心肌细胞肥大在心脏受到各种刺激时产生，而在对心肌细胞刺激长期存在情况下，往往会导致心肌肥厚(cardiac hypertrophy，CH)[1]。CH可分为生理性和病理性，生理性心肌肥厚主要是由于运动、怀孕等因素所导致，如适当的运动可使心肌细胞增大，加强心肌细胞抗凋亡的能力，从而保护心脏组织，是一种有益的、可逆的CH；而病理性心肌肥厚的发生常与肥胖、糖尿病、高血压、心肌缺血缺氧等疾病相关，当心肌细胞处于持续的病理性刺激下，导致心肌细胞无法维持正常功能而产生代偿性肥厚，而持续的心肌肥厚则会造成心力衰竭，甚至会导致猝死，给患者健康造成威胁[2-3]。目前还没有治疗的特效药，故阐明CH的发病机制，找到对CH具有调节作用的关键靶点十分重要。
E26转化特异性因子(E26 transformation-specific，ETS)家族包含30多个成员，是细胞内较大转录调控因子家族之一，具有促进细胞分化、增殖、抑制凋亡和细胞间相互作用等功能[4]。而弗莱德白血病病毒整合位点-1(Friend leukemia virus integration-1，FLI-1)作为ETS家族的转录因子，可能与细胞增生、凋亡、肿瘤发生及血管形成有关[5]。已知FLI-1降低可诱导心脏肥大和纤维化的发生[6]。且FLI-1能够在肿瘤细胞中通过调节Klotho的表达而抑制肿瘤生长[7]。Klotho作为近年来发现的具有抗衰老作用的基因，不仅具有调节氧化应激、钙磷代谢及钙离子通道的作用，而且还能对心血管系统功能进行调控[8]。研究证实，体内Klotho表达降低会导致心肌细胞肥大和心脏纤维化增加，从而导致心力衰竭[9]。Klotho可通过调节胰岛素生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)通路从而减轻高血压、心肌肥大及心肌纤维化等心脏不良症状[10]。而胰岛素生长因子-1受体(insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R)/Gi/PLC途径与CH的形成密切相关，IGF-1R作为胰岛素生长因子受体，能够通过激活Gi促进PCL表达，最终导致CH的形成。但目前还未见FLI-1作用IGF-1R/Gi/PLC途径在CH的相关报道，故本研究建立心肌细胞(H9c2)肥大模型，在H9c2肥大细胞中过表达FLI-1和沉默Klotho，探究FLI-1通过Klotho介导IGF-1R/Gi/PLC途径对心肌细胞肥大的影响。
1 材料与方法 1.1 细胞株和主要试剂大鼠心肌细胞(H9c2)购自武汉普诺赛生命科技有限公司；DMEM高糖培养基购自塞维尔生物科技有限公司；胎牛血清购自上海龙田生物科技有限公司；双抗、胰酶购自Biosharp公司；异丙肾上腺素盐酸盐购自上海麦克林生化科技股份有限公司；Annexin V-APC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；RiboFectTMCP Transfection Kit购自广州锐博生物科技有限公司；LipofectamineTM 2000 Transfection Reagent购自美国赛默飞世尔科技公司；Bax、Bcl-2、BNP、IGF-1R、NPPA、PLCG1、β-MHC、β-actin等兔克隆抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；Caspase3、生物素化山羊抗兔IgG(H+L)购自美国affinity公司；cleaved-Caspase3兔克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；GNAI1兔克隆抗体购自英国Abcam公司。
1.2 细胞培养将H9c2细胞冻存管从液氮罐中取出，在37 ℃水浴锅中融化细胞，离心，在超净工作台中弃上清后加入含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基，混匀后加入培养瓶中，置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养，待细胞生长至生长对数期时，进行传代，将细胞转入超净工作台中，用PBS洗涤2次，加入胰酶消化25 s，后弃胰酶加入带血清的培养基终止消化，将细胞吹打下来后加入培养基并以1 ∶2的比例进行传代培养。
1.3 心肌细胞肥大模型的构建将H9c2细胞以3×105/孔接种于6孔板中，在细胞中加入浓度为10 μmol/L的异丙肾上腺素(isoproterenol，ISO)，37 ℃，5% CO2孵育24 h，建立H9c2细胞肥大模型[11]，根据细胞凋亡率和心肌细胞肥大面积判定建模成功与否。
1.4 细胞分组及转染为验证FLI-1对心肌细胞凋亡的影响，将细胞分为对照组、模型组、模型+NC Vector组、模型+pcDNA-FLI-1组；为验证沉默Klotho介导FLI-1过表达对心肌细胞凋亡的影响，将细胞分为对照组、模型+NC Vector+NC siRNA组、模型+NC Vector+Klotho siRNA组、模型+pcDNA-FLI-1+NC siRNA组和模型+pcDNA-FLI-1+Klotho siRNA组。对照组不做任何处理；模型组建立H9c2细胞肥大模型；模型+NC Vector组、模型+ pcDNA-FLI-1组按照转染试剂盒说明书分别转染FLI-1的空载体及质粒；模型+NC Vector+NC siRNA组、模型+NC Vector+Klotho siRNA组、模型+pcDNA-FLI-1+NC siRNA组和模型+pcDNA-FLI-1+Klotho siRNA组等分别转染FLI-1的空载体及FLI-1质粒和Klotho siRNA，培养48 h。
1.5 流式细胞术检测细胞凋亡吸取细胞上清至对应离心管中备用，将各组细胞用PBS洗涤，用不含EDTA的胰酶消化，依次加入收集的细胞上清终止消化并将细胞收集各组细胞，250×g离心弃上清，加入PBS洗涤并将悬液转入1.5 mL EP管中，250×g离心弃上清，加入500 μL的Binding Buffer对细胞重悬，后依次加入5 μL Annexin V和PI混匀，室温避光反应15 min，用流式细胞仪进行检测。用CytExpert软件分析流式凋亡结果。
1.6 鬼笔环肽染色观测细胞肥大将各组细胞弃上清，4%的多聚甲醛固定15 min后PBS洗涤3次，用0.5% Triton X-100透化10 min，PBS洗涤3次；滴加山羊血清封闭液室温孵育20 min；然后用FITC-鬼笔环肽室温避光孵育30 min，倒置荧光显微镜观察结果，采用Image J软件测量心肌细胞表面积，以反映心肌细胞肥大程度。
1.7 Western blot检测蛋白表达水平对各组H9c2细胞用蛋白试剂盒提取总蛋白，用BAC蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，后通过SDS-凝胶电泳、转膜、封闭，后加入稀释后的一抗(BNP 1 ∶2 000；NPPA 1 ∶2 700；β-MHC 1 ∶2 000；Bax 1 ∶2 000；Caspase3 1 ∶1 000；Bcl-2 1 ∶2 000；cleaved-Caspase3 1 ∶1 000、IGF-1R 1 ∶2 000；GNAI1 1 ∶10 000；PLCG1 1 ∶2 000；β-actin 1 ∶50 000)，4 ℃孵育过夜，加入二抗[生物素化山羊抗兔IgG(H+L)]，室温孵育2~3 h，ECL显色试剂盒显色后用凝胶成像仪拍照。以β-actin作为内参，计算目的蛋白的相对表达量。
1.8 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件进行分析。计量资料以x±s表示，两两比较采用t检验，多样本均数间比较采用单因素方差分析，以P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 FLI-1对ISO诱导的H9c2细胞的影响 2.1.1 FLI-1对心肌细胞凋亡的影响流式细胞术检测FLI-1对H9c2细胞凋亡的影响见图 1A、B，与对照组相比，模型组H9c2细胞凋亡率增加(P < 0.01)；与模型+NC Vector组相比，模型+pcDNA-FLI-1组H9c2细胞凋亡率降低(P < 0.01)。Western blot检测结果显示，与对照组相比，模型组细胞中Bax/Bcl-2、cleaved-Caspase3/Caspase 3等凋亡相关蛋白表达增加(P < 0.05或P < 0.01，图 1C)；与模型+NC Vector组相比，模型+pcDNA-FLI-1组细胞中Bax/Bcl-2、cleaved-Caspase3/Caspase 3等凋亡相关蛋白表达降低(P < 0.05或P < 0.01，图 1C)。
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1：对照组；2：模型组；3：模型+NC Vector组；4：模型+pcDNA-FLI-1组；a：P < 0.05，b：P < 0.01 A、B：流式细胞仪检测各组细胞凋亡；C：Western blot检测各组细胞凋亡相关蛋白表达及半定量分析 图 1 FLI-1降低ISO诱导的H9c2细胞凋亡 |
2.1.2 FLI-1对心肌细胞肥大的影响
鬼笔环肽染色检测各组H9c2细胞的肥大程度见图 2A、B，与对照组相比，模型组H9c2细胞表面积增大(P < 0.01)，与模型+NC Vector组相比，模型+pcDNA-FLI-1组H9c2细胞表面积降低，恢复为正常细胞大小(P < 0.01)。Western blot检测结果显示，与对照组相比，模型组细胞中BNP、NPPA和β-MHC等肥大相关蛋白的表达显著增加(P < 0.01，图 2C)；与模型+NC Vector组相比，模型+pcDNA-FLI-1组细胞中BNP、NPPA和β-MHC等肥大相关蛋白的表达降低(P < 0.05，图 2C)。
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1：对照组；2：模型组；3：模型+NC Vector组；4：模型+pcDNA-FLI-1组；a：P < 0.05，b：P < 0.01 A：鬼笔环肽染色观察细胞肥大程度；B：各组心肌细胞表面积分析；C：Western blot检测肥大相关因子蛋白表达及半定量分析 图 2 FLI-1对心肌细胞肥大的影响 |
2.1.3 FLI-1对ISO诱导的H9c2细胞中IGF-1R/Gi/PLC途径活性的影响
结果见图 3，与对照组相比，模型组H9c2细胞中IGF-1R、GNAI1和PLCG1表达增加(P < 0.05或P < 0.01)；与模型+NC Vector组相比，模型+pcDNA-FLI-1组细胞中IGF-1R、GNAI1和PLCG1表达降低(P < 0.05或P < 0.01)。
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| A：Western blot检测结果 1：对照组；2：模型组；3：模型+NC Vector组；4：模型+pcDNA-FLI-1组；B：半定量分析 a：P < 0.05，b：P < 0.01 图 3 FLI-1抑制ISO诱导的H9c2细胞中IGF-1R/Gi/PLC表达 |
2.2 沉默Klotho介导FLI-1过表达对心肌细胞的影响 2.2.1 沉默Klotho介导FLI-1过表达对心肌细胞凋亡的影响
流式细胞术检测沉默Klotho介导FLI-1过表达对心肌细胞凋亡结果见图 4A、B，与模型+NC Vector+NC siRNA组相比，模型+NC Vector+Klotho siRNA组H9c2细胞凋亡率增加(P < 0.01)；与模型+pcDNA-FLI-1+NC siRNA组相比，模型+pcDNA- FLI-1+Klotho siRNA组H9c2细胞凋亡率增加(P < 0.01)。Western blot检测结果显示，与模型+NC Vector+NC siRNA组相比，模型+NC Vector+Klotho siRNA组细胞中Bax/Bcl-2、cleaved-Caspase3/Caspase 3等凋亡相关蛋白表达增加(P < 0.05，图 4C)；与模型+pcDNA-FLI-1+NC siRNA组相比，模型+pcDNA-FLI-1+Klotho siRNA组细胞中Bax/Bcl-2、cleaved-Caspase3/Caspase 3等凋亡相关蛋白表达增加(P < 0.05或P < 0.01，图 4C)。
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1：对照组；2：模型+NC Vector+NC siRNA组；3：模型+NC Vector+Klotho siRNA组；4：模型+pcDNA-FLI-1+NC siRNA组；5：模型+pcDNA-FLI-1+Klotho siRNA组；a：P < 0.05，b：P < 0.01 A：流式细胞仪检测细胞凋亡；B：各组凋亡率分析；C：Western blot检测细胞凋亡相关蛋白表达及半定量分析 图 4 沉默Klotho介导FLI-1过表达对心肌细胞凋亡的影响 |
2.2.2 沉默Klotho介导FLI-1过表达对心肌细胞肥大的影响
鬼笔环肽染色检测各组H9c2细胞的肥大程度见图 5A、B，与模型+NC Vector+NC siRNA组相比，模型+NC Vector+Klotho siRNA组H9c2细胞表面积增大(P < 0.05)，与模型+pcDNA-FLI-1+NC siRNA组相比，模型+pcDNA-FLI-1+Klotho siRNA组H9c2细胞表面积增大(P < 0.01)。Western blot检测结果显示，与模型+NC Vector+NC siRNA组相比，模型+NC Vector+Klotho siRNA组细胞中BNP、NPPA和β-MHC等肥大相关蛋白的表达显著增加(P < 0.01，图 5C)；与模型+pcDNA-FLI-1+NC siRNA组相比，模型+pcDNA-FLI-1 +Klotho siRNA组细胞中BNP、NPPA和β-MHC等肥大相关蛋白的表达增加(P < 0.05或P < 0.01，图 5C)。
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1：对照组；2：模型+NC Vector+NC siRNA组；3：模型+NC Vector+Klotho siRNA组；4：模型+pcDNA-FLI-1+NC siRNA组；5：模型+pcDNA-FLI-1+Klotho siRNA组；a：P < 0.05，b：P < 0.01 A：鬼笔环肽染色观察细胞肥大程度；B：各组心肌细胞表面积分析；C：Western blot检测肥大相关蛋白的表达及半定量分析 图 5 沉默Klotho介导FLI-1过表达对心肌细胞肥大的影响 |
2.2.3 沉默Klotho介导FLI-1过表达对IGF-1R/Gi/PLC途径活性的影响
结果见图 6，与模型+NC Vector+NC siRNA组相比，模型+NC Vector+Klotho siRNA组细胞中IGF-1R、GNAI1和PLCG1表达增加(P < 0.05)；与模型+pcDNA-FLI-1+NC siRNA组相比，模型+pcDNA-FLI-1+Klotho siRNA组细胞中IGF-1R、GNAI1和PLCG1表达增加(P < 0.05)。
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| A：Western blot检测结果 1：对照组；2：模型+NC Vector+NC siRNA组；3：模型+pcDNA-FLI-1+NC siRNA组；4：模型+NC Vector+Klotho siRNA组；5：模型+pcDNA-FLI-1+Klotho siRNA组；B：半定量分析 a：P < 0.05 图 6 沉默Klotho介导FLI-1过表达对IGF-1R/Gi/PLC途径活性的影响 |
3 讨论
心肌肥大是造成心血管疾病如高血压、主动脉狭窄和冠状动脉缺血等疾病发生的关键因素，作为心脏的一种代谢性补偿途径，会增加心脏氧气消耗，引起冠状动脉供氧不足，导致心衰的发生[12]。其发生过程中常伴随着胎儿基因(BNP、NPPA和β-MHC)表达、心脏收缩功能障碍及心肌间质纤维化增加[13]。心肌肥大可由多种因素诱导，ISO作为制备心肌肥大模型的常用药物，能够通过激动心脏β受体而导致心肌细胞发生氧化应激、炎症因子及细胞凋亡增加，造成心肌细胞肥大[14]。本研究通过在心肌细胞中加入ISO建立心肌细胞肥大模型，结果显示模型组心肌细胞中细胞凋亡及心肌肥大程度增加，表示建模成功。
FLI-1在多种癌症细胞(乳腺癌、白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等)中起着重要作用，与细胞的增殖、凋亡、血管生成及免疫调节相关。近来研究证实，FLI-1与心血管疾病密切相关，如TANAKA等[15]研究证实在小鼠体内FLI-1表达缺失会导致小鼠心肌细胞的凋亡和细胞死亡。在心肌肥大的过程中往往伴随着心肌细胞凋亡，心肌细胞能够通过凋亡的形式清除受损细胞来维持细胞平衡，包含Bcl-2和Caspases家族[16]。Bcl-2主要通过线粒体凋亡途径维持促凋亡(如Bax)/抗凋亡(如Bcl-2)因子的平衡来对凋亡进行调节[17]。Caspases作为凋亡的执行者，当其在内源性通路中激活会导致PARP降解，最终诱导凋亡的发生[18]。故验证FLI-1对心肌细胞肥大及凋亡的作用十分重要，本研究通过对心肌细胞肥大和凋亡指标检测结果显示，FLI-1过表达后，心肌细胞中肥大(BNP、NPPA和β-MHC)及凋亡(Bax/Bcl-2、cleaved-Caspase3/Caspase3)等相关蛋白的表达降低，表示过表达FLI-1具有降低心肌细胞肥大及凋亡的作用。
Klotho是一种抗衰老基因，主要在肾脏远端小管上皮细胞和脑脉络丛中表达。研究证实Klotho具有调节心肌肥大的作用。研究表明，Klotho可通过抑制TGF-β1通路减轻小鼠心肌肥大、纤维化及心脏功能障碍[19]。Klotho缺乏加重异丙肾上腺素诱导的病理性心肌肥大和重塑，而Klotho过表达缓解异丙肾上腺素诱导的心脏病理改变，并改善其长期存活率[20]。Klotho可调节FGF信号、胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)和Wnt等通路的激活[21]。其中IGF-1R与心脏的生理生长有关，可参与生理性和病理性心脏肥大，当细胞中IGF-1R含量增加时会通过调节下游因子促进心肌细胞肥大加剧[22]。本研究结果显示沉默Klotho的表达后，心肌细胞中IGF-1R、GNAI1和PLCG1表达增加，表明沉默Klotho的表达会逆转过表达FLI-1对细胞肥大的治疗作用，从而增加心肌细胞肥大程度。
综上所述，本研究提示FLI-1可能通过上调Klotho来抑制IGF-1R/Gi/PLC表达，减轻心肌细胞凋亡及心肌细胞肥大，为心肌肥大的治疗提供潜在的治疗靶点。
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