2. 400042 重庆，陆军特色医学中心神经内科
2. Department of Neurology, Army Medical Center of PLA, Chongqing, 400042, China
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种神经退行性疾病，其特征在于含有β-淀粉样蛋白(Amyloid β, Aβ)的细胞外斑块和tau蛋白的细胞内神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFT)[1]。在65岁及以上的美国人中，AD位居第五大死因，且死亡人数呈逐年增加趋势[2]。胰淀素(islet amyloid polypeptide, IAPP)是由胰岛β细胞分泌的一种含有37-氨基酸残基的长肽[3]。IAPP沉积是2型糖尿病(diabetes mellitus type 2，T2DM)的典型病理特征，且错误折叠的IAPP可以在AD和T2D患者的大脑中聚集和沉积[4-5]。目前，IAPP与Aβ相互作用对AD的影响，仍没有达成共识。有研究表明，IAPP作为一种调节葡萄糖稳态的脑肠神经肽调节剂, 广泛存在于脑中[6]，IAPP与Aβ可通过交叉播种相互作用，形成神经元外淀粉样斑块沉积，并促进Aβ聚集，造成认知功能损伤，导致AD的发生发展[7-9]。另一些研究发现，可溶性IAPP与AD的Aβ具有高亲和力，并抑制Aβ的纤维生成和细胞毒性，减少Aβ斑块生成[10-11]。动物实验研究表明，在小鼠外周注射IAPP或其非淀粉样蛋白生成类似物普兰林肽后，Aβ从大脑转移到血液增加，改善AD小鼠认知功能[12-15]。IAPP成为AD治疗和预防的潜在分子靶点。对IAPP分子功能及其与Aβ之间的相互作用对研究AD的发病机制和治疗具有重要意义。
circRNA是一类缺乏典型的5’帽和3’多聚A尾，并共价闭合的新的非编码RNA，circRNA对核酸外切酶的消化具有高度抗性并且相对稳定，通过海绵化特定的microRNA来调节基因表达，虽然它们被认为是非编码RNA，但一些circRNA已被证明具有产生肽的潜力[16]。有研究发现，circRNA在哺乳动物的大脑中具有高度代表性，在衰老、神经发育和突触活动中发挥调节作用，可能导致AD的发展[17-18]。
目前，IAPP对AD的作用尚不清楚。与AD相关的circRNA的功能了解甚少，但circRNA的稳定性和特异性表达谱表明circRNA是治疗AD的候选者，并受到广泛关注。本研究利用基因芯片技术检测IAPP腹腔注射后AD小鼠脑组织中circRNA和mRNA表达谱变化，并对筛选的差异转录本进行分析，探究IAPP腹腔注射对AD小鼠脑组织中circRNA表达谱的影响，识别和验证关键circRNA，为开发治疗AD的circRNA相关核苷酸药物提供新的分子靶点。
1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器IAPP购自重庆市思恩特医疗器械有限公司，Arraystar Mouse circRNA Array V2及配套试剂盒购自美国Arraystar公司，TRIzol试剂和SuperScriptTM Ⅲ RT master mix试剂盒购自美国Invitrogen公司，RNA酶试剂盒购自美国Qiagen公司，2×PCR master mix试剂盒购自美国Arraystar公司。
NanoDrop Ⓡ ND-1000分光光度仪为美国NanoDrop公司产品，Agilent Scanner G2505C、Agilent Feature Extraction (v11.0.1.1)软件、GeneSpring GX (v12.1)软件为美国Agilent公司产品，QuantStudio5 Real-time PCR System为美国Applied Biosystems公司产品。
1.2 小鼠脑组织样本脑组织样本取自腹腔注射IAPP溶液和相同剂量磷酸盐缓冲液的10月龄雄性APP/PS1转基因AD模型小鼠和C57野生型老年小鼠[C57WT，购自南京君科生物工程有限公司，动物许可证号：SCXK(苏)2020-0009]，体质量20~30 g，AD小鼠和C57 WT小鼠各6只，使用随机数字表法分为4组：AD+IAPP、WT+IAPP、AD+PBS与WT+PBS，每组各3只小鼠。IAPP溶液浓度0.5 μmol/L，溶剂为PBS，剂量200 μg/kg，每日1次。腹腔注射IAPP溶液干预时间均为10周，结束后立即颈椎脱位处死，剥离完整脑组织，保存在-80 ℃冰箱中备用。实验过程中遵循实验动物伦理规定。
1.3 基因芯片测序和数据分析总RNA提取按照TRIzol试剂盒说明操作。使用Arraystar Mouse circRNA Array V2及配套试剂盒完成基因芯片杂交；NanoDrop Ⓡ ND-1000测定RNA浓度和纯度；Agilent Scanner G2505C对基因芯片进行扫描。根据扫描结果，使用Agilent Feature Extraction软件读取芯片信号强度和获得原始数据；GeneSpring GX(v12.1)软件将原始数据标准化处理后进行差异表达分析。差异表达的circRNA和mRNA筛选条件为：差异倍数的绝对值≥1.5，P值<0.05且FDR<0.5。
1.4 qRT-PCR验证circRNA的表达选取具有潜在生物学功能的6个差异表达的circRNA进行qRT-PCR检测。使用TRI Reagent抽提AD+IAPP与WT+IAPP脑组织总RNA，NanoDrop Ⓡ ND-1000测定RNA浓度和纯度。按照SuperScriptTM Ⅲ Reverse Transcriptase kit说明书，将提取的RNA逆转录为cDNA。逆转录条件为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。使用Primer 5.0设计引物，引物序列见表 1。将所得cDNA按照2×PCR master mix试剂盒说明进行扩增，反应条件为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，40个循环。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，由反应曲线得出阈值循环参数后，应用QuantStudioTM 5 real-time PCR仪分析荧光阈值(cyclethreshold，Ct)。使用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。重复3次实验，结果取平均值。
| 基因名(CircRNA) | 引物序列 | 产物长度/bp |
| circRNA_35138 | 正向: 5′-TAGCGTCTGCCCTAAGAGGTA-3′ 反向: 5′-CCACTTGTGCCAATTTGTTGT-3′ |
181 |
| circRNA_38989 正向引物 |
正向: 5′-TCCTGAAGCGGACTCACCAA-3′ 反向: 5′-GGATTTGCCAATACCTGTCTCACT-3′ |
192 |
| circRNA_22593 正向引物 |
正向: 5′-ATGTGGGTGGCTTATCTGG-3′ 反向: 5′-ACTGCGGATGTTGGTTGTT-3′ |
61 |
| circRNA_36807 | 正向: 5′-TTCGGGATGAGCACAAGGT-3′ 反向: 5′-GGCTGATTGTCATGGTGGAA-3′ |
71 |
| circRNA_38835 | 正向: 5′-GCTTATCGTGCCAACTTCTGT-3′ 反向: 5′-GAGTGATGTCAAAAAGTGACCTGT-3′ |
105 |
| circRNA_45921 | 正向: 5′-ATGTGGGAGCGTGGAGATAA-3′ 反向: 5′-CATCACGGTCAGCATTCTTG-3′ |
298 |
| GAPDH | 正向: 5′-CACTGAGCAAGAGAGGCCCTAT-3′ 反向: 5′-GCAGCGAACTTTATTGATGGTATT-3′ |
144 |
1.5 GO富集分析与KEGG通路富集分析
将差异表达的mRNA导入GO数据库(http://www.geneontology.org)进行富集分析，对分子功能、生物过程和细胞成分3个领域的GO条目上差异表达基因的数目进行分析，从而获得显著富集的GO条目和预测差异表达基因的生物学功能。将差异表达的mRNA导入KEGG数据库(http://www.genome.jp/kegg)进行通路富集分析，获得差异表达的mRNA显著富集的信号通路。
1.6 CeRNA网络构建CeRNA假说表明mRNA和circRNA转录本可以通过microRNA反应元件与microRNA靶向结合来相互调控基因表达。为了寻找mRNA和circRNA与microRNA的潜在靶点，采用基于TargetScan和miRanda的miRNA靶点预测数据库进行预测。根据预测结果，通过合并mRNA和circRNA共同的靶向miRNA，利用Cytoscape构建ceRNA网络图。
1.7 统计学分析差异表达基因筛选使用R-4.1，应用Graphpad Prism 8.0统计学软件进行数据分析和统计图绘制，组间比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 circRNA和mRNA的差异表达分析AD+IAPP与WT+IAPP芯片测序结果显示，显著差异表达的circRNA共有237个，其中157个上调，80个下调；显著差异表达mRNA共有663个，其中348个上调，315个下调，见图 1。热图显示，AD+IAPP与WT+IAPP小鼠脑组织的circRNA和mRNA基因表达谱存在显著差异，见图 2。差异表达前10位的circRNA和mRNA见表 2。这些差异表达的circRNA和mRNA在AD+PBS与WT+PBS小鼠之间并不存在差异表达，见表 3，说明这些差异表达的circRNA和mRNA均受IAPP调节。
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| 红色为显著上调基因; 绿色为显著下调基因; 灰色为无差异变化的基因 图 1 AD+IAPP与WT+IAPP小鼠比较差异表达circRNA(A)和mRNA(B)的火山图 |
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| 1~3：WT+IAPP组；4~6：AD+IAPP组；纵轴为基因聚类，1行代表 1个基因；红色表示上调，绿色表示下调，颜色越亮基因相对表达量越高 图 2 AD+IAPP与WT+IAPP小鼠比较差异表达circRNA(A)和mRNA(B)的热图 |
| CircRNA | mRNA | |||||||
| 基因名称 | 差异倍数 | P值 | 上/下调 | 基因名称 | 差异倍数 | P值 | 上/下调 | |
| circRNA_39081 | 3.288 | 0.046 | 上调 | Gm42417 | 2.736 | 0.003 | 上调 | |
| circRNA_26540 | 3.262 | 0.029 | 上调 | Paip2 | 2.652 | 0.009 | 上调 | |
| circRNA_22892 | 2.881 | 0.045 | 上调 | Cdon | 2.637 | 0.002 | 上调 | |
| circRNA_39877 | 2.872 | 0.046 | 上调 | Cmtm3 | 2.457 | 0.003 | 上调 | |
| circRNA_43335 | 2.856 | 0.031 | 上调 | Erbb3 | 2.429 | 0.003 | 上调 | |
| circRNA_24245 | 5.562 | 0.016 | 下调 | Ttr | 28.286 | 0.000 | 下调 | |
| circRNA_45921 | 5.346 | 0.026 | 下调 | 1500015O10Rik | 19.173 | 0.000 | 下调 | |
| circRNA_29625 | 4.465 | 0.019 | 下调 | F5 | 6.497 | 0.000 | 下调 | |
| circRNA_007951 | 3.705 | 0.023 | 下调 | Aldh1a2 | 5.236 | 0.003 | 下调 | |
| circRNA_19469 | 3.269 | 0.023 | 下调 | Tmem212 | 5.066 | 0.004 | 下调 | |
| CircRNA | mRNA | |||||||
| 基因名称 | 差异倍数 | P值 | 上/下调 | 基因名称 | 差异倍数 | P值 | 上/下调 | |
| circRNA_39081 | 1.558 | 0.262 | 无差异 | Gm42417 | 1.054 | 0.755 | 无差异 | |
| circRNA_26540 | 1.651 | 0.080 | 无差异 | Paip2 | 2.017 | 0.120 | 无差异 | |
| circRNA_22892 | 1.348 | 0.166 | 无差异 | Cdon | 1.055 | 0.445 | 无差异 | |
| circRNA_39877 | 1.352 | 0.086 | 无差异 | Cmtm3 | 1.073 | 0.745 | 无差异 | |
| circRNA_43335 | 1.439 | 0.083 | 无差异 | Erbb3 | 1.167 | 0.444 | 无差异 | |
| circRNA_24245 | 3.270 | 0.179 | 无差异 | Ttr | 5.045 | 0.169 | 无差异 | |
| circRNA_45921 | 3.634 | 0.194 | 无差异 | 1500015O10Rik | 4.355 | 0.147 | 无差异 | |
| circRNA_29625 | 2.566 | 0.235 | 无差异 | F5 | 3.456 | 0.146 | 无差异 | |
| circRNA_007951 | 2.241 | 0.141 | 无差异 | Aldh1a2 | 2.526 | 0.143 | 无差异 | |
| circRNA_19469 | 2.273 | 0.125 | 无差异 | Tmem212 | 1.734 | 0.240 | 无差异 | |
2.2 qRT-PCR验证circRNA的表达
为了验证芯片结果的可靠性，挑选具有潜在生物学功能的6个差异表达的circRNA进行qRT-PCR验证，结果显示，AD+IAPP与WT+IAPP相比，circRNA-35138、circRNA-38989、circRNA-22593表达显著上调(P<0.05)，circRNA-36807、circRNA-38835、circRNA-45921表达显著下调(P<0.05)，见图 3。qRT-PCR检测结果与基因芯片结果一致，提示circRNA基因芯片测序结果可靠。
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a: P<0.05, b: P<0.01 AD为阿尔茨海默病鼠；WT为野生型老年鼠；IAPP为胰淀素 图 3 AD+IAPP与WT+IAPP小鼠脑组织目的基因相对表达量 |
2.3 差异表达mRNA的GO和KEGG通路富集分析
GO富集分析显示：663个差异表达的mRNA被富集到1 019个GO条目，其中348个上调mRNA被富集到525个GO条目。315个下调的mRNA被富集到494个GO条目，差异均有统计学意义(P<0.05)。差异表达上调的mRNA在分子功能领域主要富集于核苷磷酸结合、催化剂活性等；在细胞组分领域主要富集于细胞器、细胞质等；在生物过程领域主要富集于含磷酸盐化合物代谢过程、初级代谢过程等。差异表达下调的mRNA在分子功能领域主要富集于跨膜信号受体活性、分子传导活性等；在细胞组分领域主要富集于膜固有成分、超分子纤维等；在生物过程领域主要富集于组织发育、系统进程等。差异表达mRNA在分子功能、细胞成分、生物过程3个领域富集评分前10的GO条目见图 4。
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| A：显著上调的差异表达mRNA的GO条目；B：显著下调的差异表达mRNA的GO条目 图 4 AD+IAPP与WT+IAPP小鼠相比差异表达的mRNA在分子功能、细胞成分和生物学过程3个领域的GO分析 |
KEGG富集分析显示: 663个差异表达的mRNA被富集到16个通路，其中348个上调的mRNA被富集到8个通路，315个下调的mRNA被富集到8个通路，差异均有统计学意义(P<0.05)。差异表达上调的mRNA主要富集于胰岛素分泌、氧化磷酸化、帕金森病等信号通路；差异表达下调的mRNA主要富集于神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路、酪氨酸代谢、苯丙氨酸代谢等信号通路。KEGG富集分析评分前10位的通路见图 5。
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| A：显著上调的差异表达mRNA的富集通路; B: 显著下调的差异表达mRNA的富集通路 图 5 AD+IAPP与WT+IAPP小鼠相比差异表达的mRNA的KEGG分析 |
2.4 CeRNA分析
AD+IAPP与WT+IAPP小鼠相比，circRNA_45921显著下调，qRT-PCR验证结果与芯片结果相同。因此，选择circRNA_45921作为miRNA靶点构建ceRNA网络, 见图 6。CeRNA网络分析表明，circRNA_45921与miR-34c-5p靶向结合具有较高的预测评分。miR-34c-5p与真核细胞延伸因子2激酶(eukaryotic elongation factor 2 kinase，Eef2k)靶向结合具有较高的预测评分。合并circRNA_45921和Eef2k的共同靶向miRNA，获得了circRNA_45921的ceRNA网络circRNA_45921/miR-34c-5p/Eef2k调控网络。
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| 棕色表示 circRNA；红色表示 microRNA；蓝色表示 mRNA 图 6 circRNA_45921的ceRNA分析 |
3 讨论
在生理条件下，IAPP与胰岛素协同从胰岛β细胞释放，共同调节糖代谢[19]。在AD或T2DM小鼠，IAPP可因聚集和沉积而失去功能，形成有毒的低聚物和淀粉样纤维[20]。研究发现，IAPP可与Aβ相互作用共同沉积在脑内，加重AD病理[7-8]。本研究采用基因芯片技术，AD+IAPP与WT+IAPP测序结果比较，共有663个差异mRNA，包括上调的Paip2、Cdon和下调的Ttr。多聚(A)结合蛋白相互作用蛋白2(Paip2)是一种翻译抑制蛋白，有研究发现抗Paip2自身抗体的产生与ApoE4有关，APOE是迟发型阿尔兹海默症(AD)的主要风险因子，Paip2可能与脑内炎性病理相关。抗Paip2自身抗体升高与MCI和AD的风险显著相关，认为其可能是AD的潜在诊断生物标志物[21-22]。癌基因下调的细胞黏附分子相关蛋白(Cdon)是一种凋亡诱导蛋白，其下调对于促进SH-SY5Y神经细胞存活是必需的[23]。在体试验表明，Cdon可能与TNF-α、Il-1β相互作用调节神经炎症。Cdon敲除小鼠的血脑屏障紧密性导致白细胞浸润减少，小胶质细胞和星形胶质细胞活化减少以及神经元存活增加[24]。转甲状腺素(Ttr)是血浆和脑脊液中甲状腺素和视黄醇的载体蛋白，已被证明可以与Aβ结合。不仅如此，Ttr还被认为可以防止Aβ沉积[25]。ZISKIN等[26]通过磷酸化tau免疫染色发现，在皮层区域，Ttr蛋白沉积的下方观察到磷酸化tau聚集体，这表明Ttr和tau病理之间存在潜在联系。腹腔注射IAPP使得Paip2和Cdon的表达上调，Ttr的表达下调，可能导致Aβ的沉积增加、Tau蛋白磷酸化和神经炎症相关分子表达增加。提示腹腔注射IAPP可能通过Paip2、Cdon和Ttr调节AD的发生和发展[27]。一项与本研究类似的实验结果显示，腹腔注射IAPP降低了大脑皮质和海马Aβ的沉积，增加脑脊液Aβ水平。同时，腹腔注射IAPP改善了转基因AD鼠的认知功能，而对野生型老年鼠没有影响[13]。本研究为IAPP的分子机制提供了新的见解，IAPP通过Paip2、Cdon或Ttr调节Aβ、tau病理和脑内炎性病理，有待进一步研究。
AD+IAPP与WT+IAPP比较，显著差异表达的circRNA共有237个。包括上调的circRNA_39081和下调的circRNA_45921等。相关研究表明，circRNA_39081的亲本基因Sparcl1在人和小鼠海马中均存在circRNA转录本(如hsa_circ_0127250, mmu_circ_0011950)。circRNA_45921的亲本基因Phka2在人前额叶、颞叶、间脑存在circRNA转录本(如hsa_circ_0140034)[28]。本研究通过circRNA芯片测序小鼠脑组织存在Sparcl1和Phka2的circRNA转录本。研究表明，circPhka2在人脑内是一种环状且稳定的转录物，主要位于细胞质中。circPhka2可以靶向结合miR-574-5p，上调SOD2和降低Bax表达，促进细胞增殖，抑制凋亡和氧化应激[29]。并且miR-574-5p在3′UTR具有与BACE1(β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1，β-secretase)结合位点。BACE1不仅促进Aβ的沉积，而且增加的BACE1活性可能影响正常的突触功能，导致认知障碍[30]。AD小鼠腹腔注射IAPP使circRNA_45921表达下调，IAPP可能通过circRNA_45921/miR-574-5p/BACE1轴调控Aβ沉积和AD的进展。CircPAIP2是一种保留内含子的circRNA，它上调记忆相关的亲代基因Paip2[31]。IAPP腹腔注射可能通过相关circRNA上调Paip2、Cdon和下调Ttr的表达，调节AD的发展。同时，circRNA_39081和circRNA_45921也可能是潜在的AD诊断分子标志物和治疗靶点。
本研究GO和KEGG富集分析结果表明，IAPP可能通过细胞器、胰岛素分泌、氧化磷酸化、帕金森病等途径参与调节AD的发生发展。相关研究发现，IAPP可使细胞膜过度弯曲而破坏膜结构，导致AD和帕金森病的发生[32]。IAPP和胰岛素是由胰岛β细胞共包装和协同分泌，胰岛素抵抗可能导致AD病理，IAPP破坏囊泡功能，与阿尔茨海默病和帕金森病的发病机制有关[33-34]。IAPP诱导tau蛋白磷酸化，在体外和体内增强tau蛋白的神经元毒性，导致小鼠突触功能障碍和记忆缺陷[35]。本研究为IAPP参与AD调节的作用机制研究提供了新的方向，IAPP可能通过具有调节胰岛素分泌、帕金森病或氧化磷酸化作用的基因(如COX6c)改变AD的病理表现。
CeRNA结果表明，circRNA_45921/miR-34c-5p/Eef2k调控网络显示较高预测评分。已有研究表明，miR-34c-5p的过度表达显著降低了微管相关tau蛋白(microtubule-associated protein tau，MAPT)的表达[36]。Eef2k诱导Eef2过度磷酸化，导致蛋白质合成受到抑制。Eef2k减少改善了记忆缺陷和海马长时程增强损伤，而不改变Aβ病理[37]。这提示circRNA_45921/miR-34c-5p/Eef2k调控网络可能在IAPP调节AD发生发展过程中发挥作用，也为IAPP作用的分子机制提供新的思路。
本研究取材自小鼠脑组织进行芯片测序，没有进行细胞水平更加深入的研究，以验证所确定的circRNA功能及其与IAPP之间的作用关系；结果显示Ttr下调，相关研究表明Ttr可能是治疗AD的靶点[38]，本研究没有对IAPP功能进行进一步验证。
综上所述，本研究结果表明AD+IAPP与WT+IAPP相比，两组小鼠脑组织中circRNA和mRNA的表达谱均发生改变。差异表达的circRNA如circRNA_45921，可能通过circRNA_45921/miR-574-5p/BACE1轴调节Aβ沉积和AD的进展。差异表达的mRNA如Paip2、Cdon和Ttr等可能导致Aβ的沉积增加、Tau蛋白磷酸化和神经炎症相关分子表达增加。差异表达的mRNA主要通过胰岛素分泌、氧化磷酸化、神经活性配体-受体相互作用等通路参与调节AD的发生发展。circRNA_45921/miR-34c-5p/Eef2k调控网络可能在IAPP调节AD的发生发展中起作用。
利益冲突声明 所有作者声明不存在利益冲突
作者贡献声明 侯明亮：实验操作、论文撰写；马琳秋、李金平、黄洁、廖旗荣、杨红岩：数据整理；李小雄、马琳秋：统计学分析；周华东：研究指导、论文修改、经费支持
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