2. 400038 重庆，陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院肾病内科
2. Department of Nephrology, First Affiliated Hospital, Army Medical University(Third Military Medical University), Chongqing, 400038, China
急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是由多种直接或间接致病因素(如感染、创伤、烧伤和输血等)引发的以炎症细胞浸润、肺毛细血管内皮细胞-肺泡上皮细胞屏障受损和肺毛细血管通透性增加为主要病理特征的临床综合征，临床表现为顽固性的低氧血症和进行性的呼吸窘迫[1]。ALI是临床上脓毒症患者常见的并发症，发生率为68.2 %, 即使随着机械通气模式的改进、广谱抗生素和体外膜肺的应用, 合并ALI的脓毒症患者90 d的病死率仍高达35.5 %，而急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是其死亡的重要原因[2-3]。因此，寻找有效的ALI干预措施仍然是目前重症医学亟待解决的问题。甲硫氨酸摄入限制(methionine restriction, MR)是近年来研究较多的饮食限制方案之一，它除了可以延缓衰老、延长寿命以及降低代谢相关性疾病的发生外，还可以显著减轻肾脏缺血再灌注引起的心肌损伤，促进急性结肠炎和急性肾损伤等疾病的恢复 [4-6]。本课题组前期研究发现，MR可降低脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的ALI小鼠死亡率，并可通过胱硫醚-γ裂解酶(cystathionine-gamma-lyase, CSE)/硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)通路减轻LPS引起的肺泡上皮损伤[7]。巨噬细胞在LPS诱导的ALI发生发展中具有至关重要的作用，然而目前尚不清楚MR对LPS诱导的ALI中的巨噬细胞的影响及其作用机制，本研究将观察MR对LPS诱导ALI小鼠模型中肺巨噬细胞的影响，并探索相关调控机制，为ALI的临床治疗提供新思路。
1 材料与方法 1.1 动物模型及分组36只6~8周龄(体质量20~25 g)雄性C57BL/6J小鼠购自湖南SJA实验动物有限公司，饲养于陆军军医大学实验动物中心。建模前先给予小鼠1周的适应时间，饲养环境温度为(23±1) ℃，湿度为(55±10)%，每天暴露于自然光照下12 h，自由摄食饮水。所有实验步骤符合实验动物伦理，并由陆军军医大学实验动物福利伦理委员会批准(AMUWEC20224012)。为避免在模型建立期间因小鼠反流误吸而导致的肺损伤加重或死亡，小鼠在建模前8 h予以禁食禁饮。采用改良的非暴露冷光源气管滴注法构建LPS诱导的小鼠ALI模型[7]。采用随机数字表法将小鼠分为3组，Sham组(n=12)：全程给予正常饮食(甲硫氨酸含量0.86%)，小鼠肺内按照改良的非暴露冷光源气管滴注法注入100 μL生理盐水；LPS组(n=12)：全程给予正常饮食(甲硫氨酸含量0.86%)，采用改良的非暴露冷光源气管滴注法将100 μL的LPS溶液滴入气管内(LPS剂量为15 mg/kg)建立小鼠ALI模型；LPS+MR组(n=12)：建立小鼠ALI模型前7 d给予限制蛋氨酸饮食(甲硫氨酸含量0.43%)持续至取材时间。前期研究发现，建立LPS诱导的ALI小鼠模型的第3天，小鼠肺组织出现典型的炎症细胞浸润和血气屏障通透性增高等特征性病理改变，因此本研究所有小鼠均在建模后第3天取材。
1.2 肺HE染色和肺损伤病理评分给予小鼠LPS后第3天，将小鼠麻醉并经左心室进行PBS溶液灌注，取其右侧肺组织置于4%多聚甲醛固定后，进行石蜡包埋切片和HE染色。每组小鼠样本量为12只，采用CellSens软件对HE染色的肺组织切片进行拍照，并按照本课题组前期的方法进行肺损伤评分，即采用单盲法由1名对切片编号不知情的研究者根据出血、水肿、炎症细胞浸润和肺不张4个方面对肺损伤情况进行病理评分[8]。每1项的分数范围为0(无)~4(非常严重)分，具体如下：无损伤为0分；病变范围＜25%为1分；25%≤病变范围＜50%为2分；50%≤病变范围＜75%为3分；病变范围≥75%为4分。
1.3 免疫组化染色及其表达量分析对巨噬细胞集落刺激因子(macrophage-colony stimulating factor, M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophage-colony stimulating factor, GM-CSF)和C-C基序趋化因子配体3(Chemokine C-C motif ligand 3, CCL3)这3个巨噬细胞趋化因子进行免疫组化染色。其具体步骤如下：首先将肺组织石蜡切片经过65 ℃恒温烤箱中烘烤、二甲苯溶液中浸泡、不同浓度乙醇脱水、蒸馏水清洗后，依次加入抗原修复液、10%山羊血清封闭后，加入一抗置于4 ℃孵育过夜、PBS溶液清洗后、滴加相应HRP标记的二抗，37 ℃恒温孵育60 min、PBS溶液清洗后滴加DAB显色，后滴加中性树胶进行封片。封片后置于室温晾干24 h，显微镜拍照。每个分组选择5张来自不同小鼠的切片，每张切片在40倍物镜下随机选择5个视野拍照，用ImagePro Plus软件统计拍摄图片中蛋白的光密度值。F4/80和CD11b蛋白分析：每张图片随机选择3个肺泡，统计每个肺泡有阳性表达的细胞数量，取平均值。
1.4 小鼠肺组织的RT-qPCR检测提取肺组织总RNA，反转录合成cDNA后，采用RT-qPCR检测肺组织中脂多糖结合蛋白(lipopolysa-ccharide binding protein，LBP)和Toll样受体-4(toll-like receptor 4，TLR4)的mRNA表达水平。基因序列如下：Tlr4上游引物为5′-GCCGTTGGTGTATCTTTG-3′，下游引物为5′-GCTGTTTGCTCAGGATTC-3′；Lbp上游引物为5′-GTGAACCTGTTCCAGGCATT-3′, 下游引物为5′-AGTCGAGGTCGTGGAGCTTA-3′; Gapdh上游引物为5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游引物为5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。实验重复3次。
1.5 小鼠肺组织的Western blot检测将小鼠的肺组织用4 ℃预冷的PBS洗涤3次，然后置于冰上并加入RIPA裂解液进行裂解30 min。4 ℃、12 000 r/min离心10 min后，取上清获得总蛋白，用BCA法进行蛋白定量。接着按1 ∶4比例向总蛋白溶液中加入5×蛋白上样缓冲液，沸水浴中加热变性5 min; 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)进行电泳以分离蛋白条带并转膜，5% 脱脂牛奶室温下封闭2 h后，分别加入一抗LBP(1 ∶1 000)、TLR4(1 ∶500) 和GAPDH(1 ∶1 000)后，4 ℃摇床孵育过夜; 经TBST清洗3次，每次5 min，再用HRP标记的山羊抗兔二抗(1 ∶5 000)室温摇床孵育1 h; 再次TBST清洗3次，每次5 min。最后将膜在暗室中均匀加入混匀的ECL发光液，用凝胶成像仪进行曝光拍照。Image J软件检测蛋白条带的灰度值，以目标蛋白与内参GAPDH的比值作为目标蛋白的相对含量。
1.6 统计学分析实验数据采用GraphPad 8.0软件进行统计分析。正态分布计量资料以x±s表示，若方差齐，采用one-way单因素方差分析检验；若方差不齐，采用Brown-Forsythe和Welch校正的单因素方差分析检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 MR对LPS诱导的ALI小鼠肺组织的病理学变化的影响MR对LPS诱导的ALI小鼠肺组织病理改变如图 1所示，与Sham组小鼠比较，LPS组小鼠的肺组织出现明显的出血、炎症细胞浸润、肺间质和肺泡水肿、肺间隔断裂等表现，肺组织损伤的病理评分显著升高(2.00±0.85 vs 13.50±3.12, P < 0.01)；与LPS组小鼠比较，MR可显著改善LPS组小鼠的肺损伤，出血区域显著减少，炎症细胞浸润减少，肺不张及肺水肿减轻，肺组织病理评分显著降低(13.50±3.12 vs 5.42±1.73, P < 0.01)。
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| 图 1 MR后LPS诱导的ALI小鼠肺组织的HE染色观察 |
2.2 MR对LPS诱导的ALI小鼠肺组织的LBP和TLR4的影响
与Sham组比较，LPS组小鼠的肺组织LBP和TLR4 mRNA表达显著增加，而MR处理可显著降低LPS诱导的ALI小鼠肺组织LBP和TLR4 mRNA表达水平(P < 0.01，图 2)。与Sham组比较，LPS组小鼠的肺组织LBP和TLR4蛋白表达显著增加，而MR处理可显著降低LPS诱导的ALI小鼠肺组织LBP和TLR4蛋白表达水平(P < 0.01，图 3)。
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| a: P < 0.01, 与Sham组比较；b: P < 0.01，与LPS组比较 图 2 MR对LPS诱导的ALI小鼠肺LBP(A)和TLR4(B)的mRNA表达的影响(n=5，x±s) |
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a: P < 0.01, 与Sham组比较；b: P < 0.01，与LPS组比较 A：Western blot检测MR后LPS诱导的ALI小鼠肺LBP和TLR4蛋白的表达；B：MR后LPS诱导的ALI小鼠肺LBP蛋白表达量变化的比较；C：MR后LPS诱导的ALI小鼠肺TLR4蛋白表达量变化的比较 图 3 MR对LPS诱导的ALI小鼠肺LBP和TLR4蛋白表达的影响(n=5，x±s) |
2.3 MR对LPS诱导的ALI小鼠肺组织的巨噬细胞及其相关趋化因子的影响
采用CD11b和F4/80标记巨噬细胞, 图 4A中红色箭头所指处为CD11b或F4/80阳性细胞，与Sham组比较，LPS诱导的ALI小鼠的CD11b(图 4B)和F4/80(图 4C)阳性细胞数显著增加，肺间质和肺泡巨噬细胞浸润明显，而MR处理组ALI小鼠CD11b(图 4B)和F4/80(图 4C)阳性细胞数显著降低，肺间质和肺泡巨噬细胞浸润显著减少。
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a: P < 0.01, 与Sham组比较；b: P < 0.01，与LPS组比较 A：MR对LPS诱导的ALI小鼠肺CD11b和F4/80阳性细胞数量的影响 箭头：示CD11b或F4/80阳性细胞；B：MR后LPS诱导的ALI小鼠肺CD11b阳性细胞数量变化的比较；C：MR后LPS诱导的ALI小鼠肺F4/80阳性数量变化的比较 图 4 MR对LPS诱导的ALI小鼠肺巨噬细胞浸润的影响(n=5，x±s) |
M-CSF是巨噬细胞存活、增殖和分化的主要调节因子, 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF是诱导造血干细胞分化成巨噬细胞或其他相关细胞类型的分泌型细胞因子。图 5A中红色箭头所指处为M-CSF或GM-CSF阳性细胞。与Sham组小鼠比较，LPS诱导的ALI小鼠肺组织M-CSF(图 5B)和GM-CSF(图 5C)阳性细胞明显增多，且主要定位与于肺间质和肺泡内，而MR预处理后肺间质和肺泡M-CSF(图 5B)和GM-CSF (图 5C)的阳性细胞显著减少。CCL3又名巨噬细胞炎性蛋白1-α(Macrophage inflammatory protein 1α，MIP-1α)，是一种重要的趋化因子，能够特异性的趋化单核细胞/巨噬细胞到达受损组织。如图 6所示，与Sham组小鼠比较，LPS诱导的ALI小鼠的肺组织CCL3阳性细胞明显增多(10.29±2.63 vs 41.54±16.41)，主要聚集在肺间质和肺泡中，而MR处理可显著减少肺间质和肺泡CCL3阳性细胞数量(41.54±16.41 vs 28.38±10.42，P < 0.01)。
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a: P < 0.01, 与Sham组比较；b: P < 0.01，与LPS组比较 A：MR对LPS诱导的ALI小鼠肺M-CSF和GM-CSF表达的影响 箭头：示M-CSF或GM-CSF阳性细胞；B：MR后LPS诱导的ALI小鼠肺M-CSF阳性细胞数量变化的比较；C：MR后LPS诱导的ALI小鼠肺GM-CSF阳性数量变化的比较 图 5 MR对LPS诱导的ALI小鼠肺M-CSF和GM-CSF表达的影响(n=5，x±s) |
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| 箭头：示CCL3阳性细胞 图 6 MR对LPS诱导的ALI小鼠肺CCL3表达的影响 |
3 讨论
ALI常见的病因分为感染性和非感染性2大类，其中革兰氏阴性杆菌是引起ALI/ARDS最常见的原因。肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage, AM)作为先天免疫系统中最重要的细胞，参与ALI炎症反应发生发展的全过程[9-11]。有大量研究表明MR可诱导自噬、减少线粒体中活性氧和增加H2S产生，降低氧化应激水平，从而发挥机体保护的作用[12-14]。本研究发现MR可显著抑制LPS诱导的巨噬细胞在肺泡聚集及浸润，减少ALI小鼠肺组织LBP和TLR4表达，并降低巨噬细胞相关趋化因子M-CSF、GM-CSF和CCL3的表达，从而减轻LPS诱导的肺组织损害。
LBP是存在于正常人和动物血清中的一种糖蛋白，主要由肝细胞合成，因其与LPS结合而命名。LBP是诊断脓毒症的标志物，脓毒症时，患者血浆LBP可显著增高[15]。TLR4是目前研究最多的免疫炎性模式识别受体之一，TLR4在进化上高度保守，属于Ⅰ型跨膜蛋白，由富含亮氨酸的胞外N端结构域、跨膜区域和胞内C端结构域构成。胞外N端结构域能够识别LPS而启动炎症反应。LPS进入肺组织后首先被炎症细胞表达的TLR4感知。一方面，TLR4通过识别LPS，通过髓样分化因子(myeloid differentiation factor, MyD88)依赖性途径激活核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)和丝裂原活化蛋白(mitogen-activated protein, MAP) 激酶信号通路的核转位，最终导致诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS) 和多种促炎细胞因子、趋化因子及其受体的快速表达，启动/放大炎症反应；另一方面，LPS在肺损伤的急性渗出期会诱导未分化AM极化为M1型，M1型AM可产生多种炎症因子和趋化因子，招募更多的单核/巨噬细胞和中性粒细胞等炎症细胞到肺组织，使得肺部炎症反应不断放大，加重肺组织的损伤[16-17]。本研究首先发现MR干预后LPS小鼠TLR4和LBP的基因和蛋白表达显著降低，说明MR干预后可减少TLR4、LBP与LPS的结合，从而降低机体对LPS的敏感性，减轻巨噬细胞的激活和浸润。此外，本研究还发现MR干预后LPS小鼠肺巨噬细胞相关趋化因子M-CSF、GM-CSF和CCL3的表达显著下降。M-CSF、GM-CSF和CCL3这些趋化因子在单核/巨噬细胞的募集、浸润和活化过程中发挥至关重要的调控作用[18-22]。M-CSF是巨噬细胞存活、增殖和分化的主要调节因子，启动并增强巨噬细胞释放细胞因子和其他炎症介质，增强巨噬细胞的吞噬作用[18]。GM-CSF在激活免疫反应中起重要作用，主要促进粒细胞、巨噬细胞增殖还能增加TNF、IL-1、IL-6等炎症因子的表达，促进炎症反应[21]。CCL3是巨噬细胞经LPS诱导后在巨噬细胞培养上清液中发现的、相对分子量约为8 kDa的2个肽链组成的细胞因子，在炎症放大的病理生理过程中具有重要的作用[20-22]。本课题组前期研究已报道，MR可以上调LPS诱导的ALI小鼠体内的H2S水平[7]。H2S可促进巨噬细胞极化为M2表型增多，其中M1型巨噬细胞是促炎细胞，而M2型巨噬细胞是抗炎细胞，从而导致巨噬细胞产生的炎症因子和趋化因子减少，进而减少各种炎症细胞的招募和浸润，减轻组织损伤[23-24]。
综上所述，MR可以通过减少LBP和TLR4的表达，抑制LPS诱导的趋化因子M-CSF、GM-CSF和CCL3的表达，抑制巨噬细胞的浸润和活化，进而减轻肺损伤。
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