宫腔粘连(intrauterine adhesions, IUA)因子宫内膜损伤导致不孕不育，宫腔镜下宫腔粘连分离术(transcervical resection of adhesion, TCRA)是治疗IUA的首选与标准术式[1]。目前已有多个研究证实TCRA术后进行羊膜移植可以有效预防术后再粘连[2-5]，羊膜含有人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells, hAMSCs)、羊膜上皮细胞等成分，其中hAMSCs具有间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)多向分化和免疫调节的共性，本课题组前期通过动物实验证实hAMSCs宫腔内移植可有效修复IUA大鼠模型受损的子宫内膜，并发现hAMSCs具有上皮化的潜能[6-8]，加之目前已有多个研究分别证实不同来源的MSCs在IUA治疗中发挥重要作用[9-12]，故推测hAMSCs上皮化是TCRA术后羊膜移植治疗IUA的关键。
核因子-κB(NF-κB)是一种广泛存在于真核生物体内的多功能核转录因子，对控制细胞生长、分化、凋亡等通路的基因调节发挥着重要作用[13-14]，已有研究发现NF-κB信号通路能影响骨髓MSCs的成骨分化[15]。另有研究表明IUA患者和IUA动物模型中NF-κB表达升高，说明NF-κB在IUA发病机理中发挥一定作用[16-17]。本课题组前期通过动物实验证实了NF-κB信号通路在大鼠IUA模型的子宫内膜中被激活，而将hAMSCs移植至IUA大鼠宫腔后NF-κB通路被抑制[7]，实验结果显示NF-κB信号通路在hAMSCs促进子宫内膜修复过程中发挥一定作用，但其作用机制尚不明确。根据前期研究结果，本研究推测NF-κB信号通路可能通过调控hAMSCs的生物学功能而在其上皮化过程中发挥作用。为进一步明确NF-κB信号通路在hAMSCs修复受损子宫内膜中的作用机制，本研究拟通过抑制、过表达和沉默NF-κB信号通路中的关键分子，进一步探索NF-κB信号通路在hAMSCs上皮化中的作用，为临床治疗IUA提供新的理论思路。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 羊膜来源羊膜取自2021年12月-2022年6月于重庆医科大学附属大学城医院产科足月剖宫产产妇的胎盘组织，产妇年龄在25~35岁之间，无其他基础疾病，本实验获得重庆医科大学附属大学城医院伦理委员会批准(LL-202153)。
1.1.2 实验试剂一抗(兔抗)IκBα、p-p65(美国Affinity公司)，一抗(兔抗)p65、Vimentin、E-cadherin(美国CST公司)，一抗(兔抗)CK-7(英国Abcam公司)，Cy3标记山羊抗兔IgG(H+L)(中国碧云天公司)，生长因子TGF-β1、EGF、PDGF-BB(美国Peprotech公司)，胎牛血清(德国PAN ES公司)，DMEM/F12(美国Gibco公司)，胰蛋白酶(中国碧云天公司)，β-雌二醇(中国索莱宝公司)，Ⅰ型胶原酶(德国BioFroxx公司)，双抗(中国白鲨公司)，BAY11-7082(中国碧云天公司)，4%多聚甲醛(中国白鲨公司)，Triton X-100(中国索莱宝公司)，5%牛血清白蛋白(中国博士公司)，抗荧光淬灭剂(中国美仑公司)，DAPI(中国博士德公司)；反转录PCR试剂盒、TB green(日本TaKaRa公司)，Ad-GFP、Ad-IκBα(中国德诺和公司)，LV-GFP、LV-RELA-RNAi(中国吉凯公司)。
1.2 方法 1.2.1 hAMSCs提取、培养hAMSCs提取、培养方法沿用课题组前期hAMSCs提取、培养方法[2-4]，于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养，每2~3天换液1次，待细胞融合度达90%时传代，取第3代细胞备用。
1.2.2 体外诱导hAMSCs上皮化制备诱导培养基[18]：在含血清浓度为10%的DMEM/F12培养基中添加细胞因子(10 ng/mL TGF-β1 +10 ng/mL EGF+10 ng/mL PDGF-BB)和1 μmol/L β-雌二醇。将第3代hAMSCs消化、离心后用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬，以60%初始细胞密度种到6 cm皿中，将hAMSCs分为对照组和诱导组，对照组使用含血清浓度为10%的DMEM/F12培养，诱导组经6~8 h细胞贴壁后换用诱导培养基，放置于37 ℃、5%CO2培养箱培养，隔天换液1次，培养5 d。
1.2.3 干扰hAMSCs中的NF-κB通路将第3代hAMSCs消化、离心后用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬，将hAMSCs分为6组，即诱导组、抑制剂组、Ad-GFP组、Ad-IκBα组、LV-GFP组和LV-RELA-RNAi组，以60%初始细胞密度种到6 cm皿中，经6~8 h细胞贴壁后换用诱导培养基培养，并按分组加入抑制剂、腺病毒和慢病毒。抑制剂组：加入10 nmol/L BAY11-7082；Ad-GFP组：按MOI值=10加入浓度为109 TU/mL的Ad-GFP腺病毒；Ad-IκBα组：按MOI值=10加入浓度为109TU/mL的Ad-IκBα，过表达NF-κB的抑制蛋白IκBα，抑制NF-κB信号通路的激活，进一步抑制NF-κB信号转导；LV-GFP：按MOI值=40加入浓度为5×108TU/mL的LV-GFP；LV-RELA-RNAi组：按MOI值=15加入浓度为109TU/mL的LV-RELA-RNAi，沉默p65的蛋白表达，抑制NF-κB信号通路的激活，进一步抑制NF-κB信号转导。在加入病毒的同时加入Polybrene(5 μg/mL)以提高感染效率，37 ℃培养12 h后用新鲜培养基替换含有病毒的培养基，培养24 h后于倒置荧光显微镜下观察腺病毒组的荧光转染率，培养60 h后于倒置荧光显微镜下观察慢病毒组的荧光转染率。
1.2.4 免疫荧光检测将第3代hAMSCs以2.5×105个/孔的细胞数种到置有10 mm爬片的24孔板中，按1.2.2和1.2.3中所述分组和方法处理各组细胞，细胞处理5 d后，先用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次，用0.3%Triton X-100、37 ℃孵育10 min破细胞膜，PBS洗3次，5%BSA于37 ℃封闭30 min。分别加入一抗(IκBα、p65、p-p65、CK-7、E-cadherin、Vimentin)，4 ℃孵育过夜，PBS洗3次，加入二抗37 ℃避光孵育1 h，PBS洗3次，加DAPI孵育5 min，PBS洗3次后，加抗荧光淬灭剂，用荧光显微镜进行拍照，观察目的蛋白的表达情况。
1.2.5 实时荧光定量PCR检测将第3代hAMSCs以60%初始细胞密度种到6 cm皿中，按1.2.2和1.2.3中所述分组和方法培养各组细胞，5 d后结束细胞培养。按照RNA提取试剂说明书提取各组细胞总RNA，按照反转录试剂盒说明书进行反转录。每管共包含20 μL的体系，在95 ℃(30 s)下进行扩增，然后在95 ℃(5 s)和60 ℃(30 s)下进行40个循环，最终在65 ℃下延伸。以Ct值确定靶基因的表达量，以GADPH为内参，检测mRNA水平，每个基因设置3个复孔。用2-△△Ct法计算各组基因相对表达量，以相应的对照组值为1，计算其他各组的相对值。引物由擎科公司合成(表 1)，在NCBI基因数据库中比对无误。
| 引物名称 | 产物长度/bp | 引物序列(5′→3′) |
| GAPDH | 240 | 上游：GGAGTCCACTGGCGTCTTCA |
| 下游：GTCATGAGTCCTTCCACGATACC | ||
| IκBα | 186 | 上游：GAAGTGATCCGCCAGGTGAA |
| 下游：CTCACAGGCAAGGTGTAGGG | ||
| p65 | 70 | 上游：AGGCTATCAGTCAGCGCATC |
| 下游：TCCCCACGCTGCTCTTCTAT | ||
| CK-7 | 108 | 上游：TGTGGATGCTGCCTACATGA |
| 下游：AGCTCTGTCAACTCCGTCTC | ||
| CK-19 | 225 | 上游：TGAGCAGGTCCGAGGTTACT |
| 下游：GCCGCTGGTACTCCTGATTC | ||
| E-cadherin | 153 | 上游：TGCCTGAGAACGAGGCTAAC |
| 下游：TGCCATCGTTGTTCACTGGA | ||
| Vimentin | 162 | 上游：AAACTTAGGGGCGCTCTTGT |
| 下游：GAGGGCTCCTAGCGGTTTAG | ||
| cyclin D1 | 223 | 上游：CCTCGGTGTCCTACTTCAAATGT |
| 下游：TTCATCTTAGAGGCCACGAACAT |
1.2.6 统计学分析
实验均独立重复3次，采用SPSS 25.0软件进行分析。计量资料数据以x±s表示。首先进行正态分析及方差齐性检验，两组比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 hAMSCs的形态学观察hAMSCs在体外培养，通过传代纯化hAMSCs，显微镜下观察可见第3代hAMSCs贴壁生长，形态呈长梭形(图 1)。
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| A：hAMSCs在40倍下的细胞形态；B：hAMSCs在100倍下的细胞形态 图 1 第3代hAMSCs细胞形态观察 |
2.2 使用条件培养基诱导hAMSCs后上皮标志物表达上调，间质标志物表达下调
RT-qPCR结果显示：与对照组比较，诱导组中CK-7、CK-19和E-cadherin mRNA表达升高(P < 0.01，图 2A)，Vimentin mRNA表达降低(P < 0.01，图 2B)。免疫荧光检测结果显示：与对照组比较，诱导组中CK-7和E-cadherin蛋白表达升高，Vimentin蛋白表达降低，差异有统计学意义(P < 0.05，图 2C)。RT-qPCR和免疫荧光的结果均表明诱导组诱导hAMSCs上皮化成功。
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a: P < 0.01，b: P < 0.05，与对照组比较 A：RT-qPCR检测CK-7、CK-19、E-Cadherin的相对基因表达；B：RT-qPCR检测Vimentin的相对基因表达；C：免疫荧光检测CK-7、E-Cadherin、Vimentin的蛋白表达 图 2 RT-qPCR、免疫荧光检测对照组、诱导组hAMSCs上皮化情况 |
2.3 诱导hAMSCs上皮化后IκBα、p65、cyclin D1表达下调
RT-qPCR结果显示：与对照组比较，诱导组中IκBα、p65、cyclin D1 mRNA表达降低(P < 0.001，图 3A)。免疫荧光检测结果显示：与对照组比较，诱导组中IκBα、p65、p-p65蛋白表达降低，差异有统计学意义(P < 0.05，图 3B)。RT-qPCR和免疫荧光的结果表明诱导上皮化的hAMSCs中，NF-κB信号通路的表达受到抑制。
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a: P < 0.001，b: P < 0.05，与对照组比较 A：RT-qPCR检测IκBα、p65、cyclin D1的相对基因表达；B：免疫荧光检测IκBα、p65、p-p65的蛋白表达 图 3 RT-qPCR、免疫荧光检测对照组和诱导组NF-κB信号通路表达情况 |
2.4 腺病毒、慢病毒转染hAMSCs
观察荧光显示：hAMSCs腺病毒组在转染后24 h、慢病毒组在转染后60 h的转染率均达80%以上(图 4A、B)。RT-qPCR结果显示：与Ad-GFP组比较，Ad-IκBα组IκBα mRNA表达显著增加(P < 0.001，图 4C)，与LV-GFP组比较，LV-RELA-RNAi组p65 mRNA表达显著降低(P < 0.001，图 4D)。RT-qPCR结果表明Ad-IκBα腺病毒成功过表达IκBα，LV-RELA-RNAi慢病毒成功沉默p65。
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| A：腺病毒Ad-GFP和Ad-IκBα分别转染24 h hAMSCs荧光图；B：慢病毒LV-GFP和LV-RELA-RNAi转染60 h hAMSCs荧光图；C：RT-qPCR检测Ad-IκBα腺病毒转染效果 a: P < 0.001，与诱导组和Ad-GFP组比较；D：RT-qPCR检测LV-RELA-RNAi慢病毒转染效果; a: P < 0.001，与诱导组和LV-GFP组比较 图 4 腺病毒、慢病毒对hAMSCs的转染效率 |
2.5 抑制剂BAY11-7082、Ad-IκBα腺病毒LV-RELA-RNAi慢病毒对hAMSCs中的NF-κB信号通路有抑制作用
RT-qPCR结果显，抑制剂组IκBα、p65 mRNA表达均较诱导组降低(P < 0.001，图 5A)，Ad-IκBα组p65 mRNA表达较诱导组降低(P < 0.001，图 5B)，LV-RELA-RNAi组IκBα mRNA表达较诱导组降低(P < 0.001，图 5C)，表明抑制剂、Ad-IκBα腺病毒和LV-RELA-RNAi慢病毒均对hAMSCs中的NF-κB信号通路有抑制作用；免疫荧光检测结果显示：与Ad-GFP组比较，Ad-IκBα组IκBα蛋白表达增加(P < 0.05)，证实了Ad-IκBα腺病毒成功过表达IκBα；与LV-GFP组比较，LV-RELA-RNAi组p65蛋白表达降低(P < 0.05)，证实了LV-RELA-RNAi慢病毒成功沉默p65；与诱导组比较，抑制剂组中IκBα、p65、p-p65蛋白表达降低(P < 0.05)；与诱导组比较，Ad-IκBα组中p65、p-p65蛋白表达降低(P < 0.05)；与诱导组比较，LV-RELA-RNAi组中IκBα、p-p65的蛋白表达降低(P < 0.05)。见图 5D。
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a: P < 0.05, b: P < 0.001，与诱导组比较；c: P < 0.05，与Ad-GFP组比较；d: P < 0.05, 与LV-GFP组比较 A：RT-qPCR检测抑制剂对通路的干预作用；B：RT-qPCR检测Ad-IκBα对通路的干预作用；C：RT-qPCR检测LV-RELA-RNAi对通路的干预作用；D：免疫荧光检测3种方式对通路的干预作用 1: 诱导组；2: Ad-GFP组；3: Ad-IκBα组；4: LV-GFP组；5: LV-RELA-RNAi组；6: 抑制剂组 图 5 RT-qPCR检测干预手段处理通路的效果 |
2.6 抑制NF-κB信号通路促进hAMSCs上皮化
RT-qPCR结果显示：与诱导组比较，抑制剂组、Ad-IκBα组、LV-RELA-RNAi组hAMSCs中CK-7、CK-19和E-cadherin mRNA表达上调(P < 0.01)，Vimentin mRNA表达下调(P < 0.01，图 6B)。免疫荧光法检测结果显示：与诱导组比较，抑制剂组、Ad-IκBα组、LV-RELA-RNAi组hAMSCs中CK-7和E-cadherin蛋白表达上调(P < 0.05)，Vimentin蛋白表达下调(P < 0.05，图 6C)。RT-qPCR和免疫荧光的结果均表明抑制NF-κB通路能促进hAMSCs上皮化。
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| 1: 诱导组；2: Ad-GFP组；3: Ad-IκBα组；4: LV-GFP组；5: LV-RELA-RNAi组；6: 抑制剂组；a: P < 0.01，b: P < 0.05，与诱导组比较A：RT-qPCR检测CK-7、CK-19、E-cadherin的相对基因表达；B：RT-qPCR检测Vimentin的相对基因表达；C：免疫荧光检测CK-7、E-cadherin、Vimentin的蛋白表达 图 6 RT-qPCR、免疫荧光检测干预通路后hAMSCs上皮化趋势改变情况 |
3 讨论
IUA是由于子宫内膜基底层受损导致宫腔或宫颈纤维化，严重危害女性生殖健康，而重度宫腔粘连TCRA术后再粘连的复发率可达20%~62.5%[19-22]。本研究前期发现IUA患者术后行新鲜羊膜移植可有效预防术后再粘连[2-4]，羊膜来源于胎盘并由滋养细胞分化而成，具有抗炎、抗纤维化、免疫原性低、非致瘤性等生物学特性。其主要成分是hAMSCs、羊膜上皮细胞等。研究表明hAMSCs具有自我更新和多向分化潜能，比骨髓来源的MSCs具有更强的扩增能力[5]，因此hAMSCs被认为是再生医学领域最有前途的干细胞之一[15, 23]。目前已有研究[15, 24-27]将hAMSCs应用于卵巢早衰、多发性硬化症、急性创伤性脊髓损伤、骨关节炎及皮肤创面修复的治疗。本团队前期通过动物实验证实了向IUA大鼠宫腔内移植hAMSCs可有效治疗大鼠IUA[6-8]，揭示了hAMSCs修复子宫内膜可能是通过上皮化实现的，但其作用机制尚未阐明[28]。
NF-κB是一种广泛存在于真核生物体内的多功能核转录因子，在细胞的炎症反应、免疫应答等过程中发挥重要作用，控制细胞生长、分化及凋亡等[13-14]。在未受刺激的细胞中，NF-κB的抑制蛋白IκBα与NF-κB的p65亚基结合并覆盖NF-κB的核定位信号，使NF-κB以p50/p65-IκBα三聚体的形式存在于细胞质中。在受到适当刺激后，IKK三聚体被激活后磷酸化IκBα，触发IκBα的泛素化和蛋白酶体降解，NF-κB二聚体入核并调控NF-κB靶基因的激活[13]。研究发现IUA患者和动物模型中NF-κB信号通路的表达均升高[16-17]，本研究前期证实了大鼠IUA的子宫内膜中NF-κB信号通路表达上调，发现向IUA的大鼠宫腔内移植hAMSCs后NF-κB的表达下降[7]，表明NF-κB信号通路在IUA的形成过程中发挥一定作用。多项研究表明，抑制NF-κB信号通路可以增强MSCs成骨和成软骨分化能力[15, 29]，表明NF-κB信号通路能调控MSCs的分化。由此我们推测NF-κB信号通路能调控hAMSCs的生物学功能，在hAMSCs上皮化促进子宫内膜修复的过程中起重要作用。因此，本研究旨在探讨下调NF-κB信号通路后对hAMSCs上皮化的影响。
3.1 hAMSCs上皮化过程中NF-κB信号通路受到抑制本研究利用诱导培养基(TGF-β1、EGF、PDGF-BB、雌二醇)诱导hAMSCs上皮化，并检测对照组和诱导组中上皮标记物和间充质标记物mRNA和蛋白的表达情况。角蛋白是一类主要在上皮细胞表达的骨架蛋白，在维持上皮细胞的完整性上具有重要作用[30]，有研究表明CK-19存在于子宫内膜组织中[31]，尤其是在腺上皮细胞的细胞膜和细胞质中，且有多个研究[6, 32-33]使用CK-7或CK-19来观察IUA动物模型受损子宫内膜上皮修复的情况。E-cadherin是一种钙粘蛋白(cadherin)，主要存在于上皮细胞中，在维持细胞上皮表型中起重要作用[34]。Vimentin是一种主要在间质细胞中表达的结构蛋白[35]。因此，本研究选择上皮标记物CK-7、CK-19、E-cadherin和间质标志物Vimentin作为观察hAMSCs上皮化的指标。结果显示诱导组中上皮CK-7、CK-19、E-cadherin的mRNA和蛋白表达水平均较对照组上调，而Vimentin的mRNA和蛋白表达水平均较对照组下调，验证了使用诱导培养基可以成功诱导hAMSCs上皮化。
Cyclin D1是NF-κB的靶基因，在细胞周期早期表达，参与DNA的合成，NF-κB可直接或间接激活cyclin D1的转录来促进G/S期进程，且其在细胞周期中与NF-κB联系最密切[36]。被激活的的NF-κB入核直接与cyclin D1启动子中的特定序列结合，上调cyclin D1的表达[37]。通过检测对照组和诱导组中cyclin D1的表达，结果显示诱导组较对照组中cyclin D1 mRNA表达水平下调。且发现NF-κB信号通路的关键因子p65和p-p65的表达下调，因此推测诱导上皮化的过程中通过下调p65的表达进而抑制NF-κB信号通路。值得注意的是IκBα的表达也有所下调，推测可能原因有：①NF-κB激活并入核后，可诱导IκBα重新合成，促进NF-κB的出核，形成一个负反馈调节机制，防止NF-κB信号通路过度激活。但由于在诱导上皮化的过程中NF-κB信号通路受到抑制，该负反馈机制受抑制，IκBα重新合成减少；②由于p65受到抑制，所以p50/p65-IκBα三聚体的形成减少，IκBα从三聚体中解离并发生磷酸化降解，导致IκBα表达下调。
3.2 下调NF-κB信号通路可促进hAMSCs上皮化本实验通过使用抑制剂BAY11-7082抑制NF-κB、腺病毒过表达IκBα和慢病毒沉默p65 3种方式干预NF-κB信号通路，进一步探索NF-κB信号通路在hAMSCs上皮化过程中的作用。研究结果显示，BAY11-7082、Ad-IκBα腺病毒、LV-RELA-RNAi慢病毒均能对NF-κB信号通路起抑制作用。BAY11-7082是一种较为常用的NF-κB抑制剂，能通过抑制IKKβ的降解而阻断IκBα的磷酸化，使IκBα持续与NF-κB结合，防止NF-κB进行核转位[38-39]。研究结果显示，抑制剂组、Ad-IκBα组、LV-RELA-RNAi组上皮标志物较诱导组显著上调，间充质标志物显著下调，表明抑制NF-κB信号通路可进一步促进hAMSCs上皮化。
综上所述，本研究主要通过抑制NF-κB信号通路探索其在hAMSCs上皮化过程中的作用，结果提示抑制NF-κB信号通路可促进hAMSCs上皮化，为提高hAMSCs治疗IUA的疗效提供了新思路。但本研究缺乏体内研究证据，拟进一步通过动物实验探究NF-κB信号通路在IUA模型中内膜修复的具体机制。
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