肺癌是导致癌症相关死亡的主要因素之一，每年约有180万人死于肺癌[1]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占肺癌的85%，主要包含肺腺癌与肺鳞癌2种病理学分型。其中，肺腺癌占NSCLC的50%左右[2]。近20年来，尽管靶向治疗及免疫治疗带来了肺腺癌临床治疗实践的革新，但肺腺癌患者5年生存率的提高仍然有限[3]。因此，寻找新的肺腺癌治疗靶点至关重要。
Holliday交叉识别蛋白(Holliday junction recognition protein，HJURP)是着丝粒蛋白-A (centromere protein-A, CENP-A)的分子伴侣。基于人细胞的研究证实，HJURP紧密调控染色体分离及细胞分裂过程[4]。KATO等[5]报道HJURP对肿瘤细胞有调控作用，证实其在癌细胞染色体稳定性和存活中起维持作用。研究表明，HJURP基因与多种癌症的不良预后相关，如膀胱癌[6]、前列腺癌[7]等。HJURP对肿瘤发生发展起促进作用，例如，HJURP可以通过介导p21失稳导致肝细胞癌增殖增加[8]；HJURP可以通过上调鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1，SPHK1)促进肝细胞癌肿瘤细胞上皮间质转化[9]。
既往研究表明，高表达HJURP与肺腺癌患者预后不良密切相关[10-11]。然而，HJURP对肺腺癌肿瘤细胞增殖调控作用仍不清楚。因此，本研究首先探讨肺腺癌中HJURP的表达情况及其与患者预后之间的相关性，并以2种典型的肺腺癌细胞系为对象，观测HJURP基因表达对于肺腺癌细胞增殖水平的影响，探讨FOXM1对HJURP的调控作用及机制，以期为基于HJURP的肺腺癌治疗策略提供新的理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株人肺腺癌细胞系H1299及SPC-A1，均从上海中科院细胞库购买获得。
1.1.2 组织样本临床样本(包括肿瘤组织及配对正常肺组织样本)收集自2019年2月至2020年5月火箭军特色医学中心胸外科接受肺癌根治术的NSCLC患者，共17例。样本采用液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存。患者年龄58~71岁，中位年龄为65岁。患者在术前未接受任何治疗。获取的样本组织有肺腺癌12例(男性7例，女性5例)、肺鳞癌5例(男性4例，女性1例)。本研究得到中国人民解放军火箭军特色医学中心伦理委员会批准(KY209002)，且所有患者知情同意。
1.1.3 主要仪器与试剂Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Thermo Fisher Scienticfic公司；HJURP-RNAi-慢病毒靶点序列：GUAUUGGAGUGUCUACAGA(中国吉凯基因公司)，载体信息：hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin；HJURP敲低siRNA1序列1：GUAUUGGAGUGUCUACAGA；HJURP敲低siRNA1序列2：GACUAAUAAAGGAAAGAAA；FOXM1敲低siRNA1序列：CCAACAAUGCUAAUAUUCACA；FOXM1敲低siRNA2序列：GGAUCAAGAUUAUUAACCA；兔抗人FOXM1抗体(克隆号D3F2B)购自美国CST公司；Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647流式细胞分析检测试剂盒购自美国Thermo Fisher Scienticfic公司；Gallios流式细胞仪购自美国Beckman公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞系培养细胞均用富含10%胎牛血清(美国Gibco公司)和100 U/mL青-链霉素的DMEM(美国Gibco公司)培养基培养于含有5%CO2的37 ℃细胞培养箱中。细胞系定期进行支原体污染检测。
1.2.2 瞬时转染将细胞接种于6孔板中，当细胞融合度达到50%左右时，按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行转染。48~72 h后，收集细胞用于后续实验。
1.2.3 HJURP敲低的稳转细胞系的构建将H1299细胞接种于24孔板中，当细胞融合度达到40%左右，按照MOI=10加入Control-RNAi-慢病毒或HJURP-RNAi-慢病毒，加入transGP转染试剂，过夜后予细胞换液。3 d后加入嘌呤霉素(4 μg/mL)进行药物筛选，至细胞稳定传代后用于后续实验。
1.2.4 FOXM1过表达细胞系的构建将SPC-A1细胞接种于24孔板中，当细胞融合度达到约40%时，按照MOI=5加入HJURP-过表达慢病毒，加入transGP转染试剂，过夜后予细胞换液。3 d后加入嘌呤霉素(4 μg/mL)进行筛选，至细胞稳定传代后用于后续实验。
1.2.5 5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(5-ethynyl-2-deoxyuridine, EdU)摄取实验将H1299细胞或SPC-A1细胞分别接种于24孔板中，当细胞融合度达到约60%时，将培养基替换为含EdU(10 μmol/L)的DMEM完全培养基，2 h后消化细胞，按照Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647的说明书进行操作，最后进行流式细胞术检测。
1.2.6 染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)实验通过超声将染色质处理成200~800 bp的片段。ChIP实验步骤按照EZ-ChIP试剂盒(美国Millipore公司)进行。采用兔抗人FOXM1抗体。HJURP启动子序列的引物为：正向序列5′-TCAAATA-GGAGACTCCGCCC-3′；反向序列5′-TTTGAAAGGCC-CAATCAGTGC-3′。
1.2.7 公共数据库分析提取癌症基因组图谱(the cancer genome atlas, TCGA)数据库中HJURP在肺癌与正常肺组织中差异表达的数据，通过UCSC Xena(https://xenabrowser.net/)进行分析，并对HJURP与FOXM1转录水平进行相关性分析。生存分析通过Kaplan-Meier Plotter (KM-plot)(http://kmplot.co-m/analysis/)及UALCAN(http://ualcan.path.uab.EdU/analysis.html)预后数据库进行分析。肿瘤细胞系测序数据(Cancer Cell Line Encyclopedia, CCLE)下载自Cbioportal(http://www.cbi-oportal.org/)。人肺腺癌肿瘤组织及相应正常组织的HJURP免疫组化染色下载自人蛋白图谱(Human Protein Atlas, HPA)数据库(https://www.proteinatlas.org/)。HJURP表达相关性分析采用基因表达谱互作分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis, GEPIA)数据库进行(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)。
1.2.8 裸鼠皮下移植瘤实验选用6~8周龄的雌性BALB/c裸鼠(n=6)，体质量18~20 g(中国华阜康公司)。小鼠分为Sh-Control组(n=3)及Sh-HJURP组(n=3)，分别于皮下注射Sh-Con或Sh-HJURP的H1299稳转细胞株(5×106/小鼠，100 μL预冷PBS)。荷瘤后第15天处死小鼠，拍照记录肿瘤大小并以游标卡尺沿2个垂直轴测量肿瘤直径，分别记为a(较长直径)与b(较短直径)。按照公式[肿瘤体积V=0.5×a(mm)×b(mm)×b(mm)]计算肿瘤大小。
1.2.9 Western blot检测RIPA裂解细胞提取总蛋白，以BCA法检测蛋白浓度。加入标准浓度上样缓冲液后，100 ℃水浴法蛋白变性5 min。取20 μg蛋白上样进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳，湿法转膜至PVDF膜上，5%BSA封闭30 min后，一抗分别采用兔抗人HJURP多克隆抗体(美国Proteintech公司，抗体浓度1∶2 000)及小鼠抗人β-actin抗体(美国Proteintech公司，克隆号2D4H5，抗体浓度1∶5 000)，4 ℃孵育过夜。次日洗膜后HRP偶联二抗孵育1 h。洗膜后以ECL化学发光法进行显影。
1.2.10 总RNA提取及实时定量PCR检测(quantitative real-time PCR，RT-qPCR)50 mg左右NSCLC肿瘤组织或正常组织剪至长径约1 mm的小组织块后转至陶瓷研磨器(高温湿热法灭活RNA酶预处理)中。加入0.5 mL左右液氮将组织块冻硬后进行研磨，加入1 mL TRIzol，按标准方案提取RNA，并以NanoDrop分光光度计对RNA浓度和纯度进行检测。反转录采用PrimeScript RT reagent Kit(日本TaKaRa公司)进行，荧光定量PCR采用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(日本TaKaRa公司)进行。引物序列见表 1。
| 基因名称 | 引物序列(5′→3′) | 产物长度/bp | |
| 正向 | 反向 | ||
| ACTB | CATGTACGTTGCTATCCAGGC | CTCCTTAATGTCACGCACGAT | 250 |
| HJURP | GATTCAAAAAGCGGTGAGGTCG | AGTCACACGTACATCCCTTCC | 198 |
| FOXM1 | ATACGTGGATTGAGGACCACT | TCCAATGTCAAGTAGCGGTTG | 175 |
1.2.11 双荧光素酶报告基因实验
根据HJURP启动子区域FOXM1结合位点分析结果, 选择启动子区域-200~-1 bp片段进行双荧光素酶报告基因实验。其中对照组(PROMOTOR-WT)为-200~-1 bp全长序列，实验组(PROMOTOR-MUT)为缺失FOXM1结合位点(TCCTGCCTCCTTTTGG)的序列，将这2段序列分别构建到双荧光素酶载体上(pmirGLO载体，北京擎科生物科技公司合成)。将合成的质粒与FOXM1-siRNA1或FOXM1-siControl同时转入293T细胞中，48 h后，根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书(美国Promega公司)进行检测。
1.3 数据处理与统计学分析流式数据采用FlowJo V10处理，采用GraphPad Prism 9.0软件进行数据分析，采用SPSS 26.0软件进行统计分析。数据以x±s表示，两组间比较采用双尾学生t检验，多组间比较采用单因素方差分析，并采用Bonferroni法矫正α后进行后续分析。相关性分析采用Pearson相关性分析进行。影响预后的因素采用单因素及多因素Cox回归分析，生存分析采用Kaplan-Meire分析，并采用对数秩检验检测其统计学差异。α=0.05。
2 结果 2.1 HJURP在肺腺癌组织中高表达通过RT-qPCR检测组织样本中HJURP的转录水平，发现肺腺癌中HJURP的mRNA水平显著高于正常组织(P < 0.05，图 1A)；而肺鳞癌中HJURP的mRNA水平与正常组织差异无统计学意义(图 1B)。分析TCGA数据库HJURP在肺癌组织与正常肺组织中的表达情况，结果发现在肺腺癌和肺鳞癌中，HJURP转录水平均显著高于正常肺组织样本(P < 0.05，图 1C、D)。进一步检测HPA数据库及本中心的肺腺癌肿瘤组织与正常组织样本的HJURP蛋白表达(图 1E、F)，结果显示：肺腺癌组织中HJURP蛋白表达水平较正常组织更高。
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a: P < 0.05，与正常组织比较 A：本中心肺腺癌患者正常与癌组织样本HJURP转录水平(n=12)；B：本中心肺鳞癌患者正常与癌组织样本HJURP转录水平(n=5)；C：TCGA数据库中肺腺癌正常组织与癌组织样本HJURP转录水平(n正常=59, n肿瘤=515)；D：TCGA数据库中肺鳞癌正常组织与癌组织样本HJURP转录水平(n正常=49, n肿瘤=502)；E：免疫组化检测HPA数据库中肺腺癌组织与正常肺组织HJURP蛋白表达；F：Western blot检测本中心肺腺癌组织与正常组织HJURP蛋白表达水平 1#~6#：样本编号；1:正常组织；2:肿瘤组织 图 1 HJURP在肺腺癌样本中高表达 |
2.2 HJURP高表达肺腺癌患者预后不良
为了进一步探究HJURP高表达与肺腺癌及肺鳞癌总体生存率的关系，分析UALCAN及KM-plot公共数据库中HJURP的mRNA水平与肺腺癌及肺鳞癌群体预后的关系。基于UALCAN数据库中的TCGA数据的分析表明，在肺腺癌中，HJURP高表达队列呈现了较差的生存水平(P < 0.05，图 2A)。与此类似，基于KM-plot数据库的分析也表明，HJURP高表达队列呈现了较差的生存水平(HR=1.94, 95%CI：1.66~2.15, P < 0.05，图 2B)。为明确HJURP的转录水平是否是肺腺癌患者的影响预后的独立因素，纳入患者年龄、性别、病理分期与HJURP的mRNA水平等因素进行Cox单因素及多因素回归分析。结果显示HJRUP的mRNA高表达为肺腺癌患者的影响预后的独立因素(P < 0.05, 表 2)。然而基于UALCAN-TCGA(图 2C)及KM-plot(HR=1.23, 95%CI：1.01~1.50，图 2D)数据库的分析表明，肺鳞癌中HJURP的表达与患者的不良预后的联系较弱。以上结果表明：肿瘤组织中HJURP的mRNA高表达是肺腺癌患者的影响预后的独立因素，HJURP高表达的肺腺癌患者总生存期较短。而在肺鳞癌中，HJURP的表达与患者预后无关，故后续研究聚焦于肺腺癌。
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a: P < 0.05，与HJURP低表达组比较 A：UALCAN-TCGA数据库中HJURP高/低表达肺腺癌患者生存曲线分析；B：KM-plot数据中 HJURP高/低表达肺腺癌患者生存曲线分析；C：UALCAN-TCGA数据库中HJURP高/低表达肺鳞癌患者生存曲线分析；D：KM-plot数据中HJURP高/低表达肺鳞癌患者生存曲线分析 图 2 HJURP高表达肺腺癌患者预后不良 |
| 临床特征 | 单因素Cox回归 | 多因素Cox回归 | |||
| HR(95%CI) | P值 | HR(95%CI) | P值 | ||
| 男性 | 0.976(0.846~1.127) | 0.744 | 1.034(0.892~1.197) | 0.658 | |
| 年龄≥65岁 | 0.814(0.610~1.086) | 0.162 | 0.779(0.582~1.041) | 0.092 | |
| HJURP高表达 | 1.274(1.101~1.473) | 0.001 | 1.508(1.120~2.029) | 0.007 | |
| 病理分期/期 | |||||
| Ⅰ | 0.278(0.161~0.480) | < 0.001 | 0.275(0.158~0.479) | < 0.001 | |
| Ⅱ | 0.594(0.340~1.037) | 0.067 | 0.581(0.331~1.019) | 0.058 | |
| Ⅲ | 0.955(0.541~1.686) | 0.874 | 0.880(0.494~1.565) | 0.663 | |
2.3 HJURP敲低抑制肺腺癌肿瘤细胞体外增殖
为探究HJURP在肺腺癌肿瘤细胞增殖调控中的影响，采用Si-Control、Si-HJURP-1或Si-HJURP-2分别转染H1299和SPC-A1细胞系，并在HJURP的转录水平和蛋白水平进行了验证(P < 0.05，图 3A、B, E、F)。通过EdU摄取实验分别对2个细胞系进行增殖检测。结果表明HJURP敲低导致H1299及SPC-A1细胞系的增殖受到抑制(P < 0.05，图 3C、D, G、H)。
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1: Si-Control组；2: Si-HJURP-1组；3: Si-HJURP-2组；a：P < 0.05，与Si-Control组比较 A~D：H1299细胞；E~H：SPC-A1细胞；A、E：Western blot检测HJURP蛋白水平; B、F: RT-qPCR检测HJURP转录水平；C、D、G、H：EdU摄取实验代表性流式细胞术结果及阳性细胞比例统计分析结果 图 3 HJURP敲低的肺腺癌细胞增殖水平下调 |
2.4 HJURP过表达促进肺腺癌肿瘤细胞增殖
采用慢病毒过表达HJURP方法构建HJURP过表达SPC-A1细胞株(HJURP-OE组)与对照SPC-A1细胞株(Control组)，并通过RT-qPCR及Western blot进行验证(P < 0.05，图 4A、B)。EdU摄取实验结果表明，HJURP-OE组的细胞增殖水平显著高于Control组(P < 0.05，图 4C、D)。提示高表达HJURP可以显著促进肺腺癌细胞系增殖。
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1: Control组；2: HJURP-OE组；a: P < 0.05，与Control组比较 A：Western blot检测HJURP蛋白水平；B：RT-qPCR检测HJURP转录水平；C、D：EdU摄取实验代表性流式细胞术结果及阳性细胞比例统计分析 图 4 HJURP过表达的肺腺癌细胞增殖能力增强 |
2.5 HJURP敲低抑制肺腺癌裸鼠皮下肿瘤生长
为进一步明确HJURP在体内对肺腺癌生长的影响，构建慢病毒介导的HJURP敲低(Sh-HJURP)及对照病毒转染(Sh-Con)的H1299稳转细胞株。在确认成功敲低HJURP后(P < 0.05，图 5A、B)，采用裸鼠皮下成瘤实验验证HJURP敲低对肿瘤体内生长的影响。结果显示，与Sh-Control组比较，Sh-HJURP组小鼠的肿瘤生长受到显著抑制(P < 0.05，图 5C、D)。以上结果表明，HJURP敲低能够显著抑制肺腺癌细胞在裸鼠体内的生长。
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1: Sh-Control组；2: Sh-HJURP组；a: P < 0.05，与Sh-Control组比较 A：Western blot检测HJURP蛋白水平；B：RT-qPCR检测HJURP转录水平；C：裸鼠成瘤15 d后肿瘤大体观察图片；D：裸鼠成瘤15 d后肿瘤体积分析(n=3) 图 5 HJURP敲低抑制肺腺癌裸鼠皮下肿瘤生长 |
2.6 肺腺癌肿瘤组织中FOXM1与HJURP转录水平密切相关
为了探索HJURP的上游调控机制，通过GEPIA网站(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)检测肺腺癌中与HJURP转录水平相关性最高的前100个基因。其中，HJURP与转录因子FOXM1呈显著正相关。采用Pearson相关性分析本中心肺腺癌患者肿瘤组织样本及TCGA-肺腺癌数据库资料，发现HJURP与FOXM1呈显著正相关(P < 0.05，P < 0.001，图 6A、B)。由于肿瘤组织样本中不仅仅包含肿瘤细胞，还包含大量的间质细胞，可能存在潜在偏倚。进一步采用CCLE数据库分析肺癌细胞系中HJURP与FOXM1的相关性。结果显示，HJURP与FOXM1呈显著正相关(P < 0.001，图 6C)。以上结果表明，肺腺癌肿瘤组织中，FOXM1转录水平与HJURP转录水平密切相关。提示FOXM1可能是HJURP的上游调控分子。
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| A：本中心肺腺癌组织样本中FOXM1与HJURP的表达相关性(n=12)；B：TCGA数据库中肺腺癌组织样本中FOXM1与HJURP的表达相关性(n=515)；C：CCLE数据库中肺癌细胞系中FOXM1与HJURP的表达相关性(n=198) 图 6 肺腺癌肿瘤组织中FOXM1与HJURP的相关性分析 |
2.7 FOXM1直接调控HJURP表达
ChIP实验结果显示，HJURP上游启动子序列与FOXM1蛋白共沉淀(图 7A)，表明FOXM1为HJURP上游调控分子。双荧光素酶报告基因实验结果显示，在表达HJURP野生型启动子的293T细胞中，Si-FOXM1-1组显著下调HJURP启动子转录活性。而在表达HJURP突变型启动子的293T细胞中，Si-FOXM1-1组对HJURP启动子转录活性无影响。提示FOXM1作为转录因子能够直接与HJURP启动子区域结合(P < 0.05，图 7B)。为了验证FOXM1对HJURP转录调控的影响，采用SiRNA技术敲低了SPC-A1细胞系中FOXM1的表达水平(图 7C)。结果显示：FOXM1的敲低导致了HJURP转录水平的显著下降(P < 0.05，图 7D)。以上结果提示：HJURP的表达受到转录因子FOXM1的紧密调控。
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1: Si-Control组；2: Si-FOXM1-1组；3: Si-FOXM1-2组；a: P < 0.05，与Si-Control组比较 A：ChiP-PCR实验检测FOXM1与HJURP结合；B：FOXM1与HJURP结合的双荧光素酶报告基因实验；C：RT-qPCR检测FOXM1的转录水平；D：RT-qPCR检测HJURP的转录水平 图 7 FOXM1对HJURP的表达的调控作用 |
3 讨论
HJURP是近年来发现的一个原癌基因，在多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用。肿瘤中HJURP的过表达被认为与癌细胞染色体的不稳定性有关，其作用机制可能涉及有丝分裂缺陷[5]。在肝细胞癌中，HJURP在肿瘤组织中高表达，并且与肝细胞癌患者预后密切相关。基于肝细胞癌细胞系的体外实验证实，HJURP对肿瘤细胞的增殖调控主要通过影响MAPK及ERK1/2信号通路，从而导致P21蛋白稳定性下降，促进肝细胞癌发生发展[8]。基于膀胱癌的研究发现，HJURP促进肿瘤细胞增殖及迁移，可能是通过调节PPARγ-SIRT1通路影响肿瘤细胞代谢来实现其促进肿瘤发生发展作用的[6]。基于人乳腺癌的研究显示，HJURP主要通过调控YAP1/NDRG1信号影响乳腺癌细胞增殖[12]。以上结果提示，HJURP促进肿瘤生长的作用是在多瘤种中广泛存在的。然而，关于HJURP是否影响肺腺癌发生发展，以及HJURP的上游调控机制均不清楚。
本研究利用肺腺癌患者组织样本及TCGA、HPA数据库样本，发现HJURP在肿瘤组织中高表达。并且证实HJURP高表达是影响肺腺癌患者预后的独立因素，提示HJURP可作为判断肺腺癌患者预后的生物标志物。进一步通过体内实验和体外实验证实，HJURP正向调控肺腺癌细胞的体外增殖及体内生长。当敲低肿瘤细胞系的HJURP表达时，肿瘤细胞的体外增殖及体内生长受到显著抑制。本研究证实HJURP正向调控肿瘤细胞增殖，并且HJURP的表达受到转录因子FOXM1的调控。
FOXM1是一个转录因子，既往肿瘤方面的研究认为其主要与肿瘤转移[13-14]、免疫微环境的调控[15]有关。本实验结果直接表明HJURP启动子区域DNA片段与FOXM1蛋白共沉淀。双荧光素酶报告基因实验结果进一步证实，FOXM1作为转录因子能够直接与HJURP启动子区域结合。研究证实，FOXM1直接结合CENP-A进行转录调控[16]，而CENP-A自身与HJURP也有紧密的相互作用[17]。因此，推测FOXM1、HJURP与CENP-A可能相互协同，共同促进肺腺癌发生发展。深入探索三者之间的交互作用，可能为肺腺癌肿瘤细胞的增殖调控机制提供更多线索。
分析TCGA和KM-plot公共数据库发现，高表达HJURP与肺腺癌患者不良预后相关。此前基于NSCLC的研究显示，HJURP的表达水平与NSCLC患者的临床分期有关[5, 18]。此外，另一项研究发现，通过系统性的生信分析，HJURP与NSCLC患者不良预后密切相关[10]，与本研究结果相近。
本研究尚有局限之处：由于TCGA数据库临床信息的可及性问题，对生存分析Cox回归纳入的临床因素仅包括性别、年龄、临床分期、HJURP表达等因素，仍有一些可能的偏倚因素未纳入分析(如吸烟史、突变基因情况、PD-L1表达情况等)。
综上所述，HJURP在多种肿瘤中发挥促癌作用，提示其可能作为重要的癌基因，参与调控与肿瘤细胞恶性特征相关的重要信号通路，其表达受到上游转录因子FOXM1的调控。并且，肺腺癌肿瘤组织中HJURP的表达与患者不良预后密切相关。
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