFN-γ、Granzyme B(图 6E~H)。进一步利用OT-1 CD8+T细胞特异性杀伤B16-OVA体内模型，发现过表达PRKCH的OT-1 CD8+T细胞比对照OT-1 CD8+T细胞具备更强的抗瘤能力(图 5I)。综上，PRKCH的表达有助于CD8+T细胞发挥更好的抑制肿瘤进展能力。
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| A：对照与PRKCH过表达的CD8+T细胞的mRNA表达水平；B~D：流式细胞术检测对照与PRKCH过表达的CD8+T细胞的增殖及活性；E：对照与PRKCH敲减的CD8+T细胞的mRNA表达水平；F-H：流式细胞术检测对照与PRKCH敲减CD8+T细胞的增殖及活性；I：OT-1 CD8+T细胞特异性杀伤B16-OVA体内模型(n=6~8, x±s)，P值为B16-OVA接种后第25天数据进行统计分析获得 图 6 PRKCH过表达增强CD8+T细胞抑制肿瘤能力 |
3 讨论
当前，包括CAR-T和ICI在内的免疫治疗在肿瘤治疗中取得突破性进展，但由于瘤种的差异及肿瘤诱导的免疫抑制环境等因素，依然有多数患者不能从中获益。黑色素瘤具有较高的免疫原性，是较早开展ICI治疗的瘤种且已取得一定的疗效，但是即使是联合其他治疗方式，仍然有大约一半的患者无法实现长期获益[1]。现有的肿瘤标志物如肿瘤PD-L1表达和肿瘤突变负荷等与ICI的响应率有关[20]，但这些生物标志物也只能满足约半数患者的需求，因此，需要新的生物标志物来预测ICI的疗效。通过收集和分析ICI治疗的转录组和临床数据，本研究发现高表达PRKCH可显著延长接受ICI治疗的黑色素瘤患者的OS，且与PRKCH诱导更多的细胞毒性和记忆性T细胞相关；另外，增强PRKCH的表达能提升CD8+T细胞抑制小鼠黑色素瘤的能力。
多项研究表明PRKCH在多种肿瘤中表达[6-10]。其中，免疫细胞也被证实表达PRKCH，且在不同的免疫细胞中，PRKCH扮演不同的角色[11, 21]。本研究集中在黑色素瘤中，通过ICI队列的全组织转录组数据筛选PKC家族得到具有ICI疗效预测价值的靶分子PRKCH，进一步通过scRNA-seq数据分析发现T细胞是PRKCH表达的重要细胞。因此，本研究区别于以往的研究肿瘤细胞，而更关注PRKCH在CD8+T细胞中的功能以及对肿瘤进展的影响。通过体外实验的过表达和敲减，揭示PRKCH的表达影响CD8+T细胞的增殖和IFN-γ、Granzyme B表达，并通过肿瘤模型验证PRKCH过表达CD8+T细胞增强抗瘤能力。但是本研究的缺陷是没有运用CD8+T细胞条件性敲除PRKCH的小鼠模型来观察肿瘤进展情况，以及该小鼠的CD8+T细胞功能分析，这是后续深入研究需要重点关注的。另外，本研究局限在黑色素瘤，本研究所发现的现象是否在其他肿瘤亦存在需要进一步研究验证。
既往研究发现PRKCH可以影响肿瘤细胞的增殖。本研究中，PRKCH同样影响CD8+T细胞的增殖。尽管本研究进行了蛋白相互作用和信号通路富集分析，发现PRKCH与HRAS和MAPK通路所介导的T细胞增殖、活化以及记忆等显著相关，但是PRKCH诱导CD8+T细胞增殖以及IFN-γ、Granzyme B表达的具体分子机制还需进一步在体外进行相关信号通路的验证。
综上所述，本研究通过分析整个肿瘤组织的转录组数据和临床数据，发现高表达PRKCH的黑色素瘤患者具有更好的预后。利用scRNA-seq数据、PPI和GSEA分析、体外实验和动物模型，提示PRKCH可以增强CD8+T细胞抗肿瘤免疫功能。因此，本研究初步发现PRKCH增强CD8+T细胞的抗瘤功能并可以用于预测黑色素瘤免疫治疗效果。
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