地中海贫血又称珠蛋白生成障碍性贫血，是一种常染色体隐性遗传病，可造成血红蛋白组成成分改变，出现贫血及慢性溶血。世界范围内约有5%的人群是α-地中海贫血的携带者^[1]。根据受累珠蛋白链的不同分为α、β、б、бβ、γβ，临床上常见类型是α型和β型。在我国南方地区，α-地中海贫血基因缺陷的携带率处于高水平，如广东、广西、海南分别报道有19.46%、32.22%、17.74%的携带率^[2-4]。在我国南方以SEA缺失型、3.7缺失型与4.2缺失型3种缺失类型最为常见^[5]。当夫妇双方均为SEA型(α⁰)基因携带者时，其子代出现重型地中海贫血(巴氏胎儿水肿综合征)的概率为25%，其是由于4个α-珠蛋白(-/-)合成基因的缺失，完全无α-珠蛋白肽链的合成所引起的。胎儿大多于妊娠23~38周死亡或分娩后数小时内死亡，少数可存活至出生后数天。胎儿临床表现为重度水肿、肝脾肿大、胸腹腔积液等，母亲则可能出现水肿、妊高症、镜像综合征等并发征。通过检测技术在孕期就对罹患巴氏胎儿水肿综合征胎儿进行确诊并将其选择性引产^[6]，可减少母亲并发症及心理创伤。通过有创性产前诊断技术获取胎儿样本，并利用Gap-PCR检测技术进行缺失型α-珠蛋白基因分型是目前最有效和普遍的方式^[7-8]。然而，有创性的胎儿取材手术始终存在一定程度的风险(如导致羊水渗漏、出血、宫内感染、胎儿心动过缓、胎膜早破、绒毛膜炎、及流产等)^[9-10]。

自LO等^[11]发现在孕妇外周血中存在胎儿游离DNA(cell-free fetal DNA, cffDNA)以来，利用cffDNA进行无创性产前筛查成为了可能。当前，以cffDNA作为检测模板最为成熟的技术是进行T13/T18/T21非整倍体的检测^[12-14]，它可在孕中期就给予染色体非整倍体存在的风险提示，以决定是否通过产前诊断进行确诊^[15]。

近年来，cffDNA进行单基因遗传病诊断的研究广受关注^[16-19]。cffDNA的技术需要高通量测序作为检测平台，因为血浆游离DNA中含有高比例的母源性游离DNA，而大多数技术平台难以解决母源性DNA的对结果判读的干扰。与目前cffDNA进行非整倍体检测的方法不同在于，非整倍体畸变的检测无需进行靶基因的富集，仅通过相对剂量即可分辨非整倍体异常。而本研究的方法需要进行杂交捕获后的深度测序，分析α-珠蛋白基因的探针丰度来评价巴氏胎儿水肿综合征的概率。

如能通过母亲外周血的无创性检测方法对巴氏胎儿水肿综合征进行预测，不仅能够减少有创手术的风险，还能将产前干预时间前移。基于此，本研究将利用高通量测序与杂交捕获技术，cffDNA对巴氏胎儿水肿综合征(--^SEA/--^SEA)进行预测，以减少非必要的产前诊断，并提供一种新型遗传学检测手段。

1 材料与方法 1.1 样本来源与前处理

样本来自2021年11月至2022年11月海口市妇幼保健院、海南省妇女儿童医学中心、海南医学院第一附属医院因夫妻双方为东南亚型α-地中海贫血(--^SEA/αα)而需要进行产前诊断的孕妇(孕12~24周，均为单胎妊娠)，共34例。第一阶段：采集孕妇外周血6 mL(孕12~24周采集，并采用EDTA抗凝的DNA保存管为收集容器)，均在孕12~24周内采集样本，并在采集样本24 h内对样本进行血浆分离等预处理，冻存于-80 ℃。采集配偶外周血2 mL，用于验证α-地中海贫血基因型。第二阶段：孕妇在孕16周后进行羊膜腔穿刺，取6 mL羊水进行胎儿α-地中海贫血基因分型。本研究受海口市妇幼保健院医学伦理委员会审核批准([2021]01001)。

1.2 血浆分离与游离DNA的提取

采血管1 600×g、4 ℃离心15 min，吸取＞2.4 mL血浆。血浆16 000×g、4 ℃离心10 min，吸取2.4 mL血浆上清，备用。根据无创产前胎儿重型α地中海贫血基因检测试剂盒(东莞博奥木华基因科技有限公司)说明书进行操作。大致步骤为：2.4 mL血浆利用核酸提取试剂盒提取游离DNA，提取的每个样本的质量需＞10 ng，并用于文库构建。

1.3 文库构建与杂交捕获

对游离DNA进行末端修复；产物进行纯化后利用特异性接头UP1及标签UX进行连接(不同样本标记以不同标签)，产物纯化后进行PCR扩增，条件为72 ℃ 5 min，98 ℃ 3 min，1个循环；98 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，13个循环；72 ℃ 1 min，1个循环。纯化后即得样本的初始文库，完成文库构建的操作。

将≤16例(不同标签)的样本按900 ng反应质量进行等量混合后，采用真空浓缩仪将体积浓缩至3.4 μL，并添加杂交封闭液进行变性(95 ℃ 2 min，65 ℃ 2 min)；同时准备杂交缓冲液(65 ℃ 2 min)，连同α-珠蛋白特异性探针进行杂交捕获(该探针在HBA1、HBA2及其上下游区域20 000 bp内设计约2 000探针)，经纯化、洗涤后即得α-珠蛋白特异性探针捕获后的混合文库。

1.4 测序与结果分析

历经模板制备与富集后在Ion Proton平台(BioelectronSeq 4000基因测序仪，半导体测序)上进行测序，测序flows数为400。对捕获的DNA进行深度测序，分析插件采用SEA_plugin(东莞博奥木华基因科技有限公司)。结果判读方法，通过对测序区间所得拷贝数分布并结合cffDNA浓度进行分析，采用多维贝叶斯概率模型评估胎儿患巴氏胎儿水肿综合征的概率。通过插件返回的可视化图形中，以测序探针数作为横坐标，测序深度为纵坐标，根据数据解析的结果作图。将SEA杂合子作为比较基准(1.0)，当母体的基因型为--^SEA/αα时，样本测序数据线在基线处离散，判读为SEA杂合子；若数据线向1.5偏移，视为区域内测得探针数量增加一倍，判读为野生型；若数据线向0.5偏移，视为区域内未结合探针数量减少一倍，判读为SEA纯合子；随着探针数量的增加，其SEA纯合突变型的探针数据线会显著向下(0.5)偏移；野生型则会显著向上(1.5)偏移。探针数量的增加具有判读结果的意义，在不同探针数量的结果下对判读数据线的偏移更加准确。母亲基因型(缺失型)会影响数据线的偏移，特别是母亲为双缺失型(-/-α)情况下，-α与SEA缺失重叠区域会向0偏移，造成对胎儿基因型判读的干扰，但由于两者非重叠区域的存在，依旧能够得到一定程度的判读。

1.5 Gap-PCR对羊水DNA进行基因分型与结果对比

采用α-地中海贫血基因检测试剂盒[亚能生物技术(深圳)有限公司]，根据说明书对胎儿羊水DNA进行基因分型，该试剂盒采用Gap-PCR作为技术原理。PCR程序为96 ℃ 15 min，1个循环；98 ℃ 45 s，64 ℃ 1.5 min，72 ℃ 3 min，35个循环；72 ℃ 5 min，1个循环。PCR产物用琼脂糖凝胶进行电泳，在染色后置于UV下检测目的条带。待羊水DNA进行α-地中海贫血基因分型后，以“结果符合率=cffDNA基因分型与羊水DNA分型一致的例数/羊水DNA分型的总例数×100%”来评价利用cffDNA进行α-地中海贫血基因分型的准确性。

2 结果 2.1 cffDNA进行α-珠蛋白基因分型

共收集符合入组条件的孕妇外周血样本34例，其中29对夫妻双方基因型为--^SEA/αα，2例夫妻基因型分别为--^SEA/αα与--^SEA/-α^3.7，1例夫妻基因型分别为--^SEA/αα与--^SEA/-α^4.2，1例夫妻基因型分别为--^SEA/-α^3.7与--^SEA/αα，1例夫妻基因型分别为--^SEA/-α^4.2与--^SEA/αα。在利用cffDNA的检测中，共有7例鉴定为--^SEA/--^SEA(图 1A)，17例鉴定为--^SEA/αα(图 1B)，8例鉴定为αα/αα(图 1C)，1例鉴定为-α^3.7/αα(图 1D)，1例鉴定失败。

在测序质控上，有3例鉴定为--^SEA/αα的样本质控并不理想；1例鉴定为--^SEA/--^SEA的样本结论处于阳性值灰区伴胎儿浓度低；1例因母亲为--^SEA /-α^4.2，在基因型背景下无法判断正确的胎儿基因型。

2.2 胎儿羊水DNA进行α-珠蛋白基因分型及妊娠结局

共32名孕妇进行了产前诊断，抽取羊水进行α-珠蛋白基因分型，图 2展示本研究中所鉴定的基因型。其中5名鉴定为--^SEA/--^SEA (泳道5)，18名鉴定为--^SEA/αα(泳道4)，6名鉴定为αα/αα(泳道3)，2名鉴定为-α^3.7/αα(泳道1)，1名鉴定为--^SEA/-α^4.2 (泳道2)。上述案例的妊娠结局，其中5名基因型为--^SEA/--^SEA均终止妊娠、1名因其他原因终止妊娠，其余分型结果均为活产。

2.3 cffDNA与胎儿羊水进行α-珠蛋白基因分型结论比较

收集到34例孕妇外周血样本，仅32例收集到羊水样本。在这32例中，28例羊水的分型结果与cffDNA分型结果一致，4例结果不一致，结果符合率为87.5%(表 1)。不符合的4例结果中，2例测序结果判读为--^SEA/--^SEA质控结果不理想，其羊水DNA分型结果为--^SEA/αα；而另外2例则是因为孕妇基因型为--^SEA/-α^4.2或配偶基因型为--^SEA/-α^3.7，使得结果判读受影响。若排除5例孕妇或其配偶一方为--^SEA/-α^3.7、--^SEA/-α^4.2的案例，其结果符合率上升为92.6%(25/27)。

3 讨论 3.1 cffDNA判别巴氏水肿胎的方法与模型

地中海贫血是一种在我国南方地区高发、高携带的单基因遗传病，产前诊断是避免重型地中海贫血患儿出生的最有效途径^[10]。羊膜腔穿刺等有创性手术方法存在一定程度的风险，如能采用无创性基因分型方法，能够在一定程度上避免有创性手术造成的危害。自cffDNA在母体外周血中发现以来，已有研究者针对巴氏水肿胎无创性检测手段进行了报道。WINICHAGOON等^[20]对10例孕10~26周的孕妇进行巴氏水肿胎的无创性检测，结果与羊水DNA检测结果一致。该方法对孕妇外周血进行细胞分选，随即使用抗-α-珠蛋白链抗体对分选细胞进行免疫荧光染色，并在荧光显微镜下观察得出结果。然而，这种方法需要通过细胞形态学及细胞大小对母体细胞进行区分，对技术人员的水平要求较高，并且难以区别SEA杂合子与正常的结果。YAN等^[21]对SEA缺失区域的9个特定SNP进行分析，鉴定cffDNA是否存在父源性SNP的方案，在67例妊娠中准确排除了SEA纯合缺失33例。陈芳等^[22]采用父母子2+1的SNP构建单体型的分析方法，并分析了10例孕13~22周的孕妇外周血，结果显示，孕妇外周血分型结果有9例与羊膜腔穿刺后羊水DNA的分型结果一致(90%)。YANG等^[23]将涉及缺失型α-地中海的413例训练样本及465例测试样本的孕妇外周血采用标签捕获测序技术与改良贝叶斯模型方法进行巴氏水肿胎的检测，两者的综合敏感性与特异性分别可达到98.98%和96.06%。

母体血浆中cffDNA仅以少量比例存在，采用传统的检测方法难以获得准确的分型结果，因此基于cffDNA的检测手段主要以高通量测序作为检测平台。主要采用单体型相对剂量模型(relative haplotype dosage, RHDO)以及突变位点相对剂量模型(relative mutation dosage, RMD)进行。RHDO主要选用与基因连锁的SNP作为检出对象，当夫妻双方特定SNP位点展现为不同碱基时，可作为不同单体型的标记。SNP与野生型链及突变型链之间的连锁关系需要通过先证者或夫妻双方父母进行单体型构建分析。通过比较cffDNA中特定位置的碱基构成，可以判别胎儿是否遗传到父母双方的异常链。RMD模型需要对突变位点进行相对剂量分析，可采用qPCR、巢式PCR等比较胎儿与母亲在突变位置的相对拷贝数^{[10, 24]}。本研究方法的本质为RMD的改良模型。基线1.0以SEA杂合子作为基准，当曲线向1.5偏移时，cffDNA中αα比例增加，判断cffDNA为αα/αα；当曲线向0.5偏移时，测序样本中SEA比例增加，判断cffDNA为--^SEA/--^SEA。32例结果有28例羊膜腔穿刺后羊水DNA基因分型结果一致，若仅考虑双方--^SEA/αα基因型的案例，则结果符合率为92.6%。

3.2 特点、局限性及后续改进

本研究直接采用孕妇血浆cffDNA进行深度测序来进行基因分型。抽取配偶外周血仅为了保证α-珠蛋白基因分型的准确性，所构建的巴氏水肿胎的分型方法无需像RHDO模型那样需要建立父母子三者的α-珠蛋白区域单体型；另一方面，基于RHDO的父母子三者的单体型构建不仅测序成本提高，并且先证者往往夭折，造成基因组信息丢失而无法实现检测。通过在特异性探针数量增加的测序分析中，以拷贝数的曲线判断cffDNA基因型。这就意味着仅凭借母体外周血血浆作为检测样本，就能够实现对胎儿3种α-珠蛋白基因型进行判断(αα/αα、--^SEA/αα以及--^SEA/--^SEA)。随着无创产前检测染色体非整倍体畸变的普遍临床应用的推进，对于夫妻双方为SEA携带的患者几乎可同时进行非整倍体畸变及巴氏水肿胎的检测。此外，随着该方法的实施与发展，将可能大量减少有创产前诊断手术的实施。

本研究仍有进行后续改进的必要，相较于依赖父母SNP单体型构建的RHDO分析方法而言，本研究虽然无需构建单体型，但在使用范围上比前者狭窄。体现为仅对双方--^SEA/αα的胎儿基因型的判断具有高水平准确性，而在母体基因型为--^SEA /-α^3.7或--^SEA/-α^4.2时存在判读困难而造成基因分型的误判。其原因为大量探针在SEA缺失型、3.7缺失型与4.2缺失型的缺失重叠区域失去结合，从而造成探针数量的大幅度减少。而在非缺失重叠区域仍存在部分探针能够进行结果判读，并非完全失去了判别能力。在后期方案的的改进上，或能通过对三者断点区域设计更多探针进行深度测序，来提高基因型判别的准确性^[25]，或是如RHDO方法增加测定cffDNA中父源性SNP。虽本研究在方法学上仍存在需改进的内容，但以现有研究结果来看，依旧对巴氏水肿胎的早期诊断(12~16周)有较重要的临床意义。