2. 430000 武汉, 华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院消化科
2. Department of Gastroenterology, Wuhan Children's Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, Hubei Province, 430000, China
结核病(tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的危害人类生命健康的慢性传染病。在全球范围内，大约四分之一的人口已经感染了结核分枝杆菌，每年新增1 000多万结核病患者[1-2]。耐药菌和艾滋病病毒合并感染的发生率不断增加，使结核病防控更加困难。据WHO统计，全球艾滋病毒阴性人群的结核病死亡人数从2019年的120万增加到约130万。死亡率由16/10万上升到17/10万[3]。近年来，COVID-19的大流行使几乎一半结核病患者没有得到及时的诊断和治疗，使结核病的防治更加困难。消除结核病全球负担的关键策略包括及时诊断、有效预防和精确治疗。接种结核病疫苗可以从源头上控制结核病的爆发，是最具成本效益的控制疾病的方法[4]。目前卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)仍然是唯一批准用于临床抗结核病疫苗，但BCG的有效性却饱受争议。因此，开发比卡介苗更有效、更安全的新疫苗被认为是战胜结核病的关键。
迄今为止，有14种结核病疫苗正处于人类临床试验的不同阶段。M72/AS01E是一种较有前景的BCG增强候选疫苗，包含M72重组融合蛋白和AS01佐剂体系，M72重组融合蛋白来源于M. tuberculosis蛋白Mtb32A和Mtb39A，由pepA和PPE18编码。目前M72/AS01E的Ⅱb期临床试验正在非洲等地区大规模展开。由于动物模型不能准确地代表人体内部的生物环境，即使M72疫苗对动物模型具有较好的保护效果，也不能保证对人体具有同样的效果。M72疫苗在投入临床应用之前，其有效性仍需大量的临床试验验证。由于不同地理环境中人群和结核菌存在一定差异，为避免出现类似BCG表现出的差异性保护作用，对不同地区MTB中PPE18和pepA基因的多态性研究是有必要的，因为丰富的多态性可能影响抗原与疫苗的结合能力，最终降低疫苗的效价[5]。本研究通过对重庆及周边地区168例儿童TB临床结核分枝杆菌分离株的PPE18和pepA基因的多态性进行研究分析，并初步预测这些变异对M72疫苗有效性的影响，从而评估M72疫苗对该地区人群的保护作用。
1 材料与方法 1.1 标本来源本研究的结核分枝杆菌来源于重庆医科大学附属儿童医院感染科收集的从2006年12月至2013年12月的住院结核病患儿的体液标本，如痰液、脑脊液、穿刺液等。选择其中已经进行过基因分型的180例结核分离株复苏并保存，除其中复苏失败的菌株12例菌株外，复苏成功的168例菌株为本研究的对象。168株标本分别对应168名TB患儿。2015年3-6月采集标本对应的儿童的基本资料(性别、年龄、居住地、BCG接种情况、结核菌素试验情况、结核病接触史等)。本研究的阳性对照菌株为重庆市结核病疾病控制中心提供的结核标准株H37Rv。本研究获得重庆医科大学附属儿童医院伦理委员会的批准[063/2011]。
1.2 DNA的提取用接种环取一个菌环培养阳性的结核分枝杆菌菌落溶于100 μL的TE缓冲液中，用95 ℃沸水浴灭活15 min，12 000×g离心3 min，取上清液保存至-20 ℃冰箱备用。用紫外分光光度仪测D(260)/ D(280) 比值确定其纯度。
1.3 PCR扩增反应结核菌株中PPE18和pepA基因PCR扩增的引物参照HEBERT等[6]报道的引物序列进行设计，并由上海生工生物工程有限公司合成，pepA基因引物为：5′-TGAGCTGGCGATCTGGACTACG-3′(正义)；5′-CACGCGCACGGGAGACGGAACT-3′(反义)。扩增片段长度为1 265 bp。PPE18基因引物为：5′-AAGTGGGCGCTGATTGGGAAGA-3′(正义)；5′-TGTTGAACCTGGACCTAATACCTG-3′(反义)。扩增片段长度为1 881 bp。2个基因扩增体系25 μL，包含上下游引物各0.5 μL，2×Taq MasterMix 12.5 μL，ddH2O 9 μL，DNA模板2.5 μL。用于pepA基因PCR扩增条件为：98 ℃预变性10 s；94 ℃变性1 min，61 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.2 min，共35个循环；72 ℃终末延伸10 min。用于PPE18基因PCR扩增条件：98 ℃预变性10 s；94 ℃变性1 min，63 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃终末延伸15 min。取5 μL PCR产物于2%的琼脂糖凝胶样孔中，以140 V/cm的电压，1.5%琼脂糖凝胶电泳35 min，用紫外凝胶投射仪观察并用成像仪照相，照片经Metamorphose Imaging Sight软件进行分析，检测每个PCR产物的存在性和大小。整个扩增反应中以标准菌株H37Rv作为对照，ddH2O作为阴性对照。所有样本的PCR反应均至少进行2次重复试验以确认试验的准确性。
1.4 PCR扩增产物测序确定PCR扩增条带与预期扩增产物大小一致后，取20 μL扩增成功的样本的PCR产物送往上海嘉根生物科技有限公司进行双向测序(ABI 3730测序仪)。确认测序峰图质量后，运用ContigExpress软件将正反向结果进行拼接获得完整的PCR产物序列。然后登录美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，将拼接结果与标准菌株H37Rv序列中pepA及PPE18基因序列中碱基序列进行比对。并对各试验菌株中PPE18和pepA基因进行序列多态性分析。
1.5 PPE18及pepA基因中T细胞抗原表位区域的确定检索免疫表位数据库(immune epitope database，IEDB)[7]，获得结核分枝杆菌中存在的人T细胞表位序列，与结核标准株H37Rv中PPE18和 pepA基因序列进行比对，最终获取在PPE18基因和pepA基因中分别存在的人T细胞抗原表位信息(数量、位置、多肽序列等)。对本次研究中发现的氨基酸改变在相应抗原序列中定位，确认突变是否发生在抗原表位区域。
2 结果 2.1 研究对象基本情况研究对象大部分来自重庆及周边地区(表 1)。年龄(7.8±5.7)岁，其中男孩87名，女孩81名。55.95%(94/168)的患儿有卡介苗接种史，44.05% (74/168)的患儿无卡介苗接种史。33.93% (57/168)的患儿有结核病接触史，101个患儿否认既往有结核病接触史，剩余10人结核病接触史不详。其中100人做过PPD试验，其中49人PPD阳性，而51人显示PPD阴性。94.64% (159/168)患儿为初诊病例，仅有5.36% (9/168)为复诊病例。
| 入院时间/年 | 重庆 | 四川 | 贵州 | 云南 | 河南 | 陕西 | 合计 |
| 2006 | 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 |
| 2007 | 6 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 8 |
| 2008 | 1 | 3 | 1 | 0 | 0 | 0 | 5 |
| 2009 | 15 | 15 | 0 | 0 | 0 | 1 | 31 |
| 2010 | 22 | 12 | 3 | 1 | 0 | 0 | 38 |
| 2011 | 11 | 9 | 4 | 0 | 1 | 0 | 25 |
| 2012 | 10 | 11 | 2 | 0 | 0 | 0 | 23 |
| 2013 | 16 | 12 | 7 | 0 | 0 | 0 | 35 |
| 合计 | 83 | 65 | 17 | 1 | 1 | 1 | 168 |
2.2 PCR扩增结果
PPE18基因扩增成功的菌株在电泳图 1 881 bp处有1条亮带，代表PPE18基因(图 1A)。pepA基因扩增成功的菌株在电泳图中1 265 bp处有1条亮带，代表pepA基因(图 1B)。
|
| A：PPE18基因表达1~4：阳性表达菌株；5：阳性对照；6：阴性对照；B：pepA基因表达1~3：阳性表达菌株；4：阴性对照；5：阳性对照 图 1 结核杆菌PPE18与pepA基因的扩增表达 |
2.3 PPE18和pepA基因多态性分析 2.3.1 PPE18基因多态性分析
经过对PPE18基因PCR产物测序数据的处理和分析，发现在该基因中存在的大量序列突变位点。在168株试验菌株中，仅51株菌株与标准株H37Rv的PPE18基因序列完全一致，其余117 (69.6%)株菌株均存在PPE18基因突变。117株突变株总共表现出118种不同的基因位点突变，突变形式多样，包括点突变、插入突变、缺失突变、移码突变。其中有113种点突变(41种同义突变和72种错义突变)，最常见的错义突变是c.860G>A和p.Arg287Gln，该突变出现在89株试验菌种中检测到，在突变株中占比达76.07%。插入突变包含2种，分别为c.486_487insGCGACG和c. 882_883insCAGCT GGGTTCG。1种缺失突变为c. 820-822delGCC。2个框内移码突变，其中1个是在724 bp位置插入1个A，同时在726 bp位置缺失1个G，导致1个氨基酸的改变，未引起其他氨基酸改变；另外1个移码突变为659 bp~660 bp位置插入G，同时在669 bp处缺失1个碱基G，这种移位造成序列中3个连续的氨基酸改变。这些突变以多种组合方式存在于各个试验菌种中，上述基因突变在168株菌株中的发生频率为0.60%~57.74%。
除未引起氨基酸改变的同义点突变外，其余基因突变造成PPE18蛋白中67个氨基酸发生改变。2种插入突变分别造成PPE18氨基酸序列中2个和4个氨基酸的插入，1种缺失突变则造成氨基酸序列中第274个氨基酸的缺失。2种移码突变均为1个碱基插入联合1个碱基缺失的形式出现，最终造成3个和9个碱基的移码，分别引起突变菌株中PPE18蛋白氨基酸序列中1个和3个氨基酸的改变，对突变位点后的氨基酸并未造成影响。168株菌株中，共有110(65.4%)株结核菌株表现出PPE18蛋白水平的改变，表现出15种不同的PPE18蛋白氨基酸序列(表 2)，其中序列3在菌株中出现的频率最高(45.8%)。大多数突变株以单一的突变形式出现(错义点突变或插入突变)，仅7株突变株以错义点突变联合插入/缺失的组合形式出现。
| 氨基酸序列a | 点突变/个 | 插入突变 | 缺失突变 | 移码突变 | 菌株数 | |
| 错义 | 同义 | |||||
| H37Rv | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 58(34.5) |
| 1 | 0 | 0 | 1(2b，162c) | 0 | 0 | 2(1.2) |
| 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1(0.6) |
| 3 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 77(45.8) |
| 4 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1(0.6) |
| 5 | 1 | 2 | 0 | 0 | 0 | 1(0.6) |
| 6 | 1 | 2 | 0 | 0 | 0 | 1(0.6) |
| 7 | 1 | 0 | 1(2，162) | 0 | 0 | 1(0.6) |
| 8 | 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 1(0.6) |
| 9 | 2 | 2 | 0 | 0 | 0 | 1(0.6) |
| 10 | 2 | 3 | 0 | 0 | 0 | 17(10.1) |
| 11 | 3 | 2 | 1(4，294) | 1(1，274) | 0 | 1(0.6) |
| 12 | 6 | 5 | 1(4，294) | 1(1，274) | 0 | 1(0.6) |
| 13 | 12 | 8 | 0 | 0 | 0 | 1(0.6) |
| 14 | 22 | 14 | 1(2，162) | 1(1，274) | 1(3，221~223) | 3(1.8) |
| 15 | 54 | 24 | 1(4，294) | 1(1，274) | 1(1，242) | 1(0.6) |
| a：检测到所有菌株中PPE18氨基酸序列种类；b：引起序列中氨基酸改变数量；c：变异氨基酸在序列中的位置，PPE18基因编码蛋白全长391个氨基酸 | ||||||
2.3.2 pepA基因多态性分析
经过与标准株H37Rv中pepA基因序列比较，168株临床结核分离株中，总共有6例(9.84%)结核菌株发生了pepA基因多态性。pepA突变的形式单一，均为点突变，包括4种同义点突变和1种错义点突变。4种同义点突变单独分布在4例不同的菌株中，未引起蛋白水平的改变。唯一的错义点突变分布在2例(1.9%)结核菌株中，表现为703位的G变成T，最终引起一个氨基酸的改变。
2.4 PPE18基因和pepA基因中T细胞表位区变异通过检索IEDB，并与标准株H37Rv的PPE18和pepA基因序列进行比对，获得标准株H37Rv的抗原PPE18和pepA中T细胞抗原表位的基本信息(表 3)。本研究共在H37Rv株PPE18基因中发现了17个T细胞抗原表位，在pepA基因中发现了8个T细胞抗原表位。
| 基因 | 表位ID | 表位肽序列 | 位置b | 突变菌株数 |
| PPE18 | 497375 | ALPPEINSARMYAGP | 6~20 | 0 |
| 499426 | GSASLVAAAQMWDSV | 21~35 | 20(11.90) | |
| 503240 | VAAAQMWDSVASDLF | 26~40 | 20(11.90) | |
| 501207 | MWDSVASDLFSAASA | 31~45 | 0 | |
| 497650 | ASDLFSAASAFQSVV | 36~50 | 0 | |
| 498971 | FQSVVWGLTVGSWIG | 46~60 | 0 | |
| 503745 | WGLTVGSWIGSSAGL | 51~65 | 0 | |
| 499467 | GSWIGSSAGLMVAAA | 56~70 | 0 | |
| 236357 | TVPPPVIAENRAELMILIAT | 105~124 | 4(2.38) | |
| 103503 | PVIAENRAELMILIA | 109~123 | 4(2.38) | |
| 103365 | LMILIATNLLGQNTP | 118~132 | 4(2.38) | |
| 93255 | LLGQNTPAI | 126~134 | 0 | |
| 103452 | NTPAIAVNEAEYGEM | 130~144 | 2(1.19) | |
| 232314 | SSKLGGLWK | 221~229 | 4(2.38) | |
| 179457 | RSPISNMVSMANNHM | 235~249 | 6(3.57) | |
| 230632 | APAAAAQAV | 270~278 | 6(3.57) | |
| 103007 | AAQAVQTAAQNGVRA | 274~288 | 104(61.90) | |
| pepA | 72756 | WLLSVLAAV | 13~21 | 0 |
| 37835 | LLSVLAAVGL | 14~23 | 0 | |
| 103113 | DRFADFPALPLDPSA | 40~54 | 0 | |
| 20475 | GIVIDPNGVV | 81~90 | 0 | |
| 144900 | GQVVGMNTAASDNF | 217~230 | 0 | |
| 497725 | AVDGAPINSATAMAD | 306~320 | 0 | |
| 18719 | GAPINSATAM | 309~318 | 0 | |
| 103680 | TWQTKSGGTRTGNVT | 334~348 | 0 | |
| a：以标准菌株H37Rv菌株中PPE18和pepA的序列为参考；阴影：示氨基酸变化的位置; b: 为表位所在起始氨基酸到终止氨基酸位置 | ||||
在抗原PPE18编码基因中，17个T细胞抗原表位区共发生了28个氨基酸的改变，且导致10个抗原表位的多肽序列发生了改变，而非抗原表位区共包含39个氨基酸的改变。其中IEDB-ID103007的表位肽序列的改变在试验菌株中突变频率最高，出现在104(61.90%)株结核菌中。pepA基因的8个T细胞抗原表位区域未发现多肽序列氨基酸的改变，仅在非抗原表位区域出现1个氨基酸的改变。
3 讨论 3.1 M72疫苗的前景M72疫苗是目前发展最快的蛋白亚单位疫苗，分别由pepA和PPE18基因编码的两种蛋白构建的的多聚蛋白。其中Mtb32A一种假定的丝氨酸蛋白酶，是一种分泌蛋白，Mtb39A功能尚不确定，普遍认为和细胞膜相关联，这两种蛋白均能有效刺激人外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)分泌保护性的细胞因子Th1(包括IFN-γ、TNF-α和IL-12)[8-10]，在临床前研究动物试验中，相较于卡介苗，M72疫苗可在小鼠、豚鼠和非人类灵长类动物中均具有更强的保护作用[11-12]。在已完成的临床Ⅱ期试验中，M72/AS01E在健康人群、HIV阳性人群、结核病感染人群、PPD阴性及PPD阳性的青少年中均可诱导强烈的体液免疫及细胞免疫反应，其临床安全性也同样得到了验证[13-19]。在最近的临床Ⅱb期研究中发现，在结核潜伏感染患者中，M72/AS01E疫苗可诱导有效的免疫反应，且至少提供3年的保护作用[20]。因此M72疫苗被认为是一种有潜力的候选疫苗。
一种候选疫苗在一个地区进入临床试验前，应该考虑临床分离株之间的遗传多样性，需要通过建立在病原体群体的比较基因组学和宿主群体的免疫组学基础上的生物信息学方法评估其保护潜力。生物信息学方法可以提供合理选择临床试验地点的信息。对于亚单位疫苗，比较基因组学可以帮助分析在不同地区对应的不同病原体人群中抗原靶点在生物体的感染菌株中是否保守，以确保其在不同地理区域传播的不同病原体种群中具有保护作用。尽管先前的研究表明，与其他细菌相比，结核分枝杆菌具有相对稳定的基因组，但随着基因组的深入研究，发现临床菌株之间存在显著的生物学差异，如HEBERT等[6]在2007年在阿肯色州和土耳其的结核临床分离株中发现了pepA和PPE18基因存在遗传多样性。如果某个地结核分枝杆菌中这2个基因中任何1个基因高度变异，都可能使M72疫苗在该地的保护作用大打折扣。因此，M72疫苗想要成为像卡介苗这样的全球性疫苗，需要考虑不同地区人群及流行的MTB存在的遗传差异性，对于不同地区PPE18及pepA基因多态性分析，可能为在临床评估的前期或早期预测M72的保护效果提供重要的信息。目前国内缺乏对PPE18和pepA蛋白编码基因遗传变异的报道，本研究通过对重庆及周边地区儿童临床结核分枝杆菌中PPE18及pepA基因多态性分析，初步评估M72疫苗对该地区流行的结核分枝杆菌的免疫有效性。
3.2 儿童结核病pepA、PPE18的变异特征我国被公认为结核高负担国家，而儿童结核病约占15%，且相较成人更容易进展甚至危及生命。儿童结核病在某种程度上对某个地区TB的感染现状和疫情预测都能起到重要的作用。本研究选取的168例样本研究显示，儿童结核病多为原发感染，且潜伏期短，初次感染MTB后原发性免疫反应起到决定性的作用，减少了试验的干扰因素。本研究的流行病学资料进一步显示，这些MTB样本对应的患儿就诊时间和分布地区都较分散，在一定程度上保证了试验临床结核杆菌菌种来源的多样性，结果可信度较高。
本研究中结果表明：PPE18抗原基因表现为高度多变，其变异程度和变异频率均较高。在168例临床结核分离株中，PPE18抗原变异菌株到达65.4%(110例)，变异类型多样，包括点突变(有义点突变及无义点突变)、插入突变、缺失突变及移码突变，有7例(4.17%)包含2种以上突变类型，其中3例菌株中同时监测到点突变、插入突变、缺失突变、移码突变，且变异程度最高的菌株中涉及多肽链中60个氨基酸的改变。pepA基因在此次研究中表现出较高的保守性。在168例菌株中仅有2株抗原变异菌株，且均表现为同一种点突变。整个pepA抗原序列中仅发现了1个氨基酸的改变。PPE18对应的已知人类T细胞抗原表位存在高度变异性，研究样本中140例(83.33%)结核菌株存在对应人类T细胞抗原表位，且涉及大部分已知T细胞抗原表位的变异。相较而言pepA基因对应的T细胞抗原表位暂未发现变异。
虽然不同地区结核菌株流行株存在较大的差异，但几项研究均已报道PPE18氨基酸序列在全球起源的临床菌株之间存在高度的序列变异性[6, 21-22]。本研究再一次证实了PPE18基因具有丰富的多态性，与既往研究比较，本研究中PPE18存在变异率更高、更多样化，且很多变异位于抗原表位区域。PPE18为PPE家族成员，PE-PPE蛋白[Pro-Glu(PE)和Pro-Pro-Glu(PPE)]是一类富含甘氨酸的蛋白家族，占MTB基因组编码能力的10%，参与结核菌的多种病理过程。此类蛋白的序列和结构上的特异性被认为具有重要的免疫学价值，通常被开发成特异性诊断试剂或蛋白疫苗。但是PE-PPE蛋白超家族的c端高度多变，这有助于抗原变异，并帮助病原体逃离宿主的抗菌防御机制[21]。M72疫苗作为一种潜在的重组蛋白疫苗，虽然pepA基因具有较高的保守性，但是PPE18具有丰富的多态性，如果临床上遇到的与疫苗株不同的PPE18抗原可能不会被疫苗株PPE18产生的免疫记忆所识别，因此，PPE18基因的广泛多态性可能导致M72疫苗诱导机体产生的免疫力可能并不能达到满意的效果。
本研究168株临床分离的结核分枝杆菌中抗原PPE18存在广泛的多态性，且大部分菌株变异位于已知抗原表位的蛋白质区域，这可能导致M72疫苗产生的保护作用对重庆及周边地区人民减弱甚至无效。虽然pepA基因在本研究中表现出高度保守性，仅表明pepA基因可能在不同地理来源的结核分枝杆菌菌株和不同病原遗传群之间具有稳定性。然而，如果宿主的多样性阻碍了它们有效结合免疫细胞的能力，即使是相对保守的蛋白质也可能无法诱导保护性免疫。因此，为了避免开发出像目前卡介苗那样效果不稳定的疫苗，在研究M72对不同病原体人群临床前评估的潜在保护效果时，有必要同时考虑病原体和宿主的遗传多样性。因此，需要进一步的研究来确定宿主免疫系统识别pepA及PPE18抗原免疫原性部分的表位区域，并评估临床菌株中观察到的基因多样性对M72保护人类免受结核分枝杆菌感染的潜在影响。
| [1] |
HOUBEN R M G J, DODD P J. The global burden of latent tuberculosis infection: a re-estimation using mathematical modelling[J]. PLoS Med, 2016, 13(10): e1002152. |
| [2] |
FURIN J, COX H, PAI M. Tuberculosis[J]. Lancet, 2019, 393(10181): 1642-1656. |
| [3] |
WORLD HEALTH ORGANIZATION. Global tuberculosis report 2021[R]. Geneva: World Health Organization, 2021: 1-43.
|
| [4] |
CHAKAYA J, PETERSEN E, NANTANDA R, et al. The WHO Global Tuberculosis 2021 Report—not so good news and turning the tide back to end TB[J]. Int J Infect Dis, 2022, 124: S26-S29. |
| [5] |
LI J L, ZHAO A H, TANG J, et al. Tuberculosis vaccine development: from classic to clinical candidates[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2020, 39(8): 1405-1425. |
| [6] |
HEBERT A M, TALARICO S, YANG D, et al. DNA polymorphisms in the pepA and PPE18 genes among clinical strains of mycobacterium tuberculosis: implications for vaccine efficacy[J]. Infect Immun, 2007, 75(12): 5798-5805. |
| [7] |
FATIMA S, KUMARI A, DAS G, et al. Tuberculosis vaccine: a journey from BCG to present[J]. Life Sci, 2020, 252: 117594. |
| [8] |
SKEIKY Y A, LODES M J, GUDERIAN J A, et al. Cloning, expression, and immunological evaluation of two putative secreted serine protease antigens of Mycobacterium tuberculosis[J]. Infect Immun, 1999, 67(8): 3998-4007. |
| [9] |
DILLON D C, ALDERSON M R, DAY C H, et al. Molecular characterization and human T-cell responses to a member of a novel Mycobacterium tuberculosis mtb39 gene family[J]. Infect Immun, 1999, 67(6): 2941-2950. |
| [10] |
AL-ATTIYAH R, MUSTAFA A S, ABAL A T, et al. In vitro cellular immune responses to complex and newly defined recombinant antigens of Mycobacterium tuberculosis[J]. Clin Exp Immunol, 2004, 138(1): 139-144. |
| [11] |
NABAVINIA M S, RAMEZANI M, GHOLOOBI A, et al. Construction of an expression vector containing Mtb72F of Mycobacterium tuberculosis[J]. Cell J, 2012, 14(1): 61-66. |
| [12] |
SKEIKY Y A W, ALDERSON M R, OVENDALE P J, et al. Differential immune responses and protective efficacy induced by components of a tuberculosis polyprotein vaccine, Mtb72F, delivered as naked DNA or recombinant protein[J]. J Immunol, 2004, 172(12): 7618-7628. |
| [13] |
DAY C L, TAMERIS M, MANSOOR N, et al. Induction and regulation of T-cell immunity by the novel tuberculosis vaccine M72/AS01 in South African adults[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2013, 188(4): 492-502. |
| [14] |
GILLARD P, YANG P C, DANILOVITS M, et al. Safety and immunogenicity of the M72/AS01E candidate tuberculosis vaccine in adults with tuberculosis: a phase Ⅱ randomised study[J]. Tuberculosis (Edinb), 2016, 100: 118-127. |
| [15] |
OLUBUKOLA T, IDOKO. Safety and immunogenicity of the M72/AS01 candidate tuberculosis vaccine when given as a booster to BCG in Gambian infants: an open-label randomized controlled trial[J]. Tuberculosis, 2014, 94(6): 564-578. |
| [16] |
KUMARASAMY N, POONGULALI S, BOLLAERTS A, et al. A randomized, controlled safety, and immunogenicity trial of the M72/AS01 candidate tuberculosis vaccine in HIV-positive Indian adults[J]. Medicine, 2016, 95(3): e2459. |
| [17] |
ISABEL, LEROUX-ROELS. Improved CD4+ T cell responses to mycobacterium tuberculosis in PPD-negative adults by M72/AS01 as compared to the M72/AS02 and Mtb72F/AS02 tuberculosis candidate vaccine formulations: a randomized trial[J]. Vaccine, 2013, 31(17): 2196-2206. |
| [18] |
MONTOYA J, SOLON J A, CUNANAN S R C, et al. A randomized, controlled dose-finding phase Ⅱ study of the M72/AS01 candidate tuberculosis vaccine in healthy PPD-positive adults[J]. J Clin Immunol, 2013, 33(8): 1360-1375. |
| [19] |
THACHER E G, CAVASSINI M, AUDRAN R, et al. Safety and immunogenicity of the M72/AS01 candidate tuberculosis vaccine in HIV-infected adults on combination antiretroviral therapy[J]. AIDS, 2014, 28(12): 1769-1781. |
| [20] |
VAN DER MEEREN O, HATHERILL M, NDUBA V, et al. Phase 2b controlled trial of M72/AS01Evaccine to prevent tuberculosis[J]. N Engl J Med, 2018, 379(17): 1621-1634. |
| [21] |
HOMOLKA S, UBBEN T, NIEMANN S. High sequence variability of the ppE18 gene of clinical Mycobacterium tuberculosis complex strains potentially impacts effectivity of vaccine candidate M72/AS01E[J]. PLoS One, 2016, 11(3): e0152200. |
| [22] |
VARGAS R, FRESCHI L, MARIN M, et al. In-host population dynamics of M. tuberculosis during treatment failure[J]. bioRxiv, 2020, 726430. |