多糖是很多动物细胞膜、植物细胞壁以及微生物细胞壁的组成成分之一,是一类高分子化合物。中药多糖是中药的主要成分之一,在中药成分中占比很高。近年研究发现其具有重要的生物活性,包括抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗糖尿病、辐射防护、免疫调节等,并且具有低毒性和低副作用的优点[1-6]。炎症作为机体的一种防御反应,中医理论认为是邪气入侵时体内正气抵御,维护机体的表里调和、阴阳平衡的临床病症的变化[7-8]。自古以来,中药就被用于治疗炎症和相关疾病,并根据其作用分为“寒”“热”等药性。中药传统的用药方法是水煎汤剂,多糖是该剂型中的主要成分[3]。尽管既往大量研究表明中药多糖具有抗炎等广泛的生物活性[9],但是尚缺乏联系多糖和抗炎作用的明确分子靶点。
唾液酸特异性Ig样凝集素-9 (sialic-acid-binding immunoglobulin-like lectin-9,Siglec-9)是一种识别多糖进而产生抑炎作用的膜蛋白,主要表达于人单核/巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞等免疫细胞中[10-12],Siglec-E是Siglec-9在小鼠体内的同系物[13],可识别聚糖配体。研究证实不仅内源性Siglec-9聚糖配体能够在维持免疫稳态中起重要作用[14-15],DELAVERIS等[16]报道合成的外源性聚糖配体也能够通过激活Siglec-9显著抑制中性粒细胞炎症反应降低COVID-19导致的肺部炎症。另外,以多糖为主要成分的清肺排毒汤同样具有降低COVID-19患者肺部炎症反应的效果[17],提示植物多糖可能具有通过激活Siglec-9通路产生抗炎活性的潜力,但目前植物多糖与Siglec-9之间的关系尚不清楚。故本研究选择中医辨证理论确定药性的中药为研究对象,从中药中提取其多糖组分,探讨中药多糖和Siglec-9结合力与抗炎的相关性,为中药多糖抗炎靶点研究提供可借鉴的现代药理学新机制。
1 材料与方法 1.1 主要试剂重组Human Siglec-9 Fc蛋白(R&D systems,1139-SL-050),重组Mouse Siglec-E Fc蛋白(R&D systems,5806-SL-050),GT1b(Millipore,345744),R848(Med Chem Express,S28463),SYTOXTM Green(Thermo Fisher Scientific,S7020),Phosphatidylcholine(AbMole,8002-43-5),RPMI1640培养基无酚红(Hyclone,SH30605.01),辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(上海碧云天生物技术有限公司,A0216),再生纤维素透析袋(上海源叶生物科技有限公司,SP132638),磷酸氢二钠(百灵威,947717),三氟乙酸(阿拉丁,T281759),1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)(麦克林,P816062),5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(上海碧云天生物技术有限公司,P0015),RIPA裂解液(上海碧云天生物技术有限公司,P0013B),BCA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,P0012)。
1.2 中药本课题组筛选并采购了中国药典无争议且药性明确的中药饮片18种(表 1),经陆军军医大学生药学与中药学教研室主任李鹏教授鉴定均为道地药材。
名称 | 药性 | 产地 | 名称 | 药性 | 产地 | |
柴胡 | 寒 | 河南 | 何首乌 | 温 | 陕西 | |
蒲公英 | 寒 | 山东 | 麻黄 | 温 | 辽宁 | |
金银花 | 寒 | 山东 | 荆芥 | 温 | 安徽 | |
连翘 | 寒 | 河北 | 防风 | 温 | 辽宁 | |
龙胆 | 寒 | 吉林 | 熟地 | 温 | 辽宁 | |
牛蒡子 | 寒 | 浙江 | 黄芪 | 温 | 内蒙古 | |
玄参 | 寒 | 浙江 | 枸杞 | 热 | 宁夏 | |
桑叶 | 寒 | 浙江 | 白芷 | 热 | 浙江 | |
石斛 | 寒 | 浙江 | 干姜 | 热 | 四川 |
1.3 仪器
高效液相色谱仪(岛津,LC-1200),真空旋转蒸发仪(亚荣仪器有限公司,2X98-2L),低温高速离心机(Eppendorf,22331),冷冻干燥仪(齐强仪器制造有限公司,QS-10N),傅里叶变换红外光谱仪(珀金埃尔默股份有限公司,Spectrum 100),二氧化碳细胞培养箱(益世科生物,CLM-170B-8-CN),酶标仪(瑞士帝肯贸易有限公司,INFINITE 200 PRO),倒置荧光显微镜(日本尼康株式会社,TI-U)。
1.4 多糖提取以及含量测定取干燥中药材100 g,打粉并加入10倍量的80%乙醇(60 ℃,2 h)回流提取,药渣抽滤晾干后加入10倍量的水浸泡并加热超声提取(80 ℃,1.5 h,2次)。抽滤提取液浓缩至原体积的1/8,加入4倍体积的无水乙醇醇沉24 h,沉淀物分别用丙酮、乙醚清洗并在通风橱中挥干。溶解沉淀物后用20% Sevage试剂除去蛋白质,取上层水相,经1 000 Da透析后冻干即为粗多糖。苯酚硫酸法检测多糖含量,灼烧法进行灰分分析。
1.5 多糖提取物的单糖组成测定称取2 mg多糖样品加入1 mL 2 mol/L盐酸-甲醇溶液充N2管,80 ℃水解6 h后用氮吹仪吹干,再加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸,120 ℃氮气封管水解1 h,冷却后加入甲醇3~5次除去多余的三氟乙酸。随后加入1 mL水溶液溶解均匀,从溶解后的样品中取出200 μL,加入400 μL 0.3 mol/L NaOH水溶液和400 μL PMP试剂,剧烈涡旋混合均匀,于70 ℃水浴反应1 h。冷却至室温后10 000 r/min离心5 min,除去沉淀。用0.2 mol/L盐酸调整pH值至7.0~7.1,加入2 mL二氯甲烷吹打均匀,4 500 r/min离心5 min,重复该操作3~5次,直到下层二氯甲烷层颜色为白色为止。水相单糖衍生物氮吹至无氯仿味道,过0.45 μm滤膜,运用HPLC进行分析。高效液相色谱分析条件:C18柱;35 ℃;流动相:82.8% 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.0),17.2%乙腈;流速:1.0 mL/min;检测波长:254 nm。
1.6 多糖提取物竞争性抑制Siglec-9与GT1b结合实验稀释Siglec-9-Fc至1 μg/mL,分别与等体积的浓度为2 mg/mL的多糖溶液、单糖混合液以及溶剂室温预混1 h[18]。预混好的混合溶液加入到固定有GT1b(100 pmol/孔)的酶标板中,室温孵育90 min后洗涤3次。每孔加入100 μL辣根过氧化物酶标记的山羊抗人二抗(1:6 000),室温孵育45 min。洗涤3次后加入TMB显色液避光显色10 min,终止反应后将板置于酶标仪上,在450 nm处检测光密度值。计算多糖对GT1b与Siglec-9结合的抑制率。
A样品是指加入多糖与Siglec-9预混的样本后检测的光密度值;A对照是指加入Siglec-9样本后检测的光密度值;A空白是指DPBS与辣根过氧化物酶标记二抗的检测光密度值。
1.7 多糖提取物的红外光谱分析多糖粉末置于40 ℃烘箱烘干过筛,调整旋钮使样品粉末平铺于FT-IR光谱测定窗口,测力值稳定后检测红外吸收光谱,光谱波数的范围设置为4 000~250 cm-1并在同样测力值下扫描5次得到红外原始谱图。
1.8 多糖提取物体外抗氧化活性实验选择与Siglec-9亲和力较好的柴胡多糖和蒲公英多糖,亲和力较弱的黄芪多糖和枸杞多糖,稀释为50、25 μg/mL。维生素C稀释为50、25 μg/mL。分别检测多糖1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基清除能力[19]。清除率计算公式:
1.9 多糖提取物的抗炎活性 1.9.1 多糖提取物抑制巨噬细胞炎症反应实验用含佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)(100 μg/L)的RPMI1640培养基处理THP-1细胞,使其分化成巨噬细胞(THP-Ms)后洗去PMA,以1×105/mL的细胞密度接种在24孔板。除对照组外,各组中均加入LPS(1 μg/mL)以及不同的多糖溶液(0.1、0.3、1.0 mg/mL)刺激5 h,分组为Control组、LPS组、LPS+GT1b组、LPS+柴胡多糖组(1.0、0.3、0.1 mg/mL)、LPS+蒲公英多糖组(1.0、0.3、0.1 mg/mL)、LPS+黄芪多糖组(1.0、0.3、0.1 mg/mL)、LPS+枸杞多糖组(1.0、0.3、0.1 mg/mL);而后加入终浓度为5 mmol/L的ATP刺激30 min,ELISA法检测细胞上清中IL-1β和TNF-α蛋白的表达水平。将从Siglec-Eflox/flox小鼠和Lyz2-cre: Siglec-Eflox/flox小鼠中提取的腹腔巨噬细胞以1×105/mL的密度接种在24孔板中。分组和指标检测同THP-Ms细胞。
1.9.2 多糖提取物抑制中性粒细胞胞外捕获网(neutrophil extracellular traps, NETs)实验小鼠腹腔注射4%巯基乙酸盐培养基4 h后提取腹腔中性粒细胞[20],瑞氏-姬姆萨染色确定中性粒细胞纯度。细胞重悬于无血清不含酚红的RPMI1640中,除Control组外,各组均加入TLR-7/8激动剂(R848),以及不同的多糖溶液(0.3 mg/mL),分组为Control组、R848组、R848+GT1b组、R848+柴胡多糖组、R848+蒲公英多糖组、R848+黄芪多糖组、R848+枸杞多糖组;并置于细胞培养箱中6 h。洗涤细胞,按说明书加入SYTOXTM Green染色30 min后,DAPI染色细胞核10 min,低速短暂离心沉淀细胞后,荧光显微镜下观察细胞染色并统计NETs阳性细胞比率。
1.10 统计学分析实验结果以x±s表示,应用GraphPad Prism 7进行数据处理,多组间数据统计分析采用单因素方差分析,2组间数据差异分析采用Student’ s t检验。检验水准为α=0.05。
2 结果 2.1 多糖含量中药多糖提取物中冻干粉得率(冻干粉质量/生药质量)见表 2,冻干粉中多糖含量均不一样,但都在55%以上,部分多糖含有糖醛酸。
中药 | 得率/%(冻干粉/生药) | 总糖含量/% | 糖醛酸含量/% |
柴胡 | 5.3 | 82.4 | 3.1 |
蒲公英 | 6.7 | 72.1 | 3.4 |
金银花 | 5.8 | 71.4 | 2.8 |
连翘 | 5.6 | 72.4 | 4.2 |
龙胆草 | 2.4 | 67.0 | 3.9 |
牛蒡子 | 5.4 | 66.8 | 1.9 |
玄参 | 7.1 | 74.4 | 4.0 |
桑叶 | 7.0 | 56.0 | 2.5 |
石斛 | 2.1 | 63.7 | 2.0 |
何首乌 | 6.8 | 67 | 4.7 |
麻黄 | 7.5 | 85.1 | 3.6 |
荆芥 | 6.6 | 66.2 | 2.7 |
防风 | 7.4 | 74.2 | 2.3 |
熟地 | 6.8 | 68.5 | 4.2 |
黄芪 | 14.7 | 85.5 | 2.3 |
枸杞 | 5.2 | 81.4 | 1.3 |
白芷 | 7.5 | 71.7 | - |
干姜 | 3.4 | 66.4 | 1.5 |
2.2 多糖提取物单糖组成
18种中药多糖主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、糖醛酸组成,除此之外还含有少量的阿拉伯糖等。寒性中药多糖单糖组成多数有较多半乳糖醛酸,见表 3。
中药 | 单糖质量分数 | |||||
甘露糖 | 葡萄糖醛酸 | 半乳糖醛酸 | 葡萄糖 | 半乳糖 | 阿拉伯糖 | |
柴胡 | 10.2 | - | 32.7 | 15.2 | 33.1 | 5.9 |
蒲公英 | 12.0 | 4.5 | 25.2 | 16.9 | 25.5 | 12.8 |
金银花 | 20.1 | 6.9 | - | 34.5 | 25.7 | 8.1 |
连翘 | 7.4 | 6.3 | 23.4 | 20 | 21.7 | 13.7 |
龙胆草 | 5.9 | 43.2 | - | 19.4 | - | 2.9 |
牛蒡子 | 13.0 | 4.3 | 4.3 | 13.0 | 32.6 | 30.4 |
玄参 | 1.8 | 1.8 | 44.4 | - | 51.0 | - |
桑叶 | 9.8 | 32.0 | - | 33.3 | 8.6 | 9.8 |
石斛 | 21.8 | - | - | 72.8 | 3.3 | - |
何首乌 | 8.3 | 2.7 | 27.7 | 30.5 | 16.6 | - |
麻黄 | 13.0 | 17.3 | - | 21.7 | 30.4 | - |
荆芥 | 8.4 | - | 12.0 | 26.5 | 38.5 | 7.2 |
防风 | 5.1 | 9.0 | - | 49.3 | 20.7 | 15.5 |
熟地 | 2.2 | 5.3 | - | 21.7 | 65.6 | 4.1 |
黄芪 | 2.7 | 2.7 | - | 78.3 | 10.8 | 3.6 |
枸杞 | 4.7 | - | - | 78.6 | 6.6 | 7.1 |
白芷 | 3.9 | - | - | 92.5 | 3.2 | - |
干姜 | 7.1 | - | - | 31.9 | 27.8 | 16.9 |
2.3 寒性中药的多糖提取物对GT1b与Siglec-9的结合具有显著抑制作用
竞争性结合实验证实,柴胡多糖等寒性中药多糖与Siglec-9的亲和力较强,从而竞争性抑制GT1b与Siglec-9的结合,抑制率比较高(P<0.01)。温热性中药相比寒性中药多糖对Siglec-9和GT1b结合的抑制作用较弱,如枸杞和黄芪的多糖(P<0.05),见图 1。单糖混合液对GT1b与Siglec-9结合没有显著抑制作用。
2.4 多糖提取物的红外(IR)光谱测定
红外光谱图显示,代表性植物多糖,柴胡、蒲公英、枸杞以及黄芪多糖均在3 452 cm-1处均具有较强的羟基吸收峰,2 990 cm-1处有弱的C-H吸收峰,表明总糖含量高,与糖含量测定结果一致。黄芪和枸杞多糖在1 730~1 637 cm-1处表现出较低的吸收,而柴胡和蒲公英多糖在1 730~1 637 cm-1处表现出较强的吸收,说明柴胡和蒲公英多糖的结构具有糖醛酸结构。4种多糖在1 455、1 402 cm-1处均有吸收峰,提示存在C-H的弯曲振动。1 200~1 000 cm-1处均具有吸收峰,说明多糖存在C-O伸缩的吡喃环振动,见图 2。以上结果显示,4种代表性中药多糖均有典型的多糖结构,柴胡和蒲公英多糖中有糖醛酸结构。
2.5 多糖提取物的抗氧化活性
4种中药多糖提取物对DPPH和ABTS自由基均有明显的清除作用(P<0.01,图 3)。其中枸杞多糖和黄芪多糖在相同浓度下清除自由基的能力强于柴胡多糖和蒲公英多糖,并且和维生素C相当。
2.6 多糖提取物对巨噬细胞炎症反应的影响
与LPS组相比,GT1b、柴胡多糖和蒲公英多糖均显著抑制THP-1来源巨噬细胞中TNF-α和IL-1β的产生,并具有浓度依赖性(P<0.01, 图 4),黄芪多糖和枸杞多糖对细胞炎症因子的分泌无显著影响。利用基因鉴定及RT-PCR技术对Siglec-E髓系敲除小鼠中Siglec-E的表达进行鉴定,结果如图 5所示。在Siglec-Eflox/flox小鼠来源的原代巨噬细胞中的结果与THP-1来源巨噬细胞结果一致(P<0.05,图 6)。而柴胡多糖、蒲公英多糖和GT1b的抗炎效果在Lyz2-cre: Siglec-Eflox/flox小鼠来源的巨噬细胞中消失,枸杞多糖和黄芪多糖的结果仍显示为阴性,提示其抗炎机制与Siglec-E信号通路相关。
2.7 多糖提取物对中性粒细胞NETosis反应的影响
TLR-7/8激动剂R848可在体外诱导中性粒细胞出现NETosis。GT1b、柴胡多糖和蒲公英多糖显著抑制野生型小鼠腹腔中性粒细胞的NETosis,而黄芪多糖和枸杞多糖无效。在髓系敲除来源的小鼠腹腔中性粒细胞中,GT1b、柴胡多糖和蒲公英多糖对中性粒细胞NETosis的抑制作用消失(P<0.01, 图 7)。提示柴胡多糖和蒲公英多糖对NETosis的抑制与Siglec-9/E信号通路相关。
3 讨论
中药多糖是中药发挥药效的主要物质基础,目前中药多糖的研究主要以药效研究为主,集中在对炎症相关信号通路的影响,对其直接作用靶点的现代药理学机制研究尚不够深入。本研究拟基于Siglec-9这一抗炎新靶点,探索中药多糖提取物与Siglec-9结合能力强弱进而导致抗炎能力的差异。结果发现不同中药的多糖提取物和Siglec-9的亲和力显著不同,其中发现解表药和清热药多糖提取物的亲和力较好,优于补益类中药多糖。在此基础上,根据中药多糖与Siglec-9的不同程度亲和力,对其中代表性植物多糖柴胡、蒲公英、枸杞和黄芪多糖进行红外光谱测定,皆存在典型多糖结构,而柴胡多糖和蒲公英多糖具有糖醛酸结构,判断这种亲和力的差异与多糖提取物的单糖组成也具有一定的相关性,即亲和力较强的多糖提取物单糖组成中多数有半乳糖醛酸,提示与Siglec-9的结合可能是酸性多糖。人体内多种细胞上生理性Siglec-9的激动剂为具有唾液酸末端的特异性Lewis X聚糖结构[20-21],但上述中药多糖提取物中并未发现唾液酸,说明植物多糖与Siglec-9的结合并不依赖唾液酸末端,而可能是葡萄糖醛酸等其他酸性多糖。有研究表明由葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺聚合而成的高分子量透明质酸同样具有结合并激活Siglec-9的作用[22],与本研究结果一致。在后续的实验中将进一步研究确定多糖结合Siglec-9的末端结构和多糖的空间结构。
为证实Siglec-9是否为多糖提取物抗炎活性的靶点,本研究选择不同亲和力的代表性中药多糖提取物进行抗炎活性实验。结果显示与Siglec-9亲和力高的中药多糖(柴胡多糖和蒲公英多糖),对人源性巨噬细胞(THP-1 Ms)和鼠源性原代腹腔巨噬细胞具有较好的抗炎能力,同时对中性粒细胞NETosis炎症反应也有显著的抑制作用,高浓度多糖的抑制效果与GT1b(Siglec-9配体)相当。而亲和力较低的黄芪和枸杞多糖无显著影响。为排除多糖本身还原性导致的抗炎作用影响,本研究进行了多糖的自由基清除实验。结果证实代表性中药多糖提取物均具有清除自由基的作用,说明本实验中多糖提取物的抗炎作用与其清除自由基的作用无关。
为了进一步验证多糖提取物的抗炎作用是否和Siglec-9相关,本研究制备了髓系细胞特异性敲除Siglec-E的Lyz2-cre: Siglec-Eflox/flox小鼠。发现亲和力较好的中药多糖提取物的抗炎作用在无Siglec-E表达的巨噬细胞和中性粒细胞中均消失,强烈提示亲和力较好的中药多糖(柴胡多糖和蒲公英多糖)提取物的抗炎作用是通过Siglec-9/E通路实现的。
综上所述,本研究证实部分中药多糖与Siglec-9具有较强的亲和力,并且可能与其中含有的糖醛酸有关,进而发挥抗炎活性。因此,有理由认为,Siglec-9是联系具有抗炎活性的中药多糖和其抗炎作用的全新药理学靶点,有潜力成为研究中药多糖抗炎的新的现代药理学机制。
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