2. 730000 兰州，兰州大学：第一医院麻醉科
2. Department of Anesthesiology, the First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou, Gansu Province, 730000, China
脓毒症是宿主对感染的反应异常导致危及生命的器官功能障碍[1]。急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)是脓毒症的一种常见的并发症，也是进展为慢性肾脏疾病的一个危险因素[2]。脓毒症AKI的全球发病率约为每年1 100万例[3]。高达60%的脓毒症患者在ICU中发现脓毒症AKI[4]，而且临床上被诊断为脓毒症AKI的患者往往存在更高的死亡风险[5]。
炎症反应是宿主抵抗感染的主要防御机制，但炎症失衡可导致组织和器官的进一步损伤，这也是脓毒症主要的发病机制[6]。最新研究表明，有氧糖酵解在宿主防御感染的免疫反应中发挥核心作用，是炎症性疾病的一个新靶点[7]。脓毒症时，小鼠肾脏组织代谢可转变为有氧糖酵解，使糖酵解水平和糖酵解途径多种关键酶水平增加，抑制有氧糖酵解可以减轻脓毒症AKI，提高脓毒症小鼠存活率[8]。但其具体机制目前报道较少，需要进一步研究来明确。
越来越多的证据表明PI3K-AKT-mTOR信号通路激活参与调控细胞有氧糖酵解[9-10]，HU等[11]发现LPS可通过激活肺成纤维细胞PI3K-AKT-mTOR信号通路，上调6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2, 6-二磷酸酶3 (6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2, 6-biphosphatase 3，PFKFB3)，加速有氧糖酵解，促进肺成纤维细胞的胶原合成。
WIN55212-2 (WIN)是一种具有抗炎特性的大麻素受体激动剂，研究表明WIN可减轻LPS诱导的人内皮细胞的炎症激活[12]。尚有研究发现WIN可通过miR-29b-3p/FOXO3/PFKFB3信号轴抑制糖酵解，减轻LPS诱导的急性肺损伤(acute lung injury，ALI)[13]。而WIN能否通过抑制有氧糖酵解减轻脓毒症AKI及其与AKT/mTOR/PFKFB3信号通路之间的关系，尚有待探明。因此，本研究采用腹腔注射LPS制备小鼠脓毒症AKI模型，探讨WIN是否可以通过调控AKT/mTOR/PFKFB3信号通路活性，抑制有氧糖酵解，减轻脓毒症小鼠AKI。
1 材料与方法 1.1 实验动物与主要试剂SPF级别6~8周雄性健康C57BL/6小鼠，体质量20~25 g，购自兰州大学实验动物中心[动物许可证号：SCXK(甘)2018-0002]。小鼠正常进食，人工光照和黑暗时间12 h交替，适应性饲养1周后开始实验。LPS购自美国Sigma公司；mTOR激活剂MHY1485购自美国MCE公司；WIN55212-2购自Cayman公司；抗p-AKT、抗p-mTOR抗体均购于博奥森公司；抗PFKFB3抗体购于Abcam公司；IL-18、IL-1β、Scr、KIM-1、LDHA、乳酸酶联免疫吸附(ELISA)测定试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。实验过程中动物处理措施符合伦理学要求，已获兰州大学第一医院伦理委员会批准(LDYYLL2023-320)。
1.2 实验分组与处理24只小鼠按照随机数字表法分为4组(n=6)：①对照组(Control组)；②脓毒症组(LPS组)，腹腔注射LPS(10 mg/kg)[14]；③脓毒症+WIN55212-2组(LPS+ WIN组)，LPS处理前30 min腹腔注射WIN 1 mg/kg[13]；④脓毒症+WIN55212-2+MHY组(LPS+WIN+MHY组)，LPS处理前1 d腹腔注射MHY1485 10 mg/kg[15]，LPS处理前30 min腹腔注射MHY1485 10 mg/kg和WIN 1 mg/kg。Control组和LPS组于上述相同时间腹腔注射等量二甲基亚砜。
1.3 标本采集造模后24 h，戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉小鼠后，将其仰卧于固定板上；剪去心前区毛发并消毒，以食指指腹定位小鼠心脏搏动区; 手持1 mL注射器穿刺心搏最强处，收集足量血液标本。静置30 min后以3 000 r/min，离心15 min，取上清液于-80 ℃冰箱保存。心脏取血后安乐死小鼠。常规剪去毛发、消毒，暴露腹腔; 取小鼠双侧肾脏组织，PBS冲洗; 将一侧肾脏组织固定于4%多聚甲醛溶液(用于病理学观察)；将另一侧肾脏组织于-80 ℃冰箱储存(用于后续实验)。
1.4 HE染色取肾脏组织后，置于4%多聚甲醛中固定48 h，脱水后石蜡包埋、切片、HE染色，显微镜下观察肾脏组织病理结构改变。采用Paller氏评分[16]评估肾小管损伤程度，即在200倍高倍镜下取10个高倍镜视野合计100个肾小管。肾小管明显扩张、细胞扁平(1分)；肾小管内出现管型(2分)；肾小管管腔内有脱落、坏死细胞，但未成管型或细胞碎片(1分)；上皮细胞颗粒变性(1分)；空泡变性(1分)；细胞核固缩(1分)。
1.5 ELISA检测肾脏组织称质量，按照1 g组织加入5 mL PBS的比例加入PBS，在冰水浴中尽量剪碎组织，随后按照每20 mg肾脏组织中加入150~200 μL的RIPA裂解液的比例加入裂解液，在冰上使用匀浆机制备成10%肺组织匀浆。将制备好的10%匀浆使用离心机4 ℃，3 000×g离心10 min，离心后的匀浆取上清液进行分装，-80 ℃放置保存。按照ELISA试剂盒说明书检测肾脏组织匀浆炎症因子IL-1β、IL-18水平以及LDHA的含量。
取出-80 ℃储存的血清，逐级解冻后作为待测样品。按照ELISA试剂盒说明书进行检测。使用酶标仪测定各孔光密度值[D(450)]。Excel绘制标准曲线，计算各样本血清Scr、KIM-1和乳酸的含量。
1.6 Western blot检测取-80 ℃肾脏组织匀浆，蛋白定量，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h，电转移至聚偏二氟乙烯(PVDF) 膜上，洗膜后加入p-AKT、p-mTOR、PFKFB3一抗和β-actin内参蛋白4 ℃孵育过夜。次日洗膜，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗(稀释度均为1∶100 000)37 ℃摇床孵育2 h，含吐温-20的Tris-HCl缓冲盐溶液(TBST) 充分洗膜。电化学发光法显色曝光，采集图像，用Image J软件分析各组条带灰度值，以目标蛋白与内参蛋白的灰度值比值反映目标蛋白相对表达量。
1.7 统计学分析采用Graphpad Prism 8.0软件进行数据分析。实验数据均为计量资料且符合正态分布，以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，2组间比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 小鼠一般状态LPS造模后24 h，Control组小鼠精神状态、饮食、活动、呼吸频率及对刺激的反应较造模之前无明显改变；LPS组小鼠出现发热，心率、呼吸频率明显加快，口鼻腔分泌物增多，精神萎靡，嗜睡，蜷缩，竖毛，少动，拒食或少食，眼角出现分泌物；LPS+WIN组上述表现较LPS组轻微，LPS+WIN+MHY组上述表现较LPS+WIN组明显加重。
2.2 各组小鼠肾脏组织病理结构改变光镜下Control组为正常肾脏组织，肾脏结构完整，无出血和炎症浸润；LPS组肾小管上皮细胞水肿，细胞体积变大，肾小球结构紊乱，肾小管管腔变窄，间质内有明显出血及大量炎症细胞浸润；LPS+WIN组病理改变明显减轻，肾脏结构较完整，间质仅有少量出血及炎症细胞浸润；LPS+WIN+MHY组病理改变较LPS+WIN组加重，肾脏组织结构破坏，间质内出血及炎症细胞浸润增多，见图 1。
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| 图 1 HE染色观察各组小鼠肾脏组织病理变化 |
与Control组相比，LPS组Paller评分明显增高(P＜0.05)；与LPS组相比，LPS+WIN组在WIN预处理后Paller评分明显下降(P＜0.05)；相较于LPS+WIN组，LPS+WIN+MHY组Paller评分升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见图 2。
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| 1：Control组；2：LPS组；3：LPS+WIN组；4：LPS+WIN+MHY组；a：P＜0.05，与Control组比较；b：P＜0.05，与LPS组比较；c：P＜0.05，与LPS+WIN组比较 图 2 各组小鼠肾脏Paller评分(n=6，x±s) |
2.3 各组小鼠肾脏组织IL-1β、IL-18和糖酵解关键酶LDHA含量
ELISA检测结果显示：与Control组相比，LPS组中IL-1β、IL-18、LDHA含量显著升高(P＜0.05)；与LPS组相比，LPS+WIN组在WIN预处理后IL-1β、IL-18、LDHA含量相对下降(P＜0.05)；与LPS+WIN组相比，LPS+WIN+MHY组IL-1β、IL-18、LDHA含量增高，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见图 3。
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| 1：Control组；2：LPS组；3：LPS+WIN组；4：LPS+WIN+MHY组；a：P＜0.05，与Control组比较；b：P＜0.05，与LPS组比较；c：P＜0.05，与LPS+WIN组比较 图 3 ELISA法检测各组小鼠肾脏组织IL-1β(A)、IL-18(B)和LDHA(C)的含量(n=6，x±s) |
2.4 各组小鼠血清肾损伤标志物Scr、KIM-1和糖酵解产物乳酸含量
ELISA检测结果显示：与Control组相比，LPS组Scr、KIM-1、乳酸含量明显增加(P＜0.05)；与LPS组相比，LPS+WIN组Scr、KIM-1、乳酸含量相对下降(P＜0.05)；与LPS+WIN组相比，LPS+WIN+MHY组Scr、KIM-1、乳酸含量增高，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见图 4。
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| 1：Control组；2：LPS组；3：LPS+WIN组；4：LPS+WIN+MHY组；a：P＜0.05，与Control组比较；b：P＜0.05，与LPS组比较；c：P＜0.05，与LPS+WIN组比较 图 4 ELISA法检测各组小鼠血清Scr(A)、KIM-1(B)和乳酸(C)的含量(n=6，x±s) |
2.5 各组小鼠肾脏组织p-AKT、p-mTOR及PFKFB3蛋白表达水平
Western blot检测结果显示：与Control组相比，LPS组p-AKT、p-mTOR及PFKFB3表达显著升高(P＜0.05)；与LPS组相比，LPS+WIN组p-AKT、p-mTOR及PFKFB3表达相对下降(P＜0.05)；相较于LPS+WIN组，LPS+WIN+MHY组p-AKT、p-mTOR及PFKFB3表达增高，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见图 5。
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1：Control组；2：LPS组；3：LPS+WIN组；4：LPS+WIN+MHY组；a：P＜0.05，与Control组比较；b：P＜0.05，与LPS组比较；c：P＜0.05，与LPS+WIN组比较 A：Western blot检测肾脏组织p-AKT、p-mTOR及PFKFB3蛋白表达水平；B：p-AKT蛋白相对表达量；C：p-mTOR蛋白相对表达量；D：PFKFB3蛋白相对表达量 图 5 Western blot检测各组小鼠肾脏组织p-AKT、p-mTOR及PFKFB3蛋白表达水平(n=6，x±s) |
3 讨论
本研究采用腹腔注射LPS的方法制备脓毒症小鼠模型。LPS组小鼠造模后24 h，出现发热，心率、呼吸频率明显加快，口鼻腔分泌物增多，精神萎靡，嗜睡，蜷缩，竖毛，少动，拒食或少食等症状，小鼠肾功能明显下降，肾脏病理损伤加重，炎症因子IL-18、IL-1β水平显著升高，证实LPS脓毒症模型成功。
WIN作为大麻素受体1和2的强效激动剂，在细胞和动物模型中发挥广泛的抗炎作用[17]。本研究发现，LPS+WIN组肾脏结构破坏，间质内出血及炎症因子浸润等病理改变减轻，炎症因子IL-1β、IL-18含量降低，血清肾损伤标志物Scr、KIM-1的含量也明显下降，说明WIN可减轻脓毒症AKI中的炎症反应。PÉREZ-DIEGO等[18]研究也证实，WIN可降低脓毒症小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子水平；FIELDS等[19]研究同样表明，在人类星形胶质细胞中，WIN预先给药可以显著抑制IL-1β诱导的炎症反应。
IL-18作为IL-1超家族的一员，是急性肾损伤的重要介质，可在一定程度上反映肾损伤的水平[20]。KIM-1在急性肾损伤后早期释放，已被广泛用作AKI早期诊断标志物[21]。因此本实验选择肾组织IL-18以及血清KIM-1、Scr用以评估脓毒症AKI小鼠肾功能。
在脓毒症期间，细胞能量代谢从氧化磷酸化转变为糖酵解，这种现象被称为代谢重编程[22]。脓毒症期间有氧糖酵解可以激活炎症小体，释放IL-1β、IL-18和高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)等促炎因子，而限制糖酵解途径可降低脓毒症早期炎症因子的释放，减轻炎症反应[23-24]。LDHA作为糖酵解途径最后一步的关键酶，可催化丙酮酸生成乳酸，而负责乳酸的形成使LDHA成为有氧糖酵解的关键参与者[25]。果糖-2，6-二磷酸(fructose-2, 6-bisphosphate, F-2, 6-BP)是糖酵解限速酶磷酸果糖激酶-1(phosphofructokinase- 1, PFK-1)的强效变构激活剂，PFKFB3可通过调节F-2, 6-BP合成从而在有氧糖酵解中起关键作用[26]。本实验观察到，LPS组LDHA和PFKFB3表达上调，糖酵解终产物血清乳酸生成增加，且伴随着IL-1β、IL-18水平升高，肾脏病理损伤加重，而WIN预处理糖酵解水平下降，炎症因子含量降低，血清Scr、KIM-1也随之下降，肾损伤有所减轻，表明WIN可通过下调糖酵解水平，抑制炎症反应，减轻脓毒症AKI。LUO等[27]研究表明，靶向抑制糖酵解，可降低IL-1β等炎症因子的激活与释放，减轻脓毒症小鼠肝、肾损伤，提高小鼠存活率，这与本实验结果相一致。HE等[13]经体内、体外实验证实，WIN预处理抑制糖酵解，降低肺泡巨噬细胞向促炎的M1表型极化，减少炎症因子释放，减轻脓毒症ALI。
为了阐明其保护机制，本研究在WIN基础上使用mTOR激活剂MHY1485干预小鼠，MHY1485可通过靶向mTOR的ATP结构域，调节该通路活性[28]。结果发现，MHY1485可拮抗WIN对有氧糖酵解的抑制作用，肾脏糖酵解水平重新升高，炎症因子含量升高，肾脏病理损伤加重，p-AKT、p-mTOR及PFKFB3的表达较LPS+WIN组明显升高。因此我们推测WIN可能通过抑制AKT/mTOR/PFKFB3信号通路激活，下调糖酵解水平，减轻肾脏组织炎症反应。既往研究表明AKT-mTOR信号通路可通过调控下游效应分子，调节细胞生长、增殖和有氧糖酵解[29]。AKT的激活可以动员葡萄糖转运蛋白(glucose transporter, GLUT)，激活己糖激酶2(hexokinase2, HK2)，从而增强有氧糖酵解和促进癌细胞生长[30]。mTOR可上调PFKFB3的表达加速糖酵解速率[31]。这些研究结果与本实验高度一致。最新研究也发现，WIN能够抑制LPS诱导的AKT和p70S6K(mTOR的主要下游作用靶点)的磷酸化，表明WIN可以抑制LPS诱导的人单核细胞来源的树突状细胞mTOR的活化，从而通过激活自噬抑制代谢重编程，促进调节性T细胞的产生，保护小鼠抵抗LPS诱导的脓毒症[32]。
本研究也存在一定局限性，实验仅在动物模型观察WIN在脓毒症AKI中的作用，未在细胞水平进一步验证。WIN也可能通过其他信号通路发挥脓毒症保护作用，还需进一步研究。
综上所述，WIN55212-2可以减轻脓毒症AKI，其机制可能是通过抑制AKT/mTOR/PFKFB3信号通路，降低肾脏糖酵解水平，减轻炎症反应。
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