2. 400016 重庆，生殖生物学实验室，教育部生殖与发育国际合作联合实验室;
3. 400016 重庆，重庆医科大学基础医学院;
4. 410219 长沙，长沙医学院基础医学院;
5. 401331 重庆，重庆医科大学：中医药学院
2. Department of Reproductive Biology, Joint International Research Laboratory of Reproductive and Development, Chongqing Medical University, Chongqing, 400016;
3. College of Basic Medical Sciences, Chongqing Medical University, Chongqing, 400016;
4. College of Basic Medicine, Changsha Medical University, Changsha, Hunan Province, 410219, China;
5. College of Traditional Chinese Medicine, Chongqing Medical University, Chongqing, 401331
人类胎盘绒毛外滋养细胞(extravillous trophoblast，EVT)侵入母体蜕膜并重塑螺旋动脉[1]，对于妊娠早期成功建立母-胎循环具有重要作用[2]。孕早期氧张力的动态变化可能影响EVT细胞功能，如自噬-溶酶体机制等[3]，缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)则可能影响细胞的上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程和侵袭过程[4-5]。EMT过程中滋养细胞会表现出细胞黏附丧失、顶端-基底极性下调、迁移潜能增加[6]、细胞骨架重组和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的表达增加[7-8]，Snail、Slug和Twist等调控EMT的转录因子表达升高[9-12]。异常的EMT过程会引起滋养细胞侵袭受损并可能与妊娠并发症，如早期流产、子痫前期(preeclampsia，PE)和宫内生长受限[13-14]等疾病的发生相关。
在不同滋养细胞系中的研究还表明，DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMTs)调控的DNA甲基化水平变化与滋养细胞的EMT发生相关，影响其迁移和侵袭相关表型[15]。敲低DNMT3A的表达可以调节胰岛素样生长因子结合蛋白5抑制滋养层细胞的迁移和侵袭[16]。然而在妊娠早期H/R环境下，触发滋养细胞发生EMT的信号还未被完全阐述，DNMTs是否参与其中亦不清楚，值得深入探究。
因此，本研究利用体外培养EVT永生化细胞系HTR-8/SVneo、早孕胎盘绒毛分离的原代EVT细胞和绒毛外植体，在1% O2和20% O2浓度转换条件下模拟EVT细胞侵入子宫时的H/R环境，探究DNMTs通过调控EVT细胞EMT标志物的表达从而影响其迁移和侵袭能力的分子机制，初步阐释滋养细胞侵袭相关妊娠疾病的潜在发病机制。
1 材料与方法 1.1 细胞培养和转染本课题中人绒毛滋养层细胞系HTR-8/SVneo由加拿大Charles Graham博士馈赠[17]，保存于本实验室，其培养条件为：RPMI1640培养基(Thermo Fisher，USA)，加入体积分数10%胎牛血清(Corning，USA)，以及1%青霉素-链霉素溶液(碧云天，中国)。通过瞬时转染技术，将含有空载和DNMT1、DNMT3A和DNMT3B全长序列的PCMV6载体(ORIGENE，USA)和Lipo8000TM转染试剂(碧云天，中国)在6孔板中分别转染HTR-8/SVneo细胞，48 h后，利用Western blot检测过表达效率。
1.2 原代EVT细胞分离和培养方法早孕胎盘绒毛(孕6~8周，n＝6)取自重庆医科大学附属第一医院门诊部自愿人工引产的妊娠早期妇女，且征得知情同意。原代EVT的分离参考已经发表的方法[18-19]。本研究严格遵照重庆医科大学实验伦理委员会的管理和规定并获得实验伦理委员会批准(审批号：2022138)。
1.3 缺氧/复氧(H/R)处理原代EVT和HTR-8/SVneo细胞均接受H/R处理，细胞在三气培养箱(Thermo ScientificTM，USA)中37 ℃、5% CO2和1% O2条件下，无血清培养基中培养24 h，然后转移至20% O2条件下培养24 h(H/R组)。实验期间37 ℃、5% CO2和20% O2培养作为阴性对照(对照组)。
1.4 Western blot检测收集的蛋白样品经SDS-PAGE凝胶电泳后转移至PVDF膜，封闭后添加一抗vimentin(bs-42002R，博奥森，中国)，E-cadherin(AF0138，碧云天，中国)，N-cadherin(AF0243，碧云天，中国)，β-actin(BM0627，博士德，中国)，DNMT1(5032，CST，USA)，DNMT3A(3698S，CST，USA)，DNMT3B(67259，CST，USA)，Slug(9585T，CST，USA)，Snail(3879T，CST，USA)，integrin-β1(AF1171，碧云天，中国)，integrin-α5(98204S，CST，USA)，MMP-2(ab92536，Abcam，UK)，MMP-9(AF5234，碧云天，中国)，4 ℃孵育过夜。经二抗孵育和洗膜后使用ECL化学发光显色液(新赛美，中国)显影，凝胶成像系统(Bio-Rad，USA)拍照。Quantity One软件分析条带灰度值，以β-actin作为内参蛋白。
1.5 免疫荧光使用HLA-G(66447-1-Ig，Proteintech，USA)对分离的原代EVT细胞进行纯度鉴定。将贴壁的原代EVT细胞用PBS清洗后，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗涤5 min×3次，0.3%Triton X-100通透10 min，PBS洗涤5 min×3次，10%山羊血清+3% BSA于37 ℃封闭1 h，HLA-G一抗(1 ∶300稀释)4 ℃孵育过夜；第2天，PBS洗涤5 min×3次后，FITC标记荧光鼠二抗37 ℃孵育1 h，PBS洗涤5 min×3次，用DAPI染色工作液，室温避光孵育15 min，PBS清洗后，用抗荧光猝灭剂封片，激光共聚焦显微镜下拍照，采集图像。
1.6 Transwell细胞迁移和侵袭实验收集经过H/R处理的1×104个细胞重悬于300 μL无血清培养基中，迁移实验直接将细胞悬液加入Transwell小室(Corning，USA)。侵袭实验需将Matrigel胶(Corning，USA)与无血清培养基以1 ∶11的比例包被Transwell小室然后将细胞悬液接种入预处理的Transwell小室中。2组实验均在下室加入600 μL完全培养基，将Transwell小室在37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，随后用PBS洗涤Transwell小室3次，棉签拭去小室内多余细胞，冰甲醇固定30 min后苏木精染色。在光学显微镜下进行拍照和细胞数目统计。
1.7 绒毛外植体培养用无菌PBS清洗组织，去除母体子宫内膜和胎膜，用剪刀剪取3~4 mm绒毛片段，置于预先包被Matrigel胶(Matrigel ∶DMEM=1 ∶19)的孔板中，37 ℃聚合30 min。最后加入1 mL完全培养基(含有20%胎牛血清，1%青霉素-链霉素)，将H/R处理组孔板置于缺氧条件下的三气培养箱中(37 ℃、5% CO2、3% O2)培养48 h，然后转移至20% O2条件下培养24 h(H/R组)；实验期间以20% O2培养作为对照(对照组)。每隔24 h观察绒毛外植体存活和外延情况，并通过Image J计算外植体外延面积。
1.8 统计学分析使用GraphPad 8.0.2软件进行统计分析。组间比较采用独立t检验。所有实验独立至少重复3次。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 H/R减弱HTR-8/SVneo细胞的迁移和侵袭对HTR-8/SVneo细胞进行H/R处理后，进行迁移和侵袭实验，Transwell结果显示，与对照组细胞相比，H/R处理的HTR-8/SVneo细胞迁移和侵袭穿过小室膜到达下室细胞数量显著减少(图 1A)，分别约为对照组的69.2%和77.0%(P＜0.01，图 1B)。实验结果说明，H/R可以减弱HTR-8/SVneo细胞的迁移和侵袭能力。
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| A：Transwell检测H/R对HTR-8/SVneo细胞迁移和侵袭影响；B：H/R对HTR-8/SVneo细胞迁移和侵袭的统计结果 a：P＜0.01，与对照组比较 图 1 Transwell法检测H/R对HTR-8/SVneo细胞迁移和侵袭的影响 |
2.2 H/R减弱绒毛外植体的外延能力
与对照组相比，H/R组的绒毛外植体迁移到外延生长区域的细胞更少(图 2A)，在48 h和72 h，H/R组绒毛外植体从绒毛尖部迁移出的平均距离小于对照组(P＜0.05，图 2B)。并且H/R组细胞平均外延区域的面积占绒毛外植体总面积的百分比无论是在48 h还是72 h均表现出明显的下降(P＜0.05，图 2C)。上述结果表明，H/R处理会对体外培养的绒毛外植体产生消极影响，降低其外延能力。
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a: P＜0.05, b: P＜0.01，与对照组比较 A：培养24、48和72 h H/R对绒毛外植体生长影响；B：绒毛外植体的平均迁移距离；C：绒毛外植体的平均外延面积占绒毛外植体总面积的比例 图 2 体外培养的绒毛外植体的外延能力 |
2.3 H/R抑制原代EVT细胞迁移和侵袭
为了进一步明确H/R对EVT细胞侵袭和迁移的影响，从正常绒毛中分离获得了较高纯度的原代EVT细胞，免疫荧光显示分离的细胞中EVT(HLA-G阳性)细胞所占比例约为81.61%(图 3A)。Transwell结果显示，与对照组相比，原代EVT细胞经H/R处理后，迁移和侵袭穿过小室到达下室细胞数量显著减少，分别为对照组的49.5%和53.9%(P＜0.01，图 3B)。结果表明，H/R处理也会降低原代EVT细胞的迁移和侵袭能力。
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| A：免疫荧光检测HLA-G蛋白表达；B：Transwell法检测H/R对原代EVT细胞迁移和侵袭的影响；C：H/R对EVT细胞迁移和侵袭的统计 a：P＜0.01，与对照组比较 图 3 原代EVT细胞纯度及H/R后对迁移和侵袭的影响 |
2.4 H/R抑制EVT细胞侵袭相关因子的表达
为了进一步论证H/R处理抑制细胞迁移和侵袭的潜在机制，使用Western blot对细胞侵袭相关因子的蛋白进行检测。结果显示，在H/R处理后的HTR-8/SVneo细胞和原代EVT细胞中MMP-2和MMP-9的表达发生了明显下调(P＜0.05，图 4A)。同样，integrin-β1和integrin-α5的表达在H/R处理后的两种细胞中也显著降低(P＜0.05，图 4B)。结果表明：H/R诱导不仅观察到原代EVT和HTR-8/SVneo细胞迁移侵袭能力下降，同时伴随着对侵袭相关因子MMP-2和MMP-9及integrin-β1和integrin-α5的抑制。
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a：P＜0.05，b：P＜0.01，与对照组比较 A：MMP-9和MMP-2在HTR-8/SVneo和原代EVT细胞中的蛋白表达；B：integrin-β1和integrin-α5在HTR-8/SVneo和原代EVT细胞中的蛋白表达 图 4 H/R抑制EVT细胞侵袭相关因子的表达 |
2.5 H/R减弱原代EVT细胞中的EMT发生
滋养细胞的分化过程伴随着EMT的发生而增强侵袭能力，我们同时检测了H/R对滋养细胞的EMT相关因子的影响。结果表明，在HTR-8/SVneo细胞上皮型标志因子E-cadherin表达量极低，H/R处理后表达几乎不受到影响；间质型标志因子N-cadherin和vimentin的表达未发生显著性变化；而E-cadherin的表达在原代EVT细胞中显著上调(P＜0.01，图 5A)。此外，H/R条件下EMT促进因子Slug和Snail在HTR-8/SVneo细胞表达未受到显著影响，但在原代EVT细胞中的表达受到显著抑制(P＜0.05，图 5B)。以上结果表明，H/R减弱了原代EVT细胞的EMT进程，而在HTR-8/SVneo细胞中未有明显变化。
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a：P＜0.05, b：P＜0.01，与对照组比较 A：E-cadherin、N-cadherin和vimentin在HTR-8/SVneo和原代EVT细胞中的蛋白表达；B：Slug、Snail在HTR-8/SVneo和原代EVT细胞中的蛋白表达 图 5 H/R影响原代EVT细胞中EMT相关因子的表达 |
2.6 H/R通过DNMTs调控EMT相关因子的表达
DNA甲基转移酶DNMTs的表达水平可影响滋养细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结果显示，H/R处理后，在HTR-8/SVneo细胞和原代EVT细胞中DNMT1、DNMT3A表达下降(P＜0.05)，DNMT3B仅在HTR-8/SVneo细胞表达有所降低(P＜0.05)，在原代EVT细胞中未见明显变化(图 6A)。在HTR-8/SVneo细胞中对DNMT1、DNMT3A和DNMT3B进行过表达后，间质型标志因子N-cadherin、基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的表达均发生上调(P＜0.05)；其中MMP-2和MMP-9受到DNMT3A的影响较为显著，N-cadherin主要受到DNMT1的影响(图 6B)。这表明滋养细胞中侵袭相关因子和EMT相关因子的表达变化可能受到DNMT1、DNMT3A的调控。
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a：P＜0.05, b：P＜0.01，与对照组比较 A：H/R处理后DNMT1、DNMT3A、DNMT3B在HTR-8/SVneo和原代EVT细胞中的蛋白表达；B：过表达DNMTs后N-cadherin、MMP-2、MMP-9、vimentin在HTR-8/SVneo细胞中蛋白表达 图 6 H/R通过DNMTs调控EMT相关因子的表达 |
3 讨论
妊娠早期胎盘EVT的迁移和侵袭受到缺氧环境的调节[20]。缺氧/复氧(H/R)调控异常会导致EVT浸润不足和子宫螺旋动脉重构异常，这可能是导致先兆子痫和多种妊娠并发症发生的主要原因[21-23]。
本研究采用缺氧/复氧(H/R)条件处理HTR-8/SVneo细胞，早孕绒毛分离原代EVT细胞和早孕绒毛外植体，结果发现两种细胞的迁移和侵袭能力以及绒毛外植体的外延能力均被减弱，侵袭相关蛋白MMP-2/9、integrin-β1/α5表达受到抑制。目前已经报道多种分子参与EVT细胞迁移和侵袭能力调控。MMPs作为降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)最重要的蛋白酶，参与滋养细胞EMT和侵袭相关的生理和病理过程[24-25]。在肿瘤中的研究发现上调MMP-2的表达可以重塑ECM促进子宫肉瘤的迁移和侵袭[26]。滋养细胞表达的特殊ECM受体或整合素(如上皮型黏附分子整合素α6，β4向内皮型整合素α1，β1)的转化失败可以导致滋养细胞分化受阻，进一步导致胎盘浅着床和胎盘缺血缺氧[27]。缺氧也可诱导整合素α1向α5的转化，使用整合素α5的中和抗体可以逆转缺氧对EVT细胞侵袭的抑制[28]。在先兆子痫患者的胎盘样本中发现MMP-9蛋白水平显著低于正常足月样本[29]。然而这些因子之间的调控网络还有待进一步的完善。
早期EVT的成熟过程涉及EMT发生，其主要表现为上皮性标志因子E-cadherin表达下调，间质性标志因子N-cadherin以及EMT调控因子Slug和Snail上调[8, 30-32]。本研究发现H/R可以通过抑制原代EVT细胞的EMT正调控因子Slug和Snail，上调E-cadherin表达减弱EVT细胞的EMT过程。体外培养的外植体在H/R处理后外延面积减少也可能是由于EMT途径的抑制。表明孕早期H/R通过抑制滋养细胞的EMT过程从而减弱EVT的迁移侵袭。
已有研究表明，滋养细胞的DNA甲基化会调节E-cadherin的表达从而影响滋养细胞的分化和迁移[33]。本研究分析了H/R对原代EVT迁移侵袭的影响及EMT过程与DNA甲基化酶的关系。H/R处理原代EVT和HTR-8/SVneo细胞后DNA甲基转移酶(DNMT1，DNMT3A)的蛋白表达下降。在PARK等[34]研究中使用DNMT抑制剂降低了Snail和Slug的表达从而抑制了A549细胞EMT过程。同样在HTR-8/SVneo细胞中添加5-Aza-dC(一种已知的DNA甲基化转移酶抑制剂)可以将细胞形态从间充质转变为上皮表型[35]。通过在HTR-8/SVneo细胞中过表达DNMTs，发现MMP2/9及间质性EMT相关因子等上调表达，认为H/R处理会抑制滋养细胞的EMT过程，导致迁移和侵袭能力下降，并且该抑制作用可能与DNMTs下降而致使间质性EMT相关因子的表达有关。然而H/R对滋养细胞中DNMTs与EMT相关因子的精确调控机制，尚需后续进一步的实验论证。
综上，本研究发现H/R可能通过下调EVT细胞中DNMTs的表达，导致其调控的CDH1、Snail和Slug等EMT相关因子和侵袭相关因子的表达下降，妨碍EMT发生最终导致滋养细胞侵袭能力下降，这可能和滋养细胞相关的妊娠疾病发生相关。
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