2. 650032 昆明，云南省神经系统疾病临床医学研究中心
2. Yunnan Provincial Clinical Research Center for Neurological Diseases, Kunming, Yunnan Province, 650032, China
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, 简称金葡菌)是一种重要的机会致病性细菌，约20%~30%正常人群皮肤和鼻咽腔中存在金葡菌定植，增加了宿主发生侵袭性感染的风险[1, 2]。金葡菌可产生多种毒力因子，能够侵袭多个器官系统，引发皮肤感染、肺炎、败血症、深部脓肿，甚至导致中枢神经系统(central nervous sys term，CNS)的致命感染性疾病，如脑膜炎和脑脓肿[3]。最近的一项荟萃分析显示，在脑脊液和脓液培养呈阳性的脑脓肿病例中，金葡菌占比达18%(1, 076/5, 894)[4]。
金葡菌分泌多种溶素(如α-, β-, γ-, δ-毒素等)，通过破坏宿主细胞，增强细菌的侵袭能力[5]。我们前期研究发现金葡菌在脑脓肿致病过程中β-毒素(β-hemolysin)编码基因hlb在小鼠脑脓肿中表达明显上调，为该菌致脑脓肿的关键毒力因子[6]。金葡菌β-毒素是一种可分泌的细胞溶素，通过分解细胞膜上的鞘磷脂，导致宿主细胞死亡[7]。研究表明，hlb基因位于金葡菌基因组上，临床分离金葡菌的hlb基因常常被φSa3噬菌体插入而失活；当噬菌体基因组切离后hlb基因可被激活而发生致病作用[8-9]。因此，金葡菌β-毒素的致病作用常常被低估[10]。为了深入研究β-毒素的功能，本研究中我们通过hlb基因比对的方法，筛选到无φSa3噬菌体插入的NCTC8325-4金葡菌株用于构建敲除hlb基因的菌株(NCTC8325-4Δhlb)，发现敲除株血脑屏障细胞模型通透性增加的能力以及引起小鼠脑膜炎/脑微脓肿的能力均较野生株显著下降。结果表明，β-毒素在金葡菌感染CNS中发挥重要作用，其功能的发挥有利于金葡菌破坏并通过血脑屏障，实现金葡菌中枢神经系统感染。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 菌株、细胞及动物金葡菌MW2、NCTC8323-4和RN4220菌株(陆军军医大学微生物学教研室保存)；大肠埃希菌DH5α感受态细菌购自北京天根生物，大肠埃希菌-金葡菌温敏穿梭质粒pBT2[氨苄青霉素(Ampr)及氯霉素(Cmr)抗性]由中国科学技术大学孙宝林教授惠赠。人脑微血管内皮细胞hCMEC/D3购自重庆巴尔思公司，CD1小鼠购自陆军军医大学实验动物中心。
1.1.2 仪器与试剂PCR仪(美国Bio-Rad)；倒置显微镜(美国Olympus)；多功能酶标仪(美国美谷分子)；10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，DMEM高糖培养基(美国HyClone)；分子量40 kDa的异硫氰酸荧光素-葡聚糖(fluorescein isothiocyanate-dextran 40 kDa，FD40, 美国Sigma)；细菌基因组提取试剂盒(北京天根生物)；溶葡菌素(美国Sigma)；PrimeSTAR© 高保真DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶(美国Thermo Fisher)；2×Taq酶混合液(康为世纪)；高保真DNA聚合酶(大连宝生生物)；PCR产物回收试剂盒、细菌质粒提取试剂盒(美国Promega)；PBS粉(无锡傲锐东源)；琼脂糖(美国Invitrogen)；氨苄青霉素、氯霉素(上海生工)；金葡菌BHI(Brain Heart Infusion)培养基、TSB (Tryptone Soya Broth)培养基，大肠埃希菌LB胰蛋白胨(Tryptone)培养基及酵母提取物(Yeast Extract)(英国Oxoid)；血琼脂平板(重庆庞通)；Transwell©细胞培养小室、聚苯乙烯96孔板(美国Corning)。
1.2 实验方法 1.2.1 金葡菌MW2的Hlb高产菌株筛选自TSB琼脂平板上挑取MW2菌株[为社区相关耐甲氧西林金葡菌(methicillin-susceptible S. aureus，MSSA)代表性菌株)]单菌落，接种于2 mL TSB液体培养基中，37 ℃摇床，200转/min培养过夜。将细菌培养液以三区划线法接种于血琼脂平板上，37 ℃培养箱培养至单菌落可见。肉眼观察，筛选到菌落周围呈现宽大β-溶血环的Hlb高产菌株Hyper-β株[10]。分别挑取野生株与Hyper-β株单菌落，接种于TSB液体培养基，37 ℃摇床，200 r/min培养过夜，三区划线法接种于血琼脂平板后培养观察菌落的溶血现象。
1.2.2 金葡菌MW2菌株及Hyper-β株对hCMEC/D3细胞模拟血脑屏障模型通透性的影响hCMEC/D3细胞系源自癫痫手术切除的人脑组织分离的颞叶微血管，常用于构建血脑屏障细胞模型。采用10% FBS+DMEM高糖培养基在Transwell©细胞培养小室(6孔，孔径为0.4 μm，过滤器直径为24 mm)培养hCMEC/D3细胞模拟血脑屏障模型[11]。在悬挂插入培养膜上接种细胞(5×105个/孔)，细胞培养箱中培养，倒置显微镜下观察见细胞融合。更换新鲜培养基，上室2 mL，下室4 mL。将金葡菌MW2野生株、Hyper-β株(30 MOI)，或NCTC8325-4野生型、NCTC8325-4Δhlb敲除株(30 MOI)分别接种于上室中，PBS为对照，同时将FD40添加到上腔室(工作浓度为250 μg/mL)。作用1 h后，从下室收集培养基样品(28 μL)以完全培养基稀释至400 μL，置入96孔板中，多功能酶标仪检测FD40荧光强度，激发和发射波长分别为490 nm和520 nm。血脑屏障通透性表示为FD40的跨内皮交换百分比(% transendothelial exchange of FD-40, %TEE FD40)。
1.2.3 金葡菌hlb基因无噬菌体插入菌株的筛选构建hlb基因敲除株，有利于进一步研究该基因的功能。然而，金葡菌MW2菌株hlb基因被φSa3噬菌体插入，无法构建hlb基因敲除株。因此，我们通过Pubmed中GenBank功能查找实验室常用NCTC8325、NCTC8325-4、COL、Mu3、MW2、N315、Newman、RN4220、TW20和USA300共10个不同金葡菌株基因组序列，采用CLC Genomics Workbench软件进行hlb基因生物信息学比对，筛选出含有完整hlb基因的菌株。
1.2.4 金葡菌NCTC8325-4菌株的hlb基因敲除株构建及鉴定根据同源重组替换的原理，利用大肠埃希菌-金葡菌温度敏感穿梭质粒pBT2，在金葡菌NCTC8325-4菌株中实施hlb基因的无痕敲除[12]，具体步骤如下所述：①构建同源重组质粒pBT2-Δhlb：查询NCTC8325-4菌株基因组为模板，在hlb基因序列上、下游分别设计左、右臂引物(见表 1)，并在引物上加入适当的限制性内切酶酶切位点。PrimeSTAR高保真DNA聚合酶扩增上述同源臂序列，各扩增约1 000 bp(含限制性酶切位点及保护性碱基)。限制性内切酶分别双酶切左、右臂及pBT2质粒后，PCR产物回收试剂盒回收备用。以T4 DNA连接酶连接左臂片段及pBT2质粒后，化学转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞，涂布LB Ampr琼脂平板(Amp浓度为100 μg/mL)，37 ℃孵箱培养过夜。次日挑取单菌落，提取质粒，经双酶切鉴定片段大小正确。以相同的方法将右臂片段连接入上述含有左臂片段的pBT2质粒中，转化DH5α后提取质粒、酶切筛选出左、右臂正确连接的敲除质粒pBT2-Δhlb。②制备RN4220菌株感受态细胞：将RN4220单菌落，接种于TSB液体培养基，37 ℃，200 r/min培养过夜。再将菌悬液以1 ∶100比例接种至BHI液体培养基，37 ℃，200 r/min培养2 h至OD600≈0.5。菌液冰浴30 min，随后4 ℃，5 000 g×10 min离心，弃去上清培养基。加入0.5M蔗糖溶液(冰浴灭菌)重悬菌体，冰浴10 min。重复上述离心、蔗糖溶液重悬步骤3次。最后，加入1 mL 0.5 M蔗糖溶液重悬全部菌体，即获得RN4220菌株感受态细胞，置于-80 ℃保存。③敲除质粒pBT2-Δhlb电穿孔转化金葡菌RN4220进行限制性修饰：将pBT2-hlb敲除质粒加入RN4220感受态细胞中，电穿孔仪转化条件为电压2.5 KV，电阻200 Ω，电容50 μF。结束后将感受态细胞涂布至含5 μg/mL Cm的BHI琼脂平板上，30 ℃培养至单菌落肉眼可见。挑取单菌落接种于含Cmr的TSB液体培养基质，提取质粒进行PCR及双酶切鉴定正确。④经RN4220限制修饰后的敲除质粒pBT2-Δhlb转化NCTC8325-4菌株：按照步骤③条件，将质粒pBT2-Δhlb电转化至NCTC8325-4菌株感受态细胞，提取质粒，经PCR及双酶切鉴定正确。⑤金葡菌NCTC8325-4-Δhlb敲除株的筛选与鉴定：利用pBT2质粒，42 ℃诱导整合入金葡菌基因组，25 ℃诱导自基因组切离的温度敏感特点，不同温度条件诱导，对NCTC8325-4株hlb基因实施无痕敲除。将含有pBT2-Δhlb敲除质粒的NCTC8325-4菌株接种到含Cmr TSB液体培养基，42 ℃，200 r/min培养16 h，划三线法接种于TSB Cmr琼脂平板。42 ℃培养, 挑取约10个单菌落分别接种到TSB Cmr液体培养基，振荡培养过夜。提取细菌基因组，利用下述两对引物分别进行PCR扩增：hlb基因上游外侧-F及pBT2多克隆区外侧-R，pBT2多克隆区外侧-F及hlb基因下游外侧-R(见表 1)，筛选出发生左臂或右臂重组的单克隆，分别接种到TSB液体培养基，25 ℃，200 r/min培养16 h。划三线法接种于TSB琼脂平板，37 ℃培养后，将单克隆菌液同时接种至TSB Cmr平板和TSB平板上，37 ℃培养。在TSB Cmr平板不生长，而在TSB平板生长的菌株，筛选出可能的hlb敲除株。提取待鉴定敲除株基因组，hlb外侧、内侧引物分别PCR扩增。与NCTC8325-4野生株相比较，hlb外侧引物PCR产物缺失hlb片段，并且内侧引物PCR无扩增的即为hlb基因敲除株。取hlb外侧引物PCR产物测序，仅残存左、右侧同源臂处的酶切位点序列，进一步确认目的基因敲除，即NCTC8325-4-Δhlb敲除株构建成功。
| 名称 | 引物序列(5′→3′) | 片段长度 |
| Up-hlb(BamHI)-F | CAAGGATCCAATCGATAACTTTCTTCGTTCCA | 969 bp |
| Up-hlb(SalI)-R | GGCGTCGACGATGCTGTAAATATAATCGACAAATC | |
| Down-hlb(SalI)-F | GCTGTCGACGCTCAACTAACTAATAACTTGCTTCG | 993 bp |
| Down-hlb(PstI)-R | TTGCTGCAGGGTACAATTGGTAGTGGTTTGAGA | |
| Out-hlb-F | CGCATGAACTAAGTTTGCTGTGT | 1498 bp |
| Out-hlb-R | CACGTACAGCTACAACAAGTGATAGTC | |
| In-hlb-F | GGTGGGACAAAACTGAAGGTAGC | 133 bp |
| In-hlb-R | TGCTATCATTATCGAATCCACAACC |
1.2.5 金葡菌NCTC8325-4野生株及其Δhlb株、RN4220菌株溶血活性鉴定
将RN4220菌株垂直划线于血琼脂平板，NCTC8325-4野生株、Δhlb株分别划线于左侧和右侧，与中间的RN4220菌株垂直交叉。37 ℃培养过夜，观察溶血现象差异[13]。
1.2.6 金葡菌感染小鼠血源性脑膜炎/脑微脓肿模型构建及鉴定取对数生长期金葡菌NCTC8325-4野生株菌悬液，离心弃去培养基，随后加入灭菌的PBS溶液，清洗、离心共2次，再加入PBS制备菌悬液备用。将100 μL含NCTC8325-4菌株1×107 CFU的菌悬液经尾静脉注射至6~8周龄雄性CD1小鼠，SPF级动物房饲养[14]。注射72 h后将小鼠安乐死，采集脑组织，经病理切片H&E染色，显微镜下观察病理改变。
1.2.7 金葡菌NCTC8325-4野生株与NCTC8325-4Δhlb株感染小鼠血源性脑膜炎/脑微脓肿模型菌载量比较将NCTC8325-4野生株与NCTC8325-4Δhlb菌株按照前述方法(见1.2.6)，分别构建小鼠血源性脑膜炎/脑微脓肿模型。饲养72 h后安乐死，将脑组织加入灭菌0.5% Triton-X-100的PBS溶液制成匀浆，梯度稀释、铺板计数，比较小鼠脑组织的细菌载量。
1.2.8 统计学方法GraphPad Prism 9软件对实验结果进行统计学分析，两组间比较采用Students’ t检验，脑组织细菌载量各组间采用曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)。P < 0.05为具有统计学差异。
2 结果 2.1 Hlb高产菌株Hyper-β导致血脑屏障通透性增加的能力增强整合至hlb基因中的噬菌体可以随机切离[9, 15]。通过血平板培养金葡菌MW2，筛选到β-溶血现象能力明显增强的Hyper-β株(图 1A, B)。Transwell培养hCMEC/D3细胞以模拟血脑屏障，经金葡菌MW2、Hyper-β株(30 MOI)及PBS处理1 h，荧光染料透过实验表明Hyper-β株所致FD40的跨内皮交换百分比显著高于野生株及PBS对照组(图 1C)，提示β-毒素可能具有增加血脑屏障通透性的作用。
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| A：MW2野生株菌落周围见黑色窄带β-溶血环(黄色箭头所示)；B：Hyper-β株菌落周围见宽大β-溶血环(黄色箭头所示)；C：BBB细胞模型FD40跨膜交换通透性比较 a: P < 0.01, b: P < 0.01, c: P < 0.000 1 图 1 金葡菌MW2和Hyper-β株的β-溶血现象及其对血脑屏障通透性的影响 |
2.2 金葡菌NCTC8325-4Δhlb菌株的构建与鉴定
选择10个不同类型金葡菌菌株：MSSA菌株NCTC8325及其衍生株NCTC8325-4和RN4220，Newman；耐甲氧西林金葡菌(methicillin-resistant S. aureus, MRSA)菌株COL、MW2、N315、TW20和USA300；万古霉素中介耐药(vancomycin-intermediate resistance S. aureus，VISA)菌株Mu3，筛选hlb基因完整的菌株作为亲本株。在GenBank数据库中下载上述菌株基因组序列，比较分析其hlb基因，发现NCTC8325-4、COL和RN4220菌株具有完整hlb基因，无噬菌体插入(图 2)，可稳定产生Hlb。
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| A：10个金葡菌株的hlb基因序列比对，8325-4、COL和RN4220的hlb基因完整，无噬菌体插入，其余菌株在距离起始密码子约170 bp或200 bp处被噬菌体插入；B：蓝色箭头表示hlb基因，红色箭头表示前噬菌体基因组。蓝色箭头之间有红色箭头者为噬菌体插入的截断hlb示意图 图 2 不同金葡菌株hlb基因中前噬菌体插入的比较分析 |
我们选择RN4220的亲本菌株NCTC8325-4进行hlb基因敲除[16]。通过同源重组的方法，筛选到NCTC8325-4Δhlb菌株，用hlb基因的外侧引物和内侧引物进行PCR鉴定，结果如图 3A所示。NCTC8325-4Δhlb菌株用hlb基因外侧引物得到的PCR产物与野生株相比，片段减少1 023 bp，相当于hlb基因长度；内侧引物PCR扩增时，野生株hlb基因正常扩增，片段约133 bp，而NCTC8325-4Δhlb菌株无扩增产物。PCR产物进一步经测序鉴定，发现仅在基因组上留下相应的酶切位点(图 3B)，表明NCTC8325-4Δhlb菌株构建成功。
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| A：NCTC8325-4Δhlb菌株hlb基因外侧引物PCR扩增产物电泳图，敲除菌株PCR产物与野生株相比，片段减少1 023 bp(左)；用内侧引物扩增时，野生株hlb基因正常扩增，片段133 bp，NCTC8325-4Δhlb菌株无扩增产物; B：NCTC8325-4Δhlb菌株的测序鉴定，外侧引物PCR产物测序表明基因组上仅留下相应的酶切位点 图 3 金葡菌NCTC8325-4Δhlb菌株的构建及鉴定 |
2.3 敲除hlb对金葡菌NCTC8325-4溶血活性的影响
金葡菌RN4220仅产生β-溶血素，在血平板上呈现典型略浑浊的β溶血现象(图 4黄色箭头所示)。NCTC8325-4野生株为α-，β-及δ-溶血共存，由于Hlb对α-溶血具有抑制作用，故表现为浑浊的不完全溶血现象(图 4蓝色箭头所示)；而β-溶血素还与δ-溶血素相互作用，产生围绕细菌划线条纹的狭窄清晰溶血区域(图 4绿色箭头所示)。NCTC8325-4Δhlb株β-溶血缺如，对α-溶血抑制及与δ-溶血素的相互作用均消失，仅表现为典型的透明α-溶血现象(图 3C红色箭头所示)[13]。
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| 左侧野生株α-及β-溶血共存，呈现不完全溶血区(蓝色箭头所示)，β-与δ-溶血素相互作用，产生狭窄清晰溶血区(绿色箭头所示)；右侧Δhlb株β-溶血缺如，表现为清晰的α-溶血(红色箭头所示)；中间为RN4220，表现为浑浊的β-溶血(黄色箭头所示) 图 4 NCTC8325-4野生株与NCTC8325-4Δhlb株溶血活性比较 |
2.4 敲除hlb影响金葡菌NCTC8325-4穿透血脑屏障
采用30 MOI的金葡菌NCTC8325-4野生株与NCTC8325-4Δhlb株分别处理Transwell培养的hCMEC/D3血脑屏障模型细胞，以PBS处理组为对照，作用1 h后，观察到野生株所致血脑屏障对FD40通透性增加程度显著高于敲除株及PBS对照组(图 5)，表明hlb敲除后金葡菌导致血脑屏障通透性增加的能力降低。
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| 以PBS为对照，比较NCTC8325-4野生株及Δhlb株对BBB细胞模型FD40跨膜交换通透性 a: P < 0.001, b: P < 0.05，ns：无统计学差异 图 5 金葡菌NCTC8325-4和NCTC8325-4Δhlb株对hCMEC/D3细胞模型BBB通透性的检测 |
2.5 敲除hlb影响金葡菌NCTC8325-4在脑组织中定植量
用1×107 CFU的NCTC8325-4野生株经尾静脉注射至雄性CD1小鼠构建金葡菌感染血源性脑膜炎/脑微脓肿模型，72 h后处死小鼠，将脑组织送检病理切片，经H&E染色，观察到软脑膜增厚，大脑皮质及髓质交界部见脑微脓肿形成(图 6A-D)，提示模型构建成功。
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| A，B：H & E染色，可见小鼠大脑表面软脑膜增厚，充血性炎症(黑色箭头指示)，A为40×, B为100×；C，D：H & E染色，可见小鼠大脑皮质与髓质交界处炎症细胞聚集，脑微脓肿形成，边界清楚(黑色箭头指示)，并可见软脑膜增厚，C为40×, D为100×；E：NCTC8325-4野生株及NCTC8325-4Δhlb株构建小鼠血源性脑膜炎/脑微脓肿模型脑组织菌载量比较 n=9，a: P < 0.001 图 6 金葡菌感染小鼠构建血源性脑膜炎/脑微脓肿模型病理改变及hlb敲除对NCTC8325-4在脑组织中定植量的影响 |
分别用1×107 CFU的NCTC8325-4野生株和NCTC8325-4Δhlb株经尾静脉注射构建小鼠血源性脑膜炎/脑微脓肿模型，72 h后取脑组织计数菌载量。与野生株相比，NCTC8325-4Δhlb株感染后在脑组织中的菌载量明显下降(图 6E)，提示敲除hlb后葡菌NCTC8325-4感染脑组织能力显著降低。
3 讨论金葡菌是人类常驻菌群，定植于宿主皮肤、鼻咽部和消化道[17]。在一定条件下，转变为致病菌，引发皮肤、肺炎，并可经血流播散导致败血症，从而引发致命性脑膜炎和脑脓肿[1, 3]。然而，金葡菌如何从定植状态转变为致病状态，通过血流播散入侵中枢的机制仍不清。
金葡菌产生大量毒力因子，如毒素、黏附素和免疫逃逸因子等。毒理因子间相互配合以适应宿主体内不同环境，发挥定植、感染等功能[5]。我们前期研究发现，金葡菌感染脑脓肿致病过程中hlb基因在小鼠脑脓肿模型中表达明显上调，为脑脓肿的关键毒力因子[6]。然而，研究采用的Newman株hlb基因被φSa3噬菌体插入而失活[18]。因此，Hlb的致病功能研究较少。β-毒素由hlb基因编码，该基因位于金葡菌基因组上，约77%临床分离株和96%的人鼻腔金葡菌分离株携带φSa3噬菌体[9, 15]。本研究选择10个金葡菌菌株进行生物信息学比对，其中7个菌株均存在噬菌体插入，与文献报道相一致。然而，噬菌体溶原是一个可逆过程，侵入性金葡菌分离株往往会丢失噬菌体，φSa3噬菌体发挥“分子开关”作用，调控金葡菌的定植与侵袭状态，调控感染过程[15, 19]。噬菌体等可移动遗传元件与金葡菌在不同宿主内生存，发挥致病作用密切相关，前噬菌体的插入和切除可能赋予细菌这种适应性进化优势[9]。我们筛选到金葡菌MW2的Hyper-β株，证实了φSa3噬菌体主动溶原现象的存在，并发现其破坏血脑屏障能力较野生株增强。
中枢神经系统受BBB保护，通常情况下毒素、微生物等不能进入。在一定条件下，金葡菌自血液播散穿透BBB入侵中枢。小鼠金葡菌脑脓肿模型证实金葡菌中枢感染伴随血脑屏障的持续破坏和炎症因子持续升高[20]。其致病作用的发挥可分为以下四个步骤：血流存活、黏附和侵袭、免疫逃逸及细胞内存活[17, 21]。金葡菌穿透血脑屏障感染中枢相关的机制研究报道较少。ypfp基因敲除后导致脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)膜锚定缺陷，表现出侵入hBMEC模拟BBB细胞模型的能力下降，并与体内发生脑膜炎的风险降低相关[14]。葡萄球菌A蛋白(SpA)能够增加人脑微血管内皮细胞(hBMVEC)通透性，同时伴随金葡菌导致的紧密连接蛋白VE-Cadherin、Claudin-5和ZO-1表达减少，促炎细胞因子产生、氧化应激反应和NF-κB通路激活[11]。上述研究均聚焦在金葡菌入侵BBB的黏附和免疫调节环节。而β-毒素则可能是作用于细菌侵袭过程。
β-毒素分子量35 kDa，属成孔毒素，并具有Mg2+依赖的中性鞘磷脂酶(neutral sphingomyelinase，nSMase)活性，分解细胞膜的鞘磷脂，造成宿主细胞死亡，是特定感染条件下的重要毒力因子[9]。既往研究报道，金葡菌β-毒素在肺损伤、兔感染性脑膜炎动物模型中发挥致病作用[22-23]。对人单核巨噬细胞、兔纤毛鼻上皮细胞、牛乳腺上皮细胞具有破坏作用，促进鼠巨噬细胞凋亡，而对人粒细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、红细胞，大剂量仍无明显毒性[24-27]。因此，β-毒素的致病作用具有宿主和组织特异性[6, 17]，而对血脑屏障细胞是否具有致病作用尚未见报道。
为进一步研究β-毒素的生物学功能，构建了NCTC8325-4的hlb敲除株NCTC8325-4Δhlb株。NCTC8325-4野生株可产生α、β、γ和δ-溶血素。四种溶血素之间存在相互作用，在血琼脂平板上呈现不同的溶血现象。由于Hlb对α-溶血具有抑制作用，在血平板上表现为宽大浑浊的不完全溶血环；δ-溶血素与Hlb相互作用，产生一个围绕菌条纹的狭窄清晰溶血区。NCTC8325-4Δhlb株呈现透明的α-溶血环，与δ-溶血环融合，是Hlb对α-溶血抑制作用消失出现的。因此，证实敲除株确实不能产生β-溶血素。
构建hCMEC/D3血脑屏障细胞模型，验证Hlb在金葡菌感染中枢神经系统中的作用，比较发现NCTC8325-4野生株所致血脑屏障通透性增加程度显著高于NCTC8325-4Δhlb株及PBS对照组。再构建金葡菌感染小鼠血源性脑膜炎/脑微脓肿模型，观察到小鼠脑组织NCTC8325-4Δhlb株脑组织菌载量较野生株明显减少，进一步证明hlb基因敲除后金葡菌穿透BBB进入小鼠的能力减弱。β-溶血素为成孔毒素，可在细胞膜上打孔，直接裂解宿主细胞；具有nSMase活性，分解细胞膜的鞘磷脂，导致宿主细胞损伤[28]。鞘磷脂是细胞膜磷脂双分子层的重要结构和信号成分。鞘磷脂生物合成的破坏与炎症、感染、神经退行性疾病、糖尿病和癌症等人类疾病有关。许多病原微生物利用和操纵鞘磷脂途径入侵宿主细胞，并存活和增殖[29-30]。我们推测金葡菌Hlb破坏血脑屏障，促进细菌感染中枢神经系统的作用可能是通过上述机制发挥的，该假设有待进一步研究验证。
综上所述，金葡菌β-毒素编码基因hlb常被噬菌体插入失活，导致致病作用被低估。噬菌体发挥“分子开关”作用，切离后hlb基因被激活而发挥致病作用。本研究通过生物信息学比对，筛选到无φSa3噬菌体插入的金葡菌菌株，构建hlb基因敲除株，发现敲除株引起BBB细胞模型透性增加的能力和导致小鼠脑膜炎/脑微脓肿的能力均较野生株显著下降。首次证明β-毒素在金葡菌感染CNS中发挥重要作用，其功能的发挥有助于金葡菌破坏并通过血脑屏障。
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