表1(Table 1)
艰难梭菌(Clostridium difficile, CD)是一种专性厌氧的革兰阳性芽孢杆菌，正常分布在人体肠道中，为肠道菌群失调时引起腹泻的潜在病原体[1]。据统计，CD在健康成年人群体中定植率为4%~15%，住院成年人的定植率达21%，长期护理机构居民的定植率为15%~30%[2]。当肠道菌群紊乱时CD大量增殖，分泌毒素及形成生物膜，引起不同程度的肠道炎症甚至全身中毒症状[3]。伴随着人口老龄化与临床中广谱抗生素、抑酸剂及化疗药物使用量的增加，艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection, CDI)的发病率、复发率和危重率均不断升高[4]。目前CDI的诊断依赖于腹泻、发热等临床表现，并辅以粪便艰难梭菌毒素检查及结肠镜检查。部分相关指南将白细胞计数、肌酐水平和内镜发现伪膜作为CDI严重程度的判断方法[2, 5]。然而，这些评估方法都有其局限性，且在CDI治疗过程中也需继续监测以便及时调整治疗方案。因此，采用简便、快速的检验指标及时判断CDI的严重程度有着重要的临床意义。C反应蛋白(C-reactive protein, CRP)是传统血清学炎症标志物，由肝细胞合成，在感染或组织损伤时水平升高迅速，但难以独立反应局部炎症活动程度。粪便钙卫蛋白(fecal calprotein, FCP)是一种来源于中性粒细胞的炎症标志物，可较稳定的存在于粪便中，临床上常用于肠道炎症活动的监测[6]。由于FCP具有组织特异性，可以在一定程度上弥补CRP非特异性表达的不足之处[7]。CRP和FCP检验标本获取方便，检验速度亦较快，在临床中广泛应用，可弥补内镜检查准备复杂、耗时长及并发症风险较高的不足。本研究旨在探讨FCP联合CRP在重症CDI中的诊断价值。
1 对象与方法 1.1 研究对象本研究采用病例对照研究设计方案。收集2020年1月至2022年12月在南京医科大学附属江宁医院住院治疗腹泻并诊断CDI患者的病例资料。CDI诊断标准依照《中国成人艰难梭菌感染诊断和治疗专家共识(2017，北京)》。纳入标准为：年龄在18周岁以上，入院后行CD检测并明确诊断CDI的患者。排除标准为：①近期患有肺部感染、泌尿系感染等其他感染性疾病者；②合并有炎症性肠病的患者；③合并有消化道肿瘤的患者；④合并有自身免疫性疾病的患者；⑤所需病例资料不全的患者。本研究得到我院医院伦理委员会批准(2023-03-061-K01)，所有受试患者签署了知情同意书。
1.2 研究方法 1.2.1 收集资料包括患者的人口学资料及临床资料。临床资料包括4周内抗生素暴露史、4周内抑酸剂(质子泵抑制剂和H2受体拮抗剂)使用史、基础疾病(心血管系统疾病、慢性呼吸系统疾病、糖尿病、慢性肾脏病)、住院期间ICU暴露史、是否发热、低蛋白血症(血清白蛋白 < 30 g/L)、每日腹泻次数、CRP水平及FCP水平。
1.2.2 检测方法① 艰难梭菌的检测：使用Xpert Clostridium difficile检测试剂盒对粪便进行艰难梭菌毒素B基因tcdB、艰难梭菌二元毒素基因cdt和缺失nt117的tcdC的基因序列检测，毒素B的探针被检出并位于有效的Ct值范围内，可判定为艰难梭菌感染阳性。②FCP水平的检测：取患者入院后首次新鲜粪便标本100 mg，按1 ∶49加入萃取液，充分混匀后3 000 r/min离心5 min，提取上清液1 mL测定FCP水平，试剂盒为南京美宁康诚生物科技有限公司生产的FCP测定试剂盒。③血清CRP水平的检测：入院后首次空腹采集肘静脉血6 mL，使用全自动生化分析仪，运用乳胶增强免疫透射比浊法测定CRP水平。
1.2.3 分组根据CDI严重程度分为轻中度CDI组和重症CDI组。CDI严重程度的诊断标准为：①轻中度感染：CDI患者有腹泻等肠炎样症状，但没有重症感染表现；②重症感染：CDI患者有腹泻症状且存在以下任何一项因CDI导致的异常：白细胞>15×109/L、血肌酐较基线升高>50%、内镜发现伪膜[5]。
1.3 统计学分析应用SPSS 23.0统计软件分析组间资料，正态分布计量资料采用x±s表示，组间比较采用独立样本t检验；非正态分布的计量资料采用M (P25, P75)表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。理论均数不包含0的计数资料以率或百分比表示，采用χ2检验。通过ROC曲线计算曲线下面积(area under curve, AUC)分析CRP和FCP及二者联合对重症CDI的诊断价值，利用约登指数确定最佳截断值，并依此计算敏感度、特异度、阳性预测值(positive predictive value, PPV)和阴性预测值(negative predictive value, NPV)。P < 0.05视为有统计学意义的差异。
2 结果 2.1 重症CDI发生的单因素分析共纳入73例明确诊断CDI患者(图 1)，其中轻中度CDI 49例患者中，男30例，女19例，平均年龄63.3岁；重症CDI 24例患者中，男17例，女7例，平均年龄65.8岁。重症CDI组发热人数、血清CRP水平和FCP水平均显著增高(P < 0.05)，两组间其余临床资料对比显示均无明显差异(P>0.05，表 1)。
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| 图 1 艰难梭菌感染患者的纳入流程 |
| 变量 | 轻中度CDI (n=49) | 重症CDI (n=24) | P |
| 性别(男/女) | 30/19 | 17/7 | 0.295 |
| 年龄/岁 | 63.3±20.4 | 65.8±16.4 | 0.221 |
| 抗生素暴露史 | 41(83.7) | 22(91.7) | 0.293 |
| 抑酸剂使用史 | 19(38.8) | 13(54.2) | 0.160 |
| 基础疾病 | |||
| 心血管系统疾病 | 19(38.8) | 12(50) | 0.254 |
| 慢性呼吸系统疾病 | 5(10.2) | 4(16.7) | 0.332 |
| 糖尿病 | 13(26.5) | 7(29.2) | 0.511 |
| 慢性肾脏病 | 4(8.2) | 4(16.7) | 0.239 |
| ICU暴露史 | 5(10.2) | 4(16.7) | 0.332 |
| 发热 | 7(14.3) | 9(37.5) | 0.028 |
| 低白蛋白血症 | 4(8.2) | 6(25) | 0.058 |
| 腹泻次数/(次/d) | 4.5±2.9 | 5.3±3.7 | 0.169 |
| CRP/(mg/L) | 14.0(3.0, 32.0) | 59.9(25.8, 104.0) | < 0.001 |
| FCP/(μg/g) | 37.5(31.5, 51.7) | 100.2(55.8, 201.8) | < 0.001 |
2.2 重症CDI发生的多因素分析
比较轻中度CDI组和重症CDI组，将P < 0.2的6个因素(抑酸剂使用史、发热、低白蛋白血症、腹泻次数、CRP水平和FCP水平)作为协变量，纳入二分类Logistic回归模型进行多因素分析。结果显示，血清CRP水平(P=0.005，OR=1.028，95%CI：1.008~ 1.049)和FCP水平(P < 0.001，OR=1.023，95%CI：1.010~1.036) 均为重症CDI发生的独立危险因素(表 2)。
| 变量 | 95%CI | OR | P |
| 抑酸剂使用史 | 0.342~5.641 | 1.388 | 0.647 |
| 发热 | 0.071~5.319 | 0.614 | 0.658 |
| 低白蛋白血症 | 0.123~8.056 | 0.994 | 0.996 |
| 腹泻次数 | 0.858~1.383 | 1.089 | 0.482 |
| CRP | 1.008~1.049 | 1.028 | 0.005 |
| FCP | 1.010~1.036 | 1.023 | < 0.001 |
2.3 CRP和FCP对重症CDI的诊断价值
使用ROC曲线分析血清CRP水平和FCP水平对重症CDI的诊断价值。结果显示，血清CRP水平和FCP水平诊断重症CDI的曲线下面积分别为0.753(95%CI：0.626~0.880)和0.794(95%CI：0.671~0.917)，二者联合诊断ROC曲线下面积为0.923(95%CI：0.865~0.982)，Cut-off值为0.199，此处对应CRP值为26 mg/L、FCP值为71 μg/g。Cut-off点敏感度为100.0%，特异度为79.6%，PPV为70.6%，NPV为100.0%(图 2)。
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| 图 2 C反应蛋白联合粪便钙卫蛋白对重症艰难梭菌感染的诊断价值(ROC曲线) |
3 讨论
CDI的产生背景常为药物使用造成的肠道菌群紊乱，近年来CDI发病率不断上升，已成为医疗相关性腹泻最重要的病因[8]。据美国疾病预防与控制中心统计，2017年全美国CDI患者46万例，其中在院死亡2万例，对公共健康造成重大威胁[9]。
轻中度与重症CDI的抗生素选择有所不同，轻中度通常选择甲硝唑进行治疗，而重症则建议选择万古霉素溶液口服[5]。重症CDI如起始选择甲硝唑治疗，可能导致病情延误、肠道炎症加重引起感染性休克、肠梗阻及外科手术等不良结局。而广泛使用万古霉素治疗CDI会增加肾脏损伤等副作用发生率，同时会提高细菌的耐药性，有诱使耐万古霉素肠球菌定植和传播的风险[10]。因此，快速并准确的诊断重症CDI可以帮助在治疗开始时选择合适的抗生素，更有效的控制疾病的进展，避免相关并发症的发生，并减少药物副作用和相关耐药菌的传播。然而，目前重症CDI的诊断部分依赖于内镜下发现伪膜。由于内镜为侵入性检查，需行充分的肠道准备，耗时耗力，且有因操作不当诱发重症CDI患者出现中毒性巨结肠、肠穿孔等并发症的风险。此外，有部分难以耐受肠道准备、基础疾病较多、生命体征不稳定的患者可能无法进行内镜检查。因此，筛选重症CDI相关的生物标志物将克服目前诊断方式的局限性，提高诊治安全性，让患者更多获益。
抑酸剂可引起肠道pH升高，破坏正常的肠道菌群分布并直接促进CD芽孢萌发，导致CDI的发生[11]。本研究中重症CDI组的4周内抑酸剂使用率虽高于轻中度组，但无明显统计学差异。因此倾向于抑酸剂促使CDI的发生，但对CDI严重程度无影响。低白蛋白血症反映机体处于营养不良状态，是影响感染严重程度的常见因素。对合并CDI的恶性肿瘤患者研究显示血清白蛋白水平与CDI严重程度相关[12]。本研究结果两组间低白蛋白血症人数无明显差异，可能与样本量较小有关，需扩大样本量进一步研究。发热和腹泻均为胃肠道感染的常见症状，由CD表达的毒素蛋白引起。研究表明毒素蛋白为CD的主要致病因子，毒素蛋白A是肠毒素，可与肠黏膜上皮细胞刷状缘上的受体结合，介导黏膜上皮细胞的cAMP系统，使水和盐分泌增加，引起腹泻样表现；毒素蛋白B是细胞毒素，可刺激单核细胞释放炎性因子，引起患者出现发热等炎症反应，同时导致肠黏膜细胞凋亡、变性、坏死和脱落，呈肠道伪膜表现[13]。本研究中重症CDI组发热率和腹泻次数均高于轻中度组，但多因素分析显示二者均非重症CDI的独立危险因素，因此发热和腹泻次数对CDI严重程度的诊断价值有限。
CRP为肝脏合成的急性时相反应蛋白，常用于评估感染、创伤、风湿性疾病等患者的全身炎症活动状态[14]。研究显示，CRP升高是罹患CDI死亡的独立危险因素[15]。但CRP易受机体情况影响，不能准确反映CDI患者肠道炎症水平，相关报道提示CRP对内镜下肠道黏膜炎症损伤敏感度和特异度较低[16]。FCP是近年较为热门的肠道炎症标志物。当肠黏膜发生炎症时，大量中性粒细胞聚集于受损黏膜并释放钙卫蛋白，产生调节免疫系统功能、诱导细胞凋亡及抑制细胞增殖作用[17]。FCP可较准确地反映炎症性肠病内镜下表现，是常用的监测炎症性肠病活动程度及预测复发的检验方法[18-19]。由于其获取标本方便、非侵入性的特点，亦可用于临床快速鉴别炎症性肠病与肠易激综合征[20]。目前尚无基于我国人群的FCP水平与CDI严重程度的相关研究，但此前国外已有相关发现：韩国一项研究报道，FCP可用于判断轻度与重度CDI，敏感度为70%，特异度为80%[21]；密歇根大学的研究提示高水平FCP与老年CDI患者的不良结局相关，OR值为7.08[22]。本研究显示CRP与FCP均是重症CDI的独立危险因素，且二者独立指标对重症CDI均有中等预测价值。将二者联合后诊断阳性预测值为70.6%，阴性预测值可达100%，高于二者独立诊断，说明FCP联合CRP相比二者独立应用在重症CDI的诊断中有着更重要价值。
本研究仍有下面这些不足之处：①样本量较少，总样本数为73例，重症CDI组仅有24例。②本研究为单中心回顾性研究，且时间跨度较长。这些不足可能会引起偏倚，从而降低研究结果的可靠性和研究结论的普遍性。因此，本研究结论尚需更大样本、高质量的前瞻性研究加以验证。
综上所述，FCP是特异性肠道炎症标志物，是重症CDI的独立危险因素，检测方法安全方便快捷。在临床工作中可使用FCP联合经典全身炎症水平标志物CRP较准确判断CDI的严重程度，为治疗方案的选择提供依据。
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