2. 400016 重庆，重庆医科大学附属第一医院：重大代谢性疾病转化医学重点实验室
2. Key Laboratory of Translational Medicine for Major Metabolic Diseases, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400016, China
继发性急性髓系白血病(secondary acute myeloid leukemia，sAML)是一类由骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes，MDS)、骨髓增殖性疾病(myeloproliferative neoplasm，MPN)等恶性肿瘤进展而来的血液系统肿瘤[1-2]。目前对sAML发病机制尚认识不清且治疗靶点少，因而存在患者治疗方案不足、肿瘤耐药率高等问题，故探寻sAML新的致病基因及治疗方案具有重要意义。细胞衰老指细胞增殖复制衰老，表现为细胞周期稳定停滞及细胞增殖减少，衰老细胞最终通过细胞凋亡等途径被机体清除[3]。肿瘤发生与其增殖能力增强及细胞衰老停止密不可分[4]。癌基因在肿瘤细胞抗衰老中发挥着重要作用，癌基因通过中断肿瘤细胞衰老、促进肿瘤细胞增殖及促进肿瘤细胞耐药等方式促进肿瘤发生发展[5]，靶向抑制癌基因药物可回复细胞衰老能力达到抗肿瘤作用[6-7]。
大量研究指出BRAF基因突变致其表达增高，引起MAPK通路持续激活，诱发肿瘤细胞抗衰老、促进肿瘤细胞增殖及促进肿瘤发生发展[8-9]。BRAF突变在80%以上黑色素瘤中被发现，维罗非尼(vemurafenib，VEM)等BRAF靶向抑制剂在治疗黑色素瘤患者中取得良好疗效[10-11]。既往研究发现BRAF基因突变致其高表达有利于恶性肿瘤进展为sAML[12-14]，但BRAF靶向抑制剂在sAML中的疗效与其对sAML肿瘤细胞衰老的影响的研究尚少。
肿瘤耐药是恶性肿瘤治疗的另一难题，研究发现肿瘤耐药与癌基因提高组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)活性进行组蛋白修饰有关[15-16]，抑制HDAC活性可缓解治疗耐药与抑制肿瘤生长。将西达苯胺(chidamide，CDM)[17]等HDAC抑制剂与靶向药物联合使用以减少肿瘤耐药发生是目前血液肿瘤治疗的新趋势[18-20]。
因此，本研究以2种sAML细胞系为研究对象，采用BRAF基因靶向抑制剂VEM联合CDM方案，探索VEM联合CDM对sAML肿瘤细胞增殖及细胞衰老的影响及可能机制，为进一步发现sAML新的治疗靶点及治疗方案提供理论与实验基础。
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器人源sAML细胞株SKM-1由华中科技大学附属同济医院周剑锋教授馈赠；人源sAML细胞株MOLM-13由浙江大学附属第一医院佟红艳教授馈赠。VEM购自叶脉生物公司，CDM购自微芯生物公司，VEM及CDM均以DMSO溶解为50 mmol /L浓度，分装保存在-20 ℃备用。胎牛血清购自PAN-Seratech公司，RPMI-1640细胞培养基购自Gibco公司；IMDM细胞培养基购自Cytiva公司。CCK-8试剂购自Med Chem Express公司，酶标仪购自Thermo Fisher Scientifc公司。反转录试剂盒、RT-qPCR试剂盒购自TaKaRa公司，定量PCR仪购自Bio-Rad公司。流式细胞仪购自Beckman Coulter公司产品，倒置荧光显微镜购自ZEISS公司。
1.2 细胞培养sAML细胞使用含10% 胎牛血清、1% 青-链霉素培养基，于37 ℃、5%CO2以及饱和湿度的细胞培养箱中培养。2~3 d传代1次，取对数生长期细胞进行后续实验。
1.3 CCK-8检测细胞增殖抑制率将细胞接种于96孔板中，每孔加入5 000个细胞。每组设3个复孔，分别加入不同浓度的VEM和CDM干预；作用于SKM-1细胞的VEM最终浓度为0(对照组)、1、10、20、30及40 μmol/L；作用于SKM-1细胞的CDM最终浓度为0(对照组)、1、4、8、12及16 μmol/L；作用于MOLM-13细胞的VEM最终浓度为0(对照组)、1、5、10、15及20 μmol/L；作用于MOLM-13细胞的CDM最终浓度为0(对照组)、1、2、4及8 μmol/L。分别于培养24、48和72 h时每孔加入10 μL CCK-8工作液，于37 ℃孵育4 h后，用酶标仪检测光密度[D(450)]值，计算细胞增殖抑制率。
细胞增殖抑制率=[D(450)实验组-D(450)空白组]/[D(450)对照组-D(450)空白组]×100%
1.4 免疫荧光实验sAML细胞分为4组(n=3)：对照组、VEM单药组、CDM单药组与VEM+CDM组。收集各组干预后细胞，PBS清洗3次，后用4%多聚甲醛固定细胞30 min，PBS清洗3次后0.01%-Triton-X-100透膜30 min，PBS清洗3次后封闭细胞30 min，吸弃封闭液后一抗孵育4 ℃过夜。次日PBS清洗细胞3次，二抗室温孵育1 h，PBS清洗3次后用含DAPI的Crystal Mounting封闭液处理细胞30 min，最后在倒置显微镜下观察结果。
1.5 流式细胞术检测细胞周期和凋亡将sAML细胞按1×106/孔接种于6孔板，VEM、CDM及VEM+CDM药物干预细胞48 h后，114×g离心3 min，收集细胞，PBS清洗2次。用于周期检测的细胞加入1 mL预冷的75%乙醇，4 ℃固定过夜，送重庆医科大学生命科学院，使用流式细胞仪检测细胞周期分布情况。用于凋亡检测的细胞加入500 μL PBS重悬细胞后送重庆医科大学生命科学院，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.6 RT-qPCR检测mRNA相对表达量收集VEM、CDM及VEM+CDM药物干预48 h后的细胞，用TRIzol法提取细胞总RNA，测定RNA浓度后，按反转录试剂盒说明书合成cDNA，采用TB Green荧光染料法进行定量PCR扩增反应，按说明书配制10 μL的PCR反应体系，每组设置3个复孔。扩增条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。基因的相对表达量用2-△△Ct公式计算。扩增所用引物序列见表 1。
| 引物名称 | 引物序列(5′→3′) |
| BAX | 上游: AGGATCGAGCAGGGCGAATG |
| 下游: TCAGCTTCTTGGTGGACGCA | |
| Caspase-3 | 上游: TGCTGAAACAGTATGCCGACA |
| 下游: CAAATTCTGTTGCCACCTTTCG | |
| BCL2 | 上游: CTGCACCTGACGCCCTTC |
| 下游: ACACATGACCCCACCGAAC | |
| P21 | 上游: CTGCCTTAGTCTCAGTTTGTGT |
| 下游: AACCTCTCATTCAACCGCCTA | |
| PI3K | 上游: AAAGTTTCAGGCAGCAGTGG |
| 下游: TCGTTGTGCCTGTCACCTAT | |
| AKT1 | 上游: AGCGACGTGGCTATTGTGAAG |
| 下游: GCCATCATTCTTGAGGAGGAAGT | |
| STAT3 | 上游: CTCTTCGGGATGACAGGAGC |
| 下游: CTTGGGCGACGGTTTGAATC | |
| mTOR | 上游: TCCTGAAGAACATGTGCGAG |
| 下游: CCAAAGTACAAGCGAGAGGC | |
| BRAF | 上游: GAGTCTTCCTGCCCAACAA |
| 下游: TGGTTTCTTCTCTCCATCCTG | |
| ERK | 上游: CCACCCATACCTGGAGCAGTA |
| 下游: GAATGGCGCTTCAGCAATG | |
| P38 | 上游: GTACCACGATCCTGATGATG |
| 下游: CAGTAGAGTGGGCAACAG | |
| MEK | 上游: CAATGGCGGTGTGGTGTTC |
| 下游: AGCTCCCTTAGTATCTGGTTCC | |
| β-actin | 上游: CATTGCCGACAGGATGCAG |
| 下游: CGGAGTACTTGCGCTCAGGA |
1.7 网络药理学分析
VEM及CDM药物靶点在Swiss Target Predict、TargetNe、SEA及PharmMapper等4个网络药理学数据库中筛选、汇总及去重后得到。sAML疾病相关靶点在GeneCard、OMIM及DisGeNet等3个数据库中筛选、汇总及去重后获得。药物-疾病靶点的蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)网络图在STRING平台(https://string-db.org/)完成构建，靶点相互作用阈值≥0.9，得到PPI网络图。同时利用MCODE插件对PPI网络进行聚类分析及拓扑分析，进而筛选出最佳关键核心靶点。关键核心靶点的京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)和基因本体论(Gene Ontology，GO)富集分析在DAVID在线富集分析网站(https://david.ncifcrf.gov/)完成，并用微生信网站进行数据可视化(http://www.bioinformatics.com.cn/)。
1.8 统计学分析采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.01软件进行统计学分析。采用肿瘤与癌症基因图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)在线数据库(GEPIA：http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)分析BRAF在肿瘤中的表达情况。定量数据均以x±s表示，多组间比较采用one-way ANOVA分析，两因素比较采用two-way ANOVA分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 BRAF抑制剂VEM协同CDM抑制sAML细胞增殖TCGA数据库提示BRAF基因表达在包括急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，LAML)等恶性肿瘤中异常升高(图 1A)。故将sAML细胞用BRAF基因抑制剂VEM干预，发现VEM呈时间剂量依赖性抑制sAML细胞增殖。其中SKM-1细胞48 h的半数抑制浓度(IC50)为(24.15±1.18)μmol/L(P < 0.000 1，图 1B)，MOLM-13细胞48 h的IC50为(11.30±0.38)μmol/L(P < 0.000 1，图 1C)。同时，CDM也呈时间剂量依赖性抑制sAML细胞增殖，SKM-1细胞48 h的IC50为(15.91±11.40)μmol/L(P < 0.000 1，图 1D)，MOLM-13细胞48 h的IC50为(2.42±3.82)μmol/L(P < 0.000 1，图 1G)。故选用VEM及CDM不同倍数IC50药物浓度组合干预sAML细胞48 h，CCK-8实验结果提示1/3 IC50~2/3 IC50的VEM联合CDM即可过半数抑制sAML细胞增殖，Compusy软件分析显示药物联合指数(combine index，CI)在绝大部分药物组合中＜1，提示2种药呈协同效应抑制sAML增殖(P < 0.01，图 1 E、F、H、I)。因此，选用2种细胞系CI < 1且抑制率在0.5左右的药物组合进行后续实验：SKM-1细胞(VEM：1/3 IC50-8 μmol/L +CDM：1/8 IC50-2 μmol/L，抑制率=0.62，联合指数=0.87)，MOLM-13细胞(VEM：1/2 IC50-5 μmol/L +CDM：2 IC50-5 μmol/L，抑制率=0.71，联合指数=0.45)。
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| A：TCGA数据库中BRAF在各型肿瘤中的表达情况；B：VEM处理SKM-1细胞增殖抑制率；C：VEM处理MOLM-13细胞增殖抑制率；D：CDM处理SKM-1细胞增殖抑制率；E：VEM联合CDM处理SKM-1细胞48 h的增殖抑制率；F：VEM联合CDM在SKM-1细胞中的联合指数 Fa：细胞增殖抑制率；G：CDM处理MOLM-13细胞增殖抑制率；H：VEM联合CDM处理MOLM-13细胞48 h的增殖抑制率；I：VEM联合CDM在MOLM-13细胞中的联合指数；a：P < 0.000 1，b：P < 0.01，与对照组比较 图 1 CCK-8法检测VEM联合CDM处理sAML细胞的增殖抑制率(n=3) |
2.2 VEM联合CDM对sAML细胞衰老的影响
细胞增殖抑制是细胞衰老的重要表现之一，衰老细胞特异性表达TRF2及Lamin B1，故采用免疫荧光检测细胞衰老发生情况。与对照组、VEM及CDM单药组比较，VEM联合CDM协同显著促进sAML细胞衰老发生，表现为细胞内衰老指标TRF2和Lamin B1表达增加(图 2)。
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| A：SKM-1细胞在VEM、CDM及2种药联合处理时TRF2表达情况；B：SKM-1细胞在VEM、CDM及2种药联合处理时Lamin B1表达情况 图 2 免疫荧光观察VEM联合CDM处理sAML细胞衰老发生情况 |
2.3 VEM联合CDM促进sAML细胞周期停滞
用流式细胞术检测各处理组的细胞周期情况。在SKM-1细胞中，单药VEM和CDM组SKM-1细胞G0/G1期细胞比例较对照组升高，而VEM联合CDM时SKM-1细胞G0/G1期细胞比例较单药组显著升高(P < 0.05，图 3A、C)。在MOLM-13细胞中，单药CDM组MOLM-13细胞G0/G1期细胞比例较对照组升高，而VEM组在细胞周期上变化与对照组比较差异无统计学意义，但VEM联合CDM时SKM-1细胞G0/G1期细胞比例较单药组显著升高(P < 0.05，图 3B、D)。提示VEM联合CDM促进sAML细胞周期停滞，G0/G1期细胞增多，S期细胞减少。
|
| A、C：流式细胞术检测VEM联合CDM处理SKM-1细胞周期变化；B、D：流式细胞术检测VEM联合CDM处理MOLM-13细胞周期变化 1：SKM-1对照组；2：SKM-1 2 μmol/L CDM组；3：SKM-1 8 μmol/L VEM组；4：SKM-1 2 μmol/L CDM+8μmol/L VEM组；5：MOLM-13对照组；6：MOLM-13 5 μmol/L CDM组；7：MOLM-13 5 μmol/L VEM组；8：MOLM-13 5 μmol/L CDM+5 μmol/L VEM组；a：P < 0.05，与对照组比较；b：P < 0.05，与CDM组比较；c：P < 0.05，与VEM组比较 图 3 VEM联合CDM对sAML细胞周期的影响(n=3，x±s) |
2.4 VEM联合CDM对sAML细胞凋亡的影响
衰老细胞通过细胞凋亡途径被机体清除，故应用流式细胞术检测药物干预各组细胞后细胞凋亡发生情况。BRAF抑制剂VEM处理sAML细胞系48 h后，sAML细胞凋亡率相较于对照组增加，而当VEM联合CDM处理sAML细胞时，sAML细胞凋亡率相较于VEM及CDM单药组增加更加显著(P < 0.05，图 4)。
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A、C：流式细胞术检测VEM联合CDM促进SKM-1细胞凋亡；B、D：流式细胞术检测VEM联合CDM促进MOLM-13细胞凋亡 1：SKM-1对照组；2：SKM-1 2 μmol/L CDM组；3：SKM-1 8 μmol/L VEM组；4：SKM-1 2 μmol/L CDM+8 μmol/L VEM组；5：MOLM-13对照组，6：MOLM-13 5 μmol/L CDM组；7：MOLM-13 5 μmol/L VEM组；8：MOLM-13 5 μmol/L CDM+5 μmol/L VEM组；a：P < 0.05，与对照组比较；b：P < 0.05，与CDM组比较；c：P < 0.05，与VEM组比较 图 4 VEM联合CDM对sAML细胞凋亡的影响(n=3，x±s) |
2.5 VEM联合CDM影响sAML细胞的机制探究
网络药理学研究结果显示：VEM协同CDM影响sAML细胞的作用机制可能通过PI3K-AKT及MAPK信号通路(图 5)。
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| A：VEM(SET2) 及CDM(SET1)靶基因和sAML(SET3)疾病靶点的韦恩图；B：Cytoscape插件BisoGenet构建药物-疾病PPI网络图；C、D：药物核心靶基因亚组分析；E~G分别为药物核心靶基因的GO的生物进程、细胞组成及分子功能分析；H：药物核心靶基因的KEGG通路分析 图 5 VEM联合CDM促进sAML衰老发生机制的网络药理学分析 |
2.6 VEM联合CDM促进sAML细胞衰老可能与PI3K-AKT及MAPK通路相关
RT-qPCR检测显示：VEM联合CDM下调PI3K-AKT通路相关基因(PI3K、AKT1、STAT3、mTOR)及MAPK通路相关基因(BRAF、ERK、P38及MAPK)mRNA表达水平，并且验证了VEM联合CDM上调衰老相关因子P21的mRNA水平，也验证了VEM联合CDM可下调抗凋亡因子BCL2的mRNA水平、上调凋亡促进因子BAX、Caspase-3表达(P < 0.05，图 6)，故VEM联合CDM可能是通过PI3K-AKT及MAPK通路促进细胞衰老发生。
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| A~C：VEM协同CDM调控SKM-1细胞凋亡相关因子BAX、BCL2及Caspase-3的mRNA水平；D：VEM协同CDM促进SKM-1细胞衰老相关因子P21的mRNA水平；E~H：VEM协同CDM调控PI3K-AKT信号通路相关因子PI3K、AKT1、mTOR及STAT3的mRNA水平；I~L：VEM协同CDM调控MAPK信号通路相关因子BRAF、ERK、P38及MEK的mRNA水平 1：SKM-1对照组；2：SKM-1 2 μmol/L CDM组；3：SKM-1 8 μmol/L VEM组；4：SKM-1 2 μmol/L CDM+8 μmol/L VEM组；a：P < 0.05，与对照组比较；b：P < 0.05，与VEM组比较；c：P < 0.05，与CDM组比较 图 6 RT-qPCR检测VEM协同CDM对细胞内相关信号通路的影响(n=3) |
3 讨论 3.1 sAML与细胞衰老
急性髓系白血病(secondary acute myeloid leukemia，AML)是成人最常见的白血病类型[21]，sAML约占全部AML中的30%，其中60%~80%的sAML由MDS进展而来，sAML患者治疗靶点少、病情进展快及耐药率高等问题仍相当严峻[22]。
细胞衰老在机体正常生命活动中发挥重要作用，细胞衰老抵抗被多项研究报道与肿瘤的发生密切相关。有报道老龄sAML患者治疗效果更差、耐药发生率更高及预后更差[23]，原因可能与老龄sAML患者中更多癌基因诱发造血干细胞抗衰老进而诱发肿瘤相关[24]。
多项研究明确BRAF基因突变致其表达增高及激酶活性增强，引起MAPK通路持续激活，通过促进肿瘤细胞增殖、诱发肿瘤细胞抵抗衰老等方式促进肿瘤发生发展[9]。但BRAF及其抑制剂在sAML中的具体作用及影响机制的研究较少。CDM作为HDAC抑制剂，被批准用于治疗复发/难治性外周T细胞淋巴瘤(peripheral T cell lymphoma，PTCL)[25]。在恶性血液肿瘤的临床治疗中，常将CDM联合多种靶向药物治疗以达到减少患者耐药发生、增敏靶向药物的抗瘤作用。相关研究指出联合CDM可能通过抑制MAPK及PI3K-AKT等信号通路促进肿瘤细胞衰老发挥抗肿瘤作用[26-28]。故本研究探索了VEM联合CDM方案对sAML细胞衰老的影响及可能机制，以期为sAML的临床治疗拓展新的方案。
3.2 BRAF抑制剂VEM联合CDM促进SAML衰老为明确BRAF在AML中的表达情况，本研究首先利用TCGA数据库分析BRAF的表达水平，发现BRAF在AML中表达明显增高。同时，使用BRAF抑制剂VEM处理2种sAML患者来源细胞系：SKM-1和MOLM-13[29-30]，结果发现BRAF靶向抑制剂VEM可呈时间剂量依赖性抑制SKM-1和MOLM-13细胞增殖，且VEM联合CDM时可协同抑制sAML细胞增殖。VEM联合CDM协同效应在MOLM-13细胞中更加显著，基于MOLM-13细胞株于sAML患者复发难治时建株[30]，且相关研究发现BRAF基因异常多发现于复发难治AML患者中[31]，故推测BRAF基因高表达可能促进sAML复发难治，BRAF抑制剂VEM联合CDM方案对于复发难治sAML有更好的治疗效果，但这仍需进一步实验验证。
研究发现肿瘤细胞表现出较强的细胞衰老抵抗，促进细胞衰老是机体抑制肿瘤的重要手段。故本研究探索了BRAF抑制剂VEM联合CDM对sAML细胞衰老的影响。TRF2[32]和Lamin B1[33]是衰老细胞的重要标志，免疫荧光实验结果提示相较于对照组及单药组，VEM联合CDM明显促进sAML细胞TRF2和Lamin B1表达，意味着VEM联合CDM可显著促进sAML细胞衰老发生。
细胞衰老发生表现为细胞增殖能力减弱及细胞周期稳定停滞[34]。本研究采用CCK-8实验验证了VEM联合CDM可抑制sAML细胞增殖。同时，流式细胞术实验结果发现VEM联合CDM可使sAML细胞周期稳定停滞于G0/G1期。RT-qPCR实验也验证了sAML细胞在VEM及联合CDM时，细胞周期及衰老相关因子P21表达明显上调。这些结果表明VEM联合CDM通过促进sAML细胞衰老发生发挥抗瘤作用。
机体清除衰老细胞的重要途径是促进细胞凋亡发生[35]，本研究检测了VEM联合CDM对sAML细胞凋亡发生的影响。流式细胞术实验结果提示VEM联合CDM促进sAML细胞凋亡发生，RT-qPCR实验也提示VEM及联合CDM可下调抗凋亡因子BCL2，上调促凋亡因子BAX及Caspase-3。因此，VEM联合CDM可通过促进sAML细胞凋亡发生清除衰老肿瘤细胞进而发挥抗sAML作用。
为进一步分析VEM联合CDM促进sAML细胞衰老的机制，采用网络药理学初步探讨VEM联合CDM抗sAML的作用机制，结果提示VEM联合CDM可能通过抑制MAPK信号通路和PI3K-AKT信号通路发挥作用。MAPK信号通路位于BRAF基因下游，MAPK信号通路激活在多种肿瘤中被报道与细胞衰老抵抗相关。PI3K-AKT信号通路也在多个疾病中被发现与细胞衰老调控有关[36-38]。RT-qPCR实验结果提示，VEM及联合CDM促进sAML细胞PI3K-AKT信号通路相关因子PI3K、AKT1、mTOR及STAT3的mRNA水平下调，抑制MAPK信号通路相关因子BRAF、ERK、P38及MEK的mRNA水平。因此，本研究认为BRAF抑制剂VEM联合CDM可能通过调控PI3K-AKT信号通路及MAPK信号通路促进sAML细胞衰老发生。
综上所述，本研究为sAML患者临床治疗提供了新的理论和实验基础：BRAF基因可能是sAML新的治疗靶点，BRAF基因靶向抑制剂VEM联合CDM方案协同通过诱导sAML肿瘤细胞衰老发生、减少肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡发生发挥其抗sAML作用，提示VEM联合CDM方案可能是sAML新的治疗方案。
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