表1(Table 1)
2. 400042 重庆，重庆医科大学附属第一医院第一分院神经内科
2. Department of Neurology, First Branch of the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400042, China
缺血性脑卒中(ischemic stroke，IS)是威胁人类健康的常见脑血管疾病[1]。神经炎症在IS中引发一系列细胞、分子事件，使致残率、死亡率显著上升[1]。小胶质细胞(microglia，MG)作为中枢神经系统(central nervous system，CNS)常存的免疫细胞，是脑内环境稳定的维护器[2]。伴随IS的神经炎症发生，MG迅速到达损伤处，分泌细胞毒性物质与炎症因子加重脑损伤，同时，分泌生长因子与抗炎症因子，促使脑损伤修复[3]。MG具有高度可塑性，可在不同情况下激活为M1或M2表型，前者主要分泌炎症因子[如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等]、加重神经损伤；后者则分泌神经营养因子及CD206等主要抗炎症因子，对大脑表现出神经保护作用[3]。近些年，有不少致力于探索MG的可塑性的研究，旨在调节MG的M2型化，以更好发挥其对神经结构和功能的修复作用[4]，但结果并不理想。
微小RNA(microRNA，miRNA)是大脑中富集的重要分子之一，可在MG的极化过程中行使其基因转录和相关通路调节作用。miR-124-1是一种脑特异性miRNA，在MG中高表达[5]。正常情况下，miR-124-1调节MG的功能，在保持其静止状态中发挥关键作用。病理条件下，miR-124-1下调，极化MG为M1表型，加重神经炎症，反之则将MG极化为M2表型，缓解神经炎症。外泌体(exosomes，Exo)是一类细胞外小泡，通过受体-配体相互作用或吞噬、内吞、直接膜融合等方式，特异性作用于靶细胞，将其活性分子(蛋白质、RNA及miRNA)释放到受体细胞中，以改变其生物学特性与功能。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)主要通过其分泌的Exo(MSCs-Exo)实现其对受损组织，包括神经组织的修复[6-9]。MSCs-Exo可自由穿越血脑屏障，可通过调节MG的活性和功能，在治疗各种神经疾病方面显示明显的抗炎作用。细胞水平研究证实，骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMMSCs)的Exo(BMMSCs-Exo)可携带外源miR-124-1基因(Exo-miR-124-1)，调节MG向M2型极化[10]。然而，Exo-miR-124-1能否介导IS后MG的M2型极化，影响其神经炎症反应，促使其受损神经的结构修复和功能的恢复尚不清楚。
为探讨BMMSCs-Exo是否可携带外源性miR-124-1基因在动物水平促使MG的M2型化，以利IS的修复。本实验将BMMSCs-Exo携带miR-124-1基因移植入IS大鼠右侧脑室梗死局部，对术后各时相动物进行改良神经系统严重度评分(modified neurological severity scores, mNSS)、三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride，TTC)梗死体积染色检测、定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)、Western blot及免疫荧光组织染色，分别检测术后28 d各组动物脑织M1型分子(TNF-α)与M2型分子(CD206)在基因与蛋白水平的表达变化。以期BMMSCs-Exo可携带外源miR-124-1基因，促使MG向M2型极化，抑制局部炎症反应，促使IS神经功能的恢复，为脑卒中的治疗奠定基础。
1 材料与方法 1.1 实验动物购于重庆医科大学动物实验中心的SD大鼠50只[动物使用许可证号：SYXK(渝)2018-0003]，体质量190~260 g，其中，15只(体质量190~220 g，6~8周龄)用于分离培养BMMSCs，其余35只(体质量230~260 g，7~9周龄，含模型复制死亡5只，死亡率约11%)用于脑室梗死模型复制和对照。雌雄不限，饲养于常规恒温、恒湿的SPF级动物室内，自由摄用无菌水与标准饲料。
1.2 主要试剂和仪器DMEM培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、Lipofectamine® 2000基因转染试剂、PVDF膜与CD63抗体分别购自美国HyClone、Sigma、Invitrogen、Bio-Rad与Scbt公司；FT106/miR-124-1病毒载体及其对照病毒由广州辉腾生物科技有限公司提供；RT-qPCR检测引物及其检测试剂购自上海生工生物工程有限公司，Bio-Rad CFX Manager 3.0为其定量分析软件；CD44、CD45及CD90抗体购自美国Ebioscience公司；CD9、TNF-α及CD206抗体购自美国Abcam公司；JEM-1400Plus透射电子显微镜购自日本HITACHI公司；Mini蛋白电泳仪、CFX96荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司。
1.3 方法 1.3.1 细胞培养BMMSCs的分离、培养及鉴定参照本课题组前期的实验进行[11]。
1.3.2 BMMSCs-Exo的获取及鉴定用含10%FBS(去掉Exo)的完全培养基正常培养、传代与扩增BMMSCs。收集过滤长势良好的第2代细胞(80%~95%融合生长)培养液，300×g，4 ℃，离心约10 min，取上清液，以2 000×g、10 000×g与100 000×g，4 ℃，分别离心约15 min(上清液)、35 min(上清液)及65 min。最后1次离心后，收集含BMMSCs-Exo的沉淀，重悬于4 ℃ PBS(100 μL)内，送样镜检。取10 μL BMMSCs-Exo液，常规制样与3%磷钨酸液染色，100 kV透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)镜检、拍照。提取与定量BMMSCs-Exo的总蛋白，采用Western blot[11]检测BMMSCs-Exo的标志蛋白CD63和CD9的表达情况。GAPDH为内参照。
1.3.3 病毒FT106/miR-124-1感染BMMSCs及其miR-124-1基因检测病毒FT106/miR-124-1感染BMMSCs及其感染效率评估，参照干细胞的重组慢病毒感染及其感染效率评估实验[11]进行。
RT-qPCR检测被感染的过表达miR-124-1基因(NR_031866.1，正向：5′-CCTCTCTCTCCGTGTTCA-CAGC-3′；反向：5′-CATTCTTGGCATTCACCGCGT-3′)的BMMSCs(BMMSCs/124-1组)与BMMSCs-Exo(Exo/124-1组)的miR-124-1基因表达变化，以BMMSCs(BMMSCs组)与BMMSCs-Exo(Exo组)为对照。
1.3.4 动物分组、脑梗死模型复制与相应处理大鼠30只，简单随机分为假手术组(Sham)、模型组(MCAO/R)、Exo移植组(Exo)、空病毒(Empty lentivirus，Elv)转染Exo移植组(Exo-Elv)及Exo/124-1移植组(Exo/124-1)，每组6只。
大鼠大脑中动脉栓塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion and reperfusion，MCAO/R)梗死模型的复制参照改良线栓法进行[12]。术前禁食动物约12 h，肌肉注射陆眠宁Ⅱ(0.25 mL/kg)进行麻醉，无菌室内，去除右侧颈部毛发，消毒、铺巾，切口，斜向内分离胸骨上窝居中处皮下组织、胸锁乳突肌及颈前肌所形成的三角间隙上方筋膜，露出颈动脉鞘、游离颈内动脉和颈总动脉。分别结扎、夹闭颈总动脉近、远心端。距扎线结3 mm左右处剪开一小口，并插入线栓头端，沿颈总动脉将栓线(ф0.26 mm)插入颈内动脉直达颅内，有阻力时停止，共入线约18 cm，结扎、固定线栓后，缝合皮肤。MCAO约150 min，拔出线栓1 cm，再灌注血流。
Sham组只行假手术，其余各组均行MCAO/R模型手术。术后1 d与14 d，在立体脑部定位仪下，各移植组大鼠于右侧脑室分别注入相应移植物约30 μL，MCAO/R组与Sham组分别注入相同剂量的生理盐水作对照。各组动物于术后1、28 d分别取1、2只作脑梗死体积染色评估，其余动物取梗死区组织(非明显坏死组织或坏死组织的邻近组织)行qPCR、Western blot及荧光免疫组织化学检测(每个组织按需求分成3份，3种检测法各占1份，均冻存于液氮内备用)。
1.3.5 神经功能评估术后2 h及1、3、7、14、21、28 d，采用改良神经功能缺损评分(modified neurological severity scores, mNSS)法，分别对各组动物从运动、感觉、反射和平衡测试方面进行评分(0~18分)，对所给任务不能完成或不能恰当反应得1分，神经功能受损愈重得分愈高。
1.3.6 脑梗死体积评估动物MCAO 1.5 h后再灌注，28 d后，取脑组织沿冠状面切成2 mm，经2% 2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑(2, 3, 5-Triphenyl tetrazolium chloride，TTC)染色、拍照，采用图像分析软件(Image-Pro Plus, Media Cybernetics Inc, USA)计算梗死体积。为排除组织水肿干扰，梗死体积=(未梗死侧半球面积-梗死侧半球非梗死面积)/未梗死侧半球面积×100%[13]。
1.3.7 在基因水平检测BMMSCs-Exo介导miR-124-1调控MG的M2型极化对脑卒中的影响设计、合成TNF-α(L00981.1)与CD206(NM_001106123.2)基因定量PCR检测引物(表 1)。分别以各组28 d脑组织总RNA为模板，定量PCR分别检测其各基因的表达变化，以Gapdh(AF106860.2)作内参。
| 基因 | 引物序列(5′→3′) |
| TNF-α | 上游：ACCAGCAGATGGGCTGTACC 下游：GCGGAGAGGAGGCTGACTTT |
| CD206 | 上游：TGGGCTTATGGAGAGCCAAA 下游：TCTGCAGTCACTGGTGGATT |
| Gapdh | 上游：TCAAGAAGGTGGTGAAGCAG 下游：AGGTGGAAGAATGGGAGTTG |
1.3.8 在蛋白水平检测BMMSCs-Exo介导miR-124-1调控MG的M2型极化对脑卒中的影响
采用Western blot法，把上述各组28 d脑组织总蛋白分别转到PVDF膜上，分别浸于TNF-α(1∶500)、CD206一抗(1∶600)的封闭液里，4~5 ℃，孵育约24 h，与其相应二抗再室温孵育2.5 h，同发光底物结合约15 min，内参照为GAPDH。将各组28 d脑组织包埋在一起，成组织芯片，制作4~5 μm切片，采用TNF-α、CD206抗体分别对各组织抗原行免疫荧光组织化学染色检测, 具体按各抗体及其相关试剂盒说明进行。荧光显微镜观察、拍照各切片TNF-α、CD206抗原的表达情况。
1.4 统计学分析采用SPSS 22.0软件对组间数据进行单因素方差和独立样本t检验分析，结果以x±s表示，P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 BMMSCs的分离培养与鉴定倒置显微镜下可见，原代BMMSCs多为圆形、不规则形，随后大多呈纺锤样、长梭形，以集落状散在分布。取培养7~10 d的单克隆细胞培养、扩增，待生长至80%~95%汇片时，再次传代培养，此时的细胞分布均匀，多为长梭形(图 1)，生长、增殖良好，增殖力明显优于原代细胞，7~9 d可再次传代扩增备用。流式细胞仪检测显示，BMMSCs显著表达中胚层细胞的标志分子CD44、CD90，阳性率分别为91.6%、93.8%；低表达或不表达造血细胞标志分子CD45，阳性率为0.8%(图 2)。
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| A：CD44；B：CD90；C：CD45 图 1 倒置显微镜下传代扩增的BMMSCs |
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| 图 2 流式细胞仪检测BMMSCs的CD44、CD90与CD45的阳性率 |
2.2 BMMSCs-Exo的获取及其鉴定
TEM观测证实，BMMSCs-Exo直径40~150 nm，其形态呈圆形、椭圆形囊泡(图 3A)。Western blot检测显示，其CD63、CD9标志蛋白的表达分别较BMMSCs明显增高(图 3B)，差异均有统计意义(P＜0.05，图 3C)。
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| A：BMMSCs-Exo的TEM鉴定; B：BMMSCs-Exo的Western blot鉴定; C：定量分析结果(n=3, x±s)；a：P＜0.05, 与BMMSCs比较 图 3 BMMSCs-Exo鉴定 |
2.3 BMMSCs及其Exo的miR-124-1过表达观测
未经感染的BMMSCs不表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)，见图 4A，被miR-124-1病毒感染的BMMSCs显著表达GFP(图 4B)，感染率超95%。定量PCR检测显示，与感染前比较，被感染的BMMSCs及BMMSCs-Exo，其miR-124-1的表达显著上调，差异均有统计意义(P＜0.05，图 4C)。
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| A: 未感染的BMMSCs; B: miR-124-1病毒感染的BMMSCs; C: qPCR检测结果(n=3, x±s) 1: Exo/124-1组; 2: BMMSCs/124-1组; 3: Exo组; 4: BMMSCs组; a: P<0.01, 与Exo组比较; b: P<0.01, 与BMMSCs组比较 图 4 BMMSCs及其Exo的miR-124-1过表达观测 |
2.4 Exo/124-1减少脑梗死体积及改善神经功能缺损
TTC染色显示，梗死脑组织呈亮白色，未梗死组织呈鲜红色(图 5A)。各组梗死组织染色表明，与MCAO/R组比较，Exo/124-1(P＜0.01)、Exo(P＜0.01)与Exo/Elv(P＜0.01)组均能有效缩减梗死体积，而Exo/124-1组的梗死体积明显小于Exo组和Exo/Elv组(P＜0.01，图 5B)，可见BMMSCs-Exo携带外源性miR-124-1可更好地减轻脑缺血/再灌注损伤。
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1: Sham组; 2: MCAO/R组; 3: Exo组; 4: Exo/Elv组; 5: Exo/124-1组；a: P＜0.05, b: P＜0.01, 与MCAO/R组比较 A：缺血再灌注28 d后大脑梗死体积大体观察；B：脑梗死体积的定量分析结果；C：神经功能受损评分 图 5 Exo/124-1改善神经功能缺损及减少脑梗死体积(n=3, x±s) |
术后2 h，除Sham组外，各组均出现不同程度的神经功能缺损(图 5C)。术后7 d，Exo/124-1组mNSS评分较MCAO/R组低(P＜0.05)。手术14 d后，Exo/124-1组mNSS评分更低于Exo/Elv组、Exo组(P＜0.01)。结果提示，Exo/124-1可有效改善脑梗死神经功能缺损。
2.5 BMMSCs-Exo介导miR-124-1调控MG的M2型极化对脑卒中的影响RT-qPCR(图 6)、Western blot(图 7)及免疫荧光组织染色(图 8)检测证实，与MCAO/R组比较，术后28 d，Exo/124-1能在基因、蛋白水平有效上调脑组织MG的M2型分子CD206，和下调其M1型分子TNF-α的表达，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结果提示，BMMSCs-Exo携带外源性miR-124-1可能诱导脑M1型MG向M2型转化，以促进脑卒中鼠神经功能恢复。
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1: Sham组; 2: MCAO/R组; 3: Exo组; 4: Exo/Elv组; 5: Exo/124-1组；a: P＜0.05, b: P＜0.01, 与MCAO/R组比较 A：CD206；B：TNF-α 图 6 qPCR检测Exo-124-1对脑卒中大鼠CD206和TNF-α mRNA表达的影响(n=3, x±s) |
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| A: Western blot检测 1: Sham组; 2: MCAO/R组; 3: Exo组; 4: Exo/Elv组; 5: Exo/124-1组；B：蛋白表达水平的定量分析 a: P＜0.05, b: P＜0.01, 与MCAO/R组比较 图 7 Western blot检测Exo-124-1对脑卒中大鼠CD206和TNF-α蛋白表达的影响(n=3, x±s) |
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| A：免疫荧光组织染色检测; B：定量分析(n=3, x±s) a: P＜0.05, b: P＜0.01, 与MCAO/R组比较 图 8 免疫荧光组织染色检测各组CD206及TNF-α的表达变化 |
3 讨论
脑卒中，尤其IS具有高发病率、致死率与低治愈率的特点，其患者呈逐年增多态势。神经性炎症存在于IS的发生发展全过程，严重影响IS的病情及其预后。MG介导的神经炎症在IS的病理过程中发挥重要作用。在不同的神经环境中，受不同环境物质的影响，MG可按M1或M2表型予以极化，行使其促炎、抗炎效能。极化为M1表型的MG，大量分泌以TNF-α为主的炎症因子[14]，促使炎症反应，加重IS神经组织的损伤；极化为M2表型的MG，则分泌以CD206为主的抗炎因子，以抑制炎症反应，促使IS受损神经组织的修复和重塑[15]。MG的既促炎又抗炎的双重作用，在脑卒中的救治研究中备受关注，如何更好地调控MG向M2表型极化成为IS救治的研究热点之一。本研究结果显示，术后7~28 d，在基因、蛋白水平，MCAO/R组的TNF-α表达明显高于Exo/124-1移植组，而CD206的表达，则显著低于Exo/124-1移植组，与文献报道一致。
MSCs明显表达中胚层细胞的标志分子CD44、CD90，不表达或低表达造血细胞标志分子CD45。其获得和扩增均较易。本研究分离培养的BMMSCs，其CD44、CD90及CD45的阳性率分别为91.6%、93.8%与0.8%，与文献报道一致。MSCs具有多向分化潜能，在适宜微环境中可分化为神经细胞，参与神经组织的损伤修复，在神经系统疾病的救治研究中得以广泛应用[15]。MSCs对受损组织的修复主要是通过其分泌的Exo(MSCs-Exo)予以实施的。MSCs-Exo是直径40~150 nm的双层膜结构，多呈圆形、椭圆形茶托样囊泡，CD63、CD9为其标志性蛋白[16]。电子显微镜和Western blot检测证实，本实验获得并使用的BMMSCs-Exo，其大小、形态与标志蛋白的表达等均和文献报道相符。Exo可向其靶细胞递送如miRNA等活性物，调节其基因表达，促使其胞间通信，以影响靶细胞的生物学功能[17]。MSCs-Exo还可促使MG向M2型极化[10]。
miRNA在细胞的生长[18]，BMMSCs的分化[19]，MG、巨噬细胞(macrophage，MP)的M2型转化[20-21]，受损组织的修复与重塑等过程中发挥着重要作用[5, 21]。MSCs的外泌体miRNA已被鉴定为通过促进神经发生、轴突重塑和存活及神经可塑性而具神经保护作用[22]。miR-124-1是神经元分化和神经系统发育的关键调节因子，可通过增加神经元活率、减轻以自噬体积累和溶酶体耗竭为特征的自噬过程受损、改变神经突触可塑性及调控神经炎症等机制发挥神经保护作用。其中，通过促使MG的极化以调控神经炎症，行使神经保护的机制备受关注。miR-124-1过表达可阻断可卡因介导的神经促炎细胞因子的上调，纹状体中慢病毒miR-124-1的立体定向给药能抑制可卡因介导的MG激活和运动过度活跃[21]。神经炎症可致创伤性脑损伤(traumatic brain injury, TBI)后继发性损伤，miR-124-1可促使MG的M2型极化以抑制TBI后的神经炎症，修复神经功能缺损[25]。miR-124-1通过调节MG的Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)的多种信号分子(TLR4、MyD88、TRAF6和IRAK1)及其下游信号转导分子的表达决定MG的极化状态[21, 23]。但单纯的miR-124-1应用，其效果比较有限[21, 23-24]。本实验将BMMSCs的Exo携带miR-124-1基因(Exo/124-1组)植入IS大鼠脑室，研究证实，术后7~28 d，Exo/124-1组mNSS明显低于MCAO/R组；术后28 d，Exo/124-1组，其MG的M2型分子CD206的表达显著高于对照组(MCAO/R组、Exo组及Exo/Elv组)，其脑梗死体积显著小于对照组。结果提示，BMMSCs的Exo携带外源miR-124-1基因，可致MG的M2型极化，以促使局部受损神经的修复，发挥其脑卒中治疗作用。
综上所述，BMMSCs的Exo携带外源性miR-124-1基因，可能在动物水平调控MG的M2型极化，介导脑缺血/再灌注局部炎症反应，致其受损神经组织修复，达治疗脑卒中之目的。本实验仅在小动物水平进行了尝试，其大动物水平及临床研究是否一致，需进一步证实。
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