2. 030001 太原，山西医科大学生物化学与分子生物学教研室;
3. 100020 北京，首都儿科研究所生化免疫研究室
2. Department of Biochemistry and Molecular Biology, Shanxi Medical University, Taiyuan, Shanxi Province, 030001;
3. Biochemical Immunology Laboratory, Capital Institute of Pediatrics, Beijing, 100020, China
神经管畸形(neural tube defects，NTDs)是由神经管闭合障碍造成的一种以无脑儿、脑膨出、颅脊柱裂及脊柱裂等为主要临床表现的先天性出生缺陷疾病[1-2]。在发育过程中，神经管闭合依次经过神经板形成、神经板塑性、神经板卷褶和神经板融合4个阶段，是一个由遗传和环境因素共同作用的复杂发育生物学过程。世界范围内NTDs的发生率为0.05%~0.2%，而我国NTDs的发生率高达0.2%~0.4%，其中山西地区NTDs发病率高达1.39%[1]。流行病学研究表明，遗传因素占NTDs致病因素70% 以上，在小鼠中已鉴定出240多个基因的遗传变异与NTDs的发生高度相关[2]。随着人类基因组学的发展，罕见变异在NTDs的发生机制中越来越被重视，例如VANGL1、VANGL2、PRICKLE1和FUZZY等基因变异均可导致NTDs的发生[3-6]。因此，通过高通量测序技术是挖掘NTDs致病相关变异的重要手段。
轴向抑制蛋白AXIN是重要支架蛋白，通过促进β-catenin代谢从而抑制Wnt/β-catenin信号通路及下游靶基因的表达。脊椎动物中存在2种AXIN蛋白(AXIN1和AXIN2)，它们存在功能冗余，在蛋白质整体水平上有44% 的一致性，配体和其他蛋白质的结构域具有更高的相似性。AXIN1参与调控胚胎体轴发育，AXIN1基因失活可出现胚胎前后轴发育异常；将AXIN1 mRNA注射到非洲爪蟾胚胎中会抑制背部体轴形成；AXINFu/Fu小鼠会有胚胎死亡、神经管分叉和不同程度尾巴卷曲等表现[7]。胚胎发生期间AXIN2与Wnt-1、Wnt-3和Wnt-3a在原始条纹和背侧神经管中表达区域重叠，提示AXIN2在神经管的发育过程中发挥重要作用。
动物实验证明Wnt/β-catenin信号通路在神经发育期间激活或抑制都会导致NTDs的发生[8-10]，由此假设：在人类中AXIN2基因变异引起了Wnt信号通路活性的异常并与神经管发育相关。为了验证这一假设，本研究采用病例-对照研究设计对AXIN2的编码区进行筛查，并对发现的AXIN2变异进行功能探讨，为进一步了解神经管畸形的致病机制提供新思路。
1 资料与方法 1.1 研究对象延续本课题组前期的研究[11]，于2004年6月-2013年12月在山西省中阳县人民医院、中阳县妇幼保健医院、交口县人民医院、交口县妇幼保健医院、柳林县人民医院、柳林县红十字医院、临县人民医院、临县中医院、临县妇幼保健院等9个中心收集具有NTDs表型的汉族流产胎儿样本100例。使用千人基因组计划中208名中国汉族人群作为对照。本研究所有样本采集均经首都儿科研究所伦理委员会(SHERLLM2019017) 批准。
1.2 AXIN2基因测序及生物信息学分析对100例NTDs样本提取肌肉组织并进行全基因组测序[11]。提取全基因组DNA后，通过超声将其破碎为150 bp左右的片段，构建测序文库后在Illumina10×平台(美国Illumina公司)进行测序，测序的平均覆盖深度为30.2×，测序数据fastq与hg38参考系列进行对比。使用Genome Analysis Toolkit分析单核苷酸变异和插入/缺失，使用SpeedSeq软件分析结构变异和拷贝数变异，使用ANNOVAR对单核苷酸变异、结构变异及拷贝数变体进行注释。从全基因组测序的结果中调取AXIN2基因的所有遗传变异。采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增NTDs样品中含有AXIN2变异的区域，并进行Sanger测序以确认全基因组检测中AXIN2基因分型结果。参考外显子组聚合联盟数据库(exome aggregation consortium, ExAC)、千人基因组数据库和NCBI数据库，确认AXIN2罕见变异。采用PolyPhen2和SIFT等软件预测变异对AXIN2蛋白功能的影响；Vector NTI Suite在线软件对变异的氨基酸位点进行保守性估计；SnapGene软件对Sanger测序结果进行比对。
1.3 AXIN2相关质粒构建与实验细胞培养pCS2-N-myc-AXIN2质粒由北京盛元科萌公司合成，利用KOD-plus高保真酶对野生型AXIN2表达载体进行定点突变PCR，从而得到突变型AXIN2表达载体，引物序列见表 1。所有质粒经过Sanger测序验证。HEK293T细胞购于北京市协和细胞库，培养在含10% 胎牛血清的DMEM中。NE-4C细胞来源于实验室库存，采用高糖DMEM培养基，使用前使用浓度为10 mg/mL的多聚赖氨酸包被培养皿2 h。各类细胞系均在37 ℃恒温，5% CO2恒定浓度培养箱内培养，每日换液，每隔2~3天根据细胞生长情况传代。
| 引物名称 | 上游 | 下游 |
| check1 | ATGCTTCTGCATCCAAGGAA | CTCACCATCACAACCCAAAA |
| check2 | CTCTGGCCCTTCTGCTTCCT | GGAGTGGCTTTTGCATTTCG |
| D320V | GAGTATGACAGACAGCAGCGTGGTC GGCATCCCCCCCTACAGAGTGGGCT CCAAGAAGCAGC |
GCTGCTTCTTGGAGCCCACTCTGTAG GGGGGGATGCCGACCACGCTGCTGT CTGTCATACTC |
| A417V | CACTGAACAGCAGAGAAGGAGTGCC CACACAGCACCCCCTGAGC |
GCTCAGGGGGTGCTGTGTGGGCACT CCTTCTCTGCTGTTCAGTG |
| G545E | GAGAGTGCACTGCTTCTGCCCCGAC GGCAGCGAGTACTACTGCTACAG |
CTGTAGCAGTAGTACTCGCTGCCGT CGGGGCAGAAGCAGTGCACTCTC |
1.4 质粒转染及蛋白免疫印迹实验
将HEK293T细胞均匀铺在6孔细胞培养板中，待细胞密度达到60%左右时，用lipo2000(美国Invitrogen公司，LipofectamineTM 2000 Reagent)转染试剂分别将AXIN2野生型及3种突变型表达质粒转染到细胞上。转染48 h后，用新加入PMSF的RIPA缓冲液提取蛋白，使用BCA法测定蛋白浓度。等量样品进行SDS-PAGE电泳并转移至PVDF膜上，将膜在5% 脱脂牛奶常温封闭2 h后，用抗AXIN2(美国Abcam公司)，抗β-catenin(美国Abcam公司)和抗GAPDH(北京全式金生物公司)的抗体4 ℃孵育过夜。二抗(北京中杉金桥)室温下作用2 h，使用ECL检测系统进行检测。用Image J软件进行条带灰度值定量，用AXIN2相对于GAPDH的比值测定野生型(wild type, WT)和突变型AXIN2蛋白表达改变。独立实验进行3次。
1.5 免疫荧光实验将NE-4C细胞爬片置于激光共聚焦培养皿中，待细胞密度为60%~70%时用lipo2000转染试剂将AXIN2野生型及3种突变型表达质粒进行细胞转染。转染48 h后，室温下用预冷的4%多聚甲醛固定细胞10 min，1% TritonX-100的PBS进行细胞透化处理10 min，加入5%山羊血清封闭60 min。再加入抗AXIN2、抗Myc抗体稀释液4 ℃过夜。洗涤后室温避光孵育荧光二抗(美国Jackson公司)1 h。加入DAPI(美国Invitrogen公司)染细胞核，避光15 min吸去DAPI，加入防淬灭封片剂并置于4 ℃避光保存。用荧光共聚焦显微镜进行拍摄。独立实验进行3次。
1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析并生成图表，数据以x±s表示。两组之间用独立样本t检验进行统计学分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 全基因组测序结果及生物信息学分析本研究收集100例NTDs流产胎儿样本，妊娠周期为(20.7±4.7)周。无脑畸形占94%，颅脊柱裂占75%，脑膨出占26%，脊柱裂占2%；男性胎儿占60%，女性胎儿占37%，3%的胎儿性别未知。提取NTDs病例肌肉组织进行全基因组测序。
100例全基因组测序的NTDs流产样本中发现AXIN2基因中存在5种罕见变异(表 2)，根据变异致病性评分，对D320V、A417V和G545E这3种变异进行了功能验证。ACMG致病性评级显示，D320V变异为不确定性临床意义，A417V变异为可能致病性，G545E变异为不确定性临床意义。变异氨基酸位点在AXIN2蛋白序列中的对应位置见图 1A，AXIN2蛋白共843个氨基酸，靠近N端有端锚聚合酶结合模体(tankyrase-binding motif，TBM)，在氨基酸序列第88~200位处有G蛋白信号转导调节分子(regulators of G-protein singaling, RGS)结构域，C端有DIX二聚体基序(DIX结构域)。AXIN2可以和多种蛋白相结合，GSK3β蛋白结合位点位于氨基酸序列第327~413位；β-catenin蛋白结合位点位于氨基酸序列第413~476位。3种错义变异位点中，D320V和G545E是新发现的变异位点，A417V突变在数据库中已有记录(rs201460658)。
| 核苷酸改变 | 氨基酸改变 | 基因组位置 | 外显子 | SIFTa | PolyPhen2b | Freq_Alt(1 000 g)c | 病例频率 |
| c.959A＞T | D320V | chr1765541555 | Exon4 | 0.001 | 1.000 | 未知 | 1/100 |
| c.1250C＞T | A417V | chr1765537786 | Exon6 | 0.131 | 0.237 | 3.594×10-3 | 4/100 |
| c.1634G＞A | G545E | chr1765537402 | Exon6 | 0.168 | 0.986 | 未知 | 1/100 |
| c.1807G＞C | A603P | chr1765536969 | Exon7 | 0.288 | 0.000 | 7.189×10-3 | 6/100 |
| c.1481C＞T | P494L | chr1765537555 | Exon6 | 0.363 | 0.090 | 未知 | 1/100 |
| a：SIFT功能预测评分＜0.05表示该突变影响蛋白功能，＞0.05表示该突变不影响蛋白功能；b：PolyPhen2评分0.957~1.000为有害，0.453~0.956为可能有害，0~0.452为无害；c：Freq-Alt(1 000 g)指非参照等位基因在千人基因组项目中的频率 | |||||||
|
| A：变异氨基酸位点在AXIN2蛋白序列中的对应位置示意图 a：TBM，b：RGS结构域，c：GSK3β蛋白结合位点，d：β-catenin蛋白结合位点，e：DIX结构域 红框：示3种罕见变异所在的氨基酸位点；B：变异氨基酸位点的物种保守性分析 图 1 AXIN2基因及其D320V、A417V和G545E变异的位置示意图及保守性分析 |
运用在线预测工具PolyPhen2和SIFT对3种AXIN2变异位点进行功能预测结果显示：A417V变异不影响蛋白功能，为无害突变；D320V变异影响蛋白功能，为有害突变；G545E变异不影响蛋白功能，为有害突变(表 2)。利用Vector NTI Suite在线软件对3种变异氨基酸位点保守性进行估计，对比结果显示(图 1B)，D320V和G545E变异所在的氨基酸位点在人、黑猩猩、小鼠、大鼠和斑马鱼5个物种间高度保守，A417V变异所在的氨基酸位点在人、黑猩猩、小鼠和大鼠等物种间高度保守，在斑马鱼中不保守。
2.2 病例样本变异位点确认本研究在100例神经管畸形病例中发现13例NTDs患者携带5种AXIN2变异，其中有4例患者携带A417V变异，有1例患者携带D320V变异，有1例患者携带G545E变异，在对照组中均未发现这3种变异。3种变异患者基因型和临床表现见表 3。分别对携带这3种变异的病例来源基因组DNA进行Sanger测序来验证这3种变异是否真实(引物序列见表 1)，D320V变异使用引物check1，A417V和G545E变异使用引物check2。测序结果显示(图 2)，A417V、D320V和G545E这3种变异均以杂合状态检测到。
| 样本编号 | 氨基酸变异位点 | 周龄/周 | 性别 | 临床表现 |
| WGC030532D | D320V | 32 | 女 | 无脑儿，开放性枕颈裂，枕部脑膜脑膨出，副脾，畸形引产 |
| WGC030517D | A417V | 22 | 女 | 无脑儿，枕部脑膜脑膨出 |
| WGC030524D | A417V | 18 | 男 | 无脑儿，枕颈部脊柱裂 |
| WGC033714D | A417V | 20 | 男 | 完全型无脑畸形，颈枕胸脊柱裂，肾上腺发育不全，畸形引产 |
| WGC033716D | A417V | 25 | 女 | 先天性无脑畸形(完全型)，开放性胸腰骶脊柱裂；双侧肾上腺融合; 两肺膨胀不全；颅内出血；内脏淤血；畸形引产 |
| WGC030544D | G545E | 17 | 女 | 无脑儿，枕颈胸脊柱裂，顶部脑膜脑膨出；唇腭裂；双肾上腺发育不良；畸形引产 |
|
| 蓝色背景条：示变异位点 图 2 AXIN2 3种变异与对照的Sanger测序结果 |
2.3 AXIN2基因变异对AXIN2蛋白水平的影响
AXIN2参与Wnt经典信号通路中降解复合体的形成，通过调控β-catenin水平抑制该信号通路。在HEK293T细胞中进行AXIN2野生型及D320V、A417V和G545E变异型质粒的过表达实验，以检测3种AXIN2变异是否会影响AXIN2及β-catenin蛋白的表达水平。为了检测质粒的转染效率，设立pCS2-myc-EGFP转染组作为报告基因，转染后24 h在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的表达情况(图 3A)；同时也在后续的免疫荧光实验中检测转染质粒中标签蛋白Myc的表达。蛋白免疫印迹实验结果显示(图 3B)，与野生型比较，A417V变异不影响AXIN2蛋白表达水平，而D320V(P＜0.05)和G545E(P＜0.001)变异使AXIN2蛋白表达减少；然而3种变异均不影响β-catenin蛋白表达水平(图 3C)，提示AXIN2敲除对β-catenin蛋白的水平没有影响。
|
| A：细胞转染效率检测；B：AXIN2变异对AXIN2蛋白表达水平影响；C：AXIN2变异对β-catenin蛋白表达水平影响；a：P＜0.05，b：P＜0.001，与WT组比较 图 3 AXIN2变异对AXIN2蛋白及β-catenin蛋白表达水平影响 (n=3，x±s) |
用携带D320V、A417V和G545E变异的肌肉组织及对应的对照进行免疫印迹实验以验证AXIN2罕见变异的影响：与对照组比较，携带D320V(P＜0.05)及G545E(P＜0.01)变异的肌肉组织样品AXIN2的表达水平显著降低，而携带A417V变异与对照组比较，AXIN2的表达无显著差异(图 4)。以上结果与体外实验结果相符。
|
| a：P＜0.05，b：P＜0.01，与WT组比较 图 4 NTDs组织样本AXIN2 3种变异对AXIN2蛋白表达水平的影响 (n=3，x±s) |
2.4 AXIN2错义变异不影响AXIN2蛋白的亚细胞定位
在正常组织中，AXIN2主要分布于细胞质和细胞核中，而在息肉和癌组织中会部分转移到细胞质中。为了检测3种变异是否会影响AXIN2的亚细胞定位，在NE-4C细胞中分别转染了带有Myc标签蛋白的质粒AXIN2野生型及D320V、A417V和G545E 3种变异型质粒和空载体质粒，并分别用Myc、AXIN2抗体进行免疫荧光实验。实验结果显示(图 5)，野生型AXIN2主要定位于细胞质和细胞核中，而3种变异均不影响AXIN2蛋白的亚细胞定位。
|
| 图 5 转染AXIN2野生型及突变型质粒在NE-4C细胞中亚细胞定位 |
3 讨论 3.1 AXIN2变异与神经管畸形的发生有关
NTDs是一种由神经管闭合障碍引起的先天性出生缺陷疾病，受到基因与环境的相互作用。绝大多数NTDs患者会发生流产、死产和新生儿死亡等情况，极少数非开放性脊柱裂的患者能够幸存。因此，明确NTDs的发病机制不仅能对NTDs的干预和治疗提供更多的科学依据，同时可促进生殖健康。罕见变异是复杂疾病(包括NTDs)的致病遗传因素，越来越多的研究者对NTDs中的散发病例和罕见变异进行研究，如DNMT1突变可降低DNMT1的表达，这可能扰乱了DNMT1的靶基因的DNA甲基化平衡以及相应基因表达，从而与神经管畸形高度相关；人类NTDs的发生与PCP信号通路相关基因变异密切相关，而WNT5B基因参与PCP信号通路，它的变异可能通过影响PCP通路的正常传导而与神经管畸形的发生密切相关[12-15]。提示在NTDs发生的病理生理过程中，罕见变异扮演着重要角色。
既往研究表明，AXIN2与多种疾病相关，如乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌和少牙畸形等[16-18]。AXIN2可以与β-catenin、泛素-蛋白质连接酶及SAMD等蛋白结合，并参与构成β-catenin降解复合体，同时也参与RNA稳定性、错配修复等过程[19-21]。本研究通过对具有NTDs表型的流产胎儿肌肉组织进行全基因组测序，鉴定出AXIN2基因上的A417V、D320V和G545E 3种罕见变异。运用PdyPhen 2和SIFT在线预测软件分析表明：A417V变异不影响蛋白功能，为无害突变；D320V变异影响蛋白功能，为有害突变；G545E变异不影响蛋白功能，为有害突变。A417V、D320V和G545E罕见变异所在的氨基酸位点在人、黑猩猩、小鼠、大鼠物种间高度保守。为了探究A417V、D320V和G545E这3种罕见变异的功能，构建野生型和突变型AXIN2表达载体，转染HEK293T细胞后，蛋白免疫印迹实验表明，D320V和G545E变异能够下调AXIN2蛋白表达水平，A417V变异对AXIN2蛋白表达水平无影响。并发现在携带D320V和G545E变异的NTDs样本中，AXIN2蛋白表达水平下降。但本研究没有同时检测AXIN1的蛋白水平，这需要在后续的研究中进一步探讨。
3.2 AXIN2变异可能致Wnt/β-catenin信号通路异常激活Wnt/β-catenin信号通路是生物进化中一条高度保守的发育信号通路。该信号通路参与调控神经管增殖、细胞分化及凋亡等过程，是影响神经胚层发育和神经管闭合的关键信号通路之一，在调控神经板和神经管头尾模式的过程中至关重要。既往研究表明，LRP6Cd变异致使Wnt信号通路异常激活，导致小鼠出现尾椎缺陷和颅骨的NTDs表型[12]。同时，DVL2基因变异破坏DVL2蛋白的稳定性，并激活Wnt信号通路活性导致人类神经疾病的发生，如NTDs和第四脑室孔闭塞综合征(dandy-walker malformation，DWM)[22]。研究表明AXIN参与构成Wnt/β-catenin信号通路中的降解复合体[23-24]，是该信号通路的关键负调控因子，AXIN通过促进β-catenin降解抑制Wnt经典信号通路和下游靶基因的表达[25]。有研究报道，AXIN1和AXIN2可能存在功能冗余，将小鼠AXIN1编码区替换为AXIN2的编码序列，没有明显的表型异常，反之亦然[26]。而AXIN1和AXIN2的生物学功能又有其特异性；AXIN2基因敲除的小鼠出现头骨畸形、头盖骨的缝合过早愈合[27]，而AXIN1基因突变导致显性胚胎的尾部卷曲、缩短和隐性胚胎致死[28]。我们前期在叶酸缺乏NTDs人群中发现Wnt/β-catenin信号通路被激活，AXIN2异常表达[29]。为了论证A417V、D320V和G545E罕见变异是否影响β-catenin的表达水平，本研究在HEK293T细胞中进行AXIN2野生型及D320V、A417V和G545E变异型质粒的过表达实验，发现3种变异均不影响β-catenin的蛋白表达水平，与既往研究结果一致[30]。
散发病例中罕见的变异对神经管畸形的研究意义重大，将揭示神经管畸形发病的新致病风险因素，并提供重要的科学依据促进神经管畸形的产前诊断和防治。目前为止，本研究对D320V、A417V和G545E罕见变异的功能研究还不够深入，在后续的研究中，将进一步通过斑马鱼、小鼠等模式动物，对AXIN2点突变的致病机理进行深入探究。
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