2. 400037 重庆，陆军军医大学(第三军医大学)第二附属医院全军肿瘤诊治研究所
2. Institute of Cancer, Second Affiliated Hospital, Army Meical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400037, China
以PD-1抗体或PD-L1抗体为代表的免疫检查点抑制剂疗法(immune checkpoint blockade，ICB)在晚期肿瘤的治疗中已经革新了临床肿瘤治疗实践[1-3]。而在早期可切除肿瘤中，近来的多项临床试验结果证实新辅助PD-1抗体/PD-L1抗体治疗在包括黑色素瘤、肺癌和结肠癌等多种肿瘤的治疗上具备很好的临床应用前景[4-7]。基于头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)的一项研究表明，记忆CD8+ T细胞群体是新辅助ICB的早期反应者，能够增强肿瘤局部和全身肿瘤免疫[8]，提示记忆T细胞在机体长期抑制肿瘤生长中的重要性。然而，在新辅助PD-1抗体/PD-L1抗体疗法条件下，肿瘤特异性的T细胞的分化和命运如何变化仍然缺乏证据。因此，探寻记忆CD8+ T的形成和维持机制，有望为临床新辅助PD-1抗体/PD-L1抗体疗法提供理论依据。
引流淋巴结(tumor-draining lymph nodes, TDLN)是启动抗肿瘤免疫的起始位点，适应全身性CD8+ T细胞应答。最近的研究表明，TDLN贮存一群Tcf1+ CD8+ T细胞，该细胞被证实是PD-1抗体的主要效应细胞，切除TDLN，PD-1抗体/PD-L1抗体将无效[9-12]。此外，一项研究基于黑色素瘤相关白癜风模型证实，在原来接种的黑色素瘤消退后，引流淋巴结会产生一群组织驻留型的记忆CD8+ T细胞，发挥长期的肿瘤保护作用，提示TDLN在肿瘤完全消退条件下，促进记忆CD8+ T的形成和维持[13]。然而，新辅助PD-1抗体/PD-L1抗体疗法后手术切除残留肿瘤病灶时，常规进行TDLN的清扫，这种方式会对肿瘤患者的长期保护有何影响仍不清楚。因此，本研究将探究新辅助PD-1抗体/PD-L1抗体治疗条件下TDLN对记忆CD8+ T细胞形成和维持的影响，为手术切除的范围和决策的制定提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株及细胞培养小鼠结直肠癌细胞系CT26、黑素色瘤细胞系B16-F10，均从美国ATCC细胞库(American Type Culture Collection)购买获得。小鼠结直肠癌细胞系MC38由上海交通大学邓刘福教授馈赠。B16-OVA细胞由暨南大学郭波教授馈赠。所有细胞用富含10% 胎牛血清(Gibco)和100 U/mL青霉素/链霉素的DMEM(高糖)培养基培养于含有5% CO2的37 ℃细胞培养箱中。所有细胞系定期进行支原体污染检测。
1.1.2 实验动物及主要试剂C57BL/6雌性小鼠和BALB/c雌性小鼠购自重庆腾鑫生物科技有限公司, 6~8周龄，体质量约20 g用于实验。CD45.1 OT-Ⅰ小鼠由暨南大学郭波教授馈赠，并于实验室繁殖、鉴定后使用。抗小鼠PD-L1单克隆抗体(10F.9G2; BioXCell), 抗小鼠CD44抗体(IM7; BioLegend), 抗小鼠CD8a抗体(53-6.7; BioLegend), 抗小鼠CD69抗体(H1-2F3; BioLegend), 抗小鼠CD103抗体(2E7; BioLegend), 抗小鼠CD45.1抗体(A20; BioLegend), 抗小鼠CD62L抗体(MEL-14; BioLegend), 抗小鼠CD16/CD32 (93; BioLegend)。FVD活细胞染料(Thermo Fisher)。
1.2 方法 1.2.1 小鼠肿瘤模型分别在小鼠右侧背侧皮下注射100 μL肿瘤细胞悬液(5×105 MC38-OVA，1×105 B16-OVA或1×105 CT26重悬于100 μL PBS)，建立小鼠皮下移植瘤模型。从荷瘤后第7天开始，每2~3天用游标卡尺测量一次肿瘤大小。计算公式：肿瘤体积(mm3)=0.52×长×宽2。
1.2.2 新辅助PD-1抗体/PD-L1抗体疗法对于早期可切除肿瘤，先进行多个周期的新辅助PD-1抗体/PD-L1抗体治疗后，再进行手术切除肿瘤。在荷瘤第7、10天，腹腔注射200 μg PD-L1单克隆抗体，对照组注射200 μL PBS。于荷瘤后15 d左右，手术切除皮下肿瘤以及腋窝和腹股沟淋巴结(TDLN), 对照组进行假手术。在本实验中动物分组为A组(假手术+PBS组)：先给予PBS治疗，再进行肿瘤切除，但不进行淋巴结切除；B组(淋巴结切除+PBS组)：先给予PBS治疗，再进行肿瘤切除，同时进行淋巴结切除；C组(假手术+αPD-L1组)：先给予PD-L1抗体治疗，再进行肿瘤切除，但不进行淋巴结切除；D组(淋巴结切除+αPD-L1组)：先给予PD-L1抗体治疗，再进行肿瘤切除，同时进行淋巴结切除。每组6~8只小鼠。
1.2.3 肿瘤再挑战为了测试TDLN在新辅助PD-1抗体/PD-L1抗体治疗条件下对保护性T细胞免疫的影响，在接受肿瘤切除术30 d后，于左侧背侧皮下再次接种与手术切除肿瘤相同的肿瘤细胞，细胞量为初始荷瘤量的5~10倍致死量的肿瘤细胞(5×105 CT26，5×106 MC38-OVA重悬于100 μL PBS)[14]。
1.2.4 细胞分选以及过继回输按照CD8+T细胞阳选试剂盒说明书从CD45.1 OT-Ⅰ小鼠的脾脏和全身淋巴结中分选出OT-Ⅰ细胞(特异性识别OVA257-264抗原肽的CD8+T细胞)，流式检测其纯度大于95%。在MC38-OVA模型中，荷瘤后第7天，尾静脉回输2×105 OT-Ⅰ细胞，并在荷瘤后第8、11天，腹腔注射200 μg PD-L1单克隆抗体，对照组注射200 μL PBS，每组各12~16只。荷瘤后第15天左右，手术切除肿瘤，分别于手术当天和手术后30 d麻醉后处死小鼠，取骨髓、腹股沟淋巴结(TDLN)、对侧腹股沟淋巴结(NLN)、肝、肺及脾脏等组织器官进行相关实验，每组各6只。采用流式细胞术检测上述组织中OT-Ⅰ细胞的表达情况以及记忆表型。
1.2.5 流式细胞术检测在不同时间点获得各个组织，脾脏和淋巴结直接用70 μm细胞筛研磨制成单细胞悬液，肺和肝脏机械剪碎后用1 mg/mL的Ⅰ型胶原酶(Sigma)在37 ℃摇床中消化40 min，再用70 μm细胞筛制成单细胞悬液。CD44(clone：IM7), CD8a(clone：53-6.7), CD69(clone：H1_2F3), CD103(clone：2E7), CD45.1(clone：A20), CD62L(clone：MEL-14), anti-FcR (clone：93)，用FACS buffer稀释(1 ∶200)，LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit(1 ∶2 000)染色30 min后，上机检测。
1.3 统计学分析流式数据均用FlowJo V10处理，统计数据分析采用GraphPad Prism 7.0软件进行。两组比较采用双尾学生t检验，两组以上比较采用单因素方差分析。肿瘤生长曲线采用双因素方差分析。采用Turkey法矫正α后进行后续分析，α=0.05。
2 结果 2.1 新辅助PD-L1抗体治疗增强机体的抗肿瘤免疫反应为了探究新辅助PD-L1抗体疗法对抗肿瘤免疫的影响，建立CT26小鼠模型(图 1A)。结果显示，新辅助PD-L1抗体治疗显著抑制小鼠的原发灶肿瘤生长(P < 0.05，图 1B、C)。经治疗后肿瘤引流淋巴结(TDLN)有增大的趋势(图 1D)。TDLN是抗肿瘤免疫反应启动的组织，表明新辅助ICB治疗能够增强T细胞免疫反应。在B16-OVA黑色素瘤模型中得到了类似的结果(图 1E~G)。
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| A：实验方案流程示意图；B：建立CT26皮下移植瘤模型；C、D：在第15天，手术切除肿瘤和TDLN的质量 a: P < 0.05，与PBS组比较；E：B16-OVA皮下移植瘤模型；F、G：接受新辅助PD-L1抗体治疗后第15天，手术切除肿瘤和TDLN的质量 b: P < 0.01，与PBS组比较 图 1 新辅助PD-L1抗体治疗对CT26和B16-OVA肿瘤生长以及TDLN的影响(n=12，x±s) |
2.2 小鼠TDLN的切除对机体的长期抗肿瘤免疫记忆无显著影响
分别对CT26和MC38-OVA进行肿瘤再挑战实验(图 2A)，结果显示，TDLN切除抵消了新辅助免疫治疗对肿瘤生长的抑制效果，但无论是否接受TDLN切除，均出现肿瘤自发消退(图 2B、C)。在MC38-OVA模型中观察到类似现象(图 2D~F)。以上结果证实，TDLN对于新辅助PD-L1抗体治疗所产生的免疫记忆有一定短期促进作用，但对于长期抗肿瘤免疫无显著影响，因此切除TDLN并不损害机体的长期免疫保护能力。
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| A：实验方案流程示意图；B、C：接受CT26再挑战后第7天的肿瘤大小以及长期生存曲线(n=6，x±s) a: P < 0.05；D、E：MC38-OVA肿瘤再挑战结果(n=8，x±s) a: P < 0.05，b: P < 0.01；F：E中各组的单个肿瘤生长曲线 图 2 新辅助PD-L1抗体治疗以及TDLN切除对CT26和MC38-OVA肿瘤再挑战的影响 |
2.3 记忆CD8+T细胞在TDLN和NLN中形成和维持
对MC38-OVA荷瘤小鼠通过尾静脉回输肿瘤特异性CD8+T细胞，在效应和记忆阶段，流式细胞术检测各组织中的OT-Ⅰ细胞(图 3A)。结果显示，新辅助PD-L1抗体治疗显著抑制肿瘤生长(P < 0.01，图 3B)。在效应阶段，TDLN中肿瘤特异性CD8+T细胞显著高于脾脏等其他组织器官(P < 0.01，图 3C、E)。然而在记忆阶段，TDLN在内的所有组织器官中肿瘤特异性CD8+T细胞均呈现减少趋势，但TDLN和NLN仍保留了较多的OT-Ⅰ细胞(P < 0.01，图 3C、D)。中枢记忆T细胞的比例在各个组织中较为恒定(图 3F、G)。TDLN和NLN中的Tcm数量显著高于脾脏等其他组织器官(P < 0.01，图 3H)。而对于组织驻留记忆T细胞，TDLN和NLN在比例和绝对数上均显著高于其他组织器官(P < 0.05，图 3I~K)。
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| A：实验方案流程示意图；B：接受新辅助PD-L1抗体治疗的MC38-OVA肿瘤生长曲线(n=16，x±s)；C、D：CD44+CD45.1+CD8+T细胞在各组织中的分布情况；E：CD44+CD45.1+CD8+T细胞的流式圈门策略以及流式细胞术检测结果；F：中枢记忆T细胞(Tcm)的圈门策略；G、H：Tcm在各个组织中的比例和绝对计数；I：组织驻留记忆T细胞(Trm)的圈门策略；J、K：Trm在各个组织中的比例和绝对计数；a: P < 0.05，b: P < 0.01 图 3 肿瘤特异性CD8+ T细胞以及记忆表型在TDLN、NLN、骨髓、脾脏、肝和肺等组织中的分布情况 |
2.4 新辅助PD-L1抗体治疗对肿瘤记忆CD8+T细胞的形成和维持无显著影响
评估新辅助PD-L1抗体治疗对肿瘤特异性CD8+T细胞在体内分布的影响，结果发现，新辅助PD-L1抗体治疗无显著影响(图 4A、B)。进一步检测新辅助PD-L1抗体治疗对记忆T细胞亚型的影响，结果发现，Tcm在接受新辅助PD-L1抗体后，在记忆阶段，其在各组织中的占比和绝对数均没有显著变化(图 4C、D)。同时，新辅助PD-L1抗体治疗有导致TDLN和NLN中Trm下降的趋势(图 4E、F)。
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| A、B：新辅助PD-L1抗体治疗后，各组织中OT-Ⅰ细胞占总CD8+T细胞的比例；C、D：记忆阶段Tcm在各个组织中的比例和数量；E、F：记忆阶段Trm在各个组织中的比例和数量 图 4 新辅助PD-L1抗体治疗对效应和记忆阶段中TDLN、NLN、骨髓、脾脏、肝和肺中肿瘤特异性CD8+T细胞的影响(n=5~6，x±s) |
3 讨论
对于可切除的早期肿瘤而言，复发是临床肿瘤治疗所面临的巨大挑战，新辅助PD-1抗体/PD-L1抗体治疗在黑色素瘤等多个瘤种上表现出积极的临床结果。目前，超过100项临床试验正在不同的肿瘤类型中进行。研究表明，新辅助ICB治疗能够促进T细胞扩增，从而增强机体对肿瘤的控制，并且可能增强机体抗肿瘤免疫记忆从而减少肿瘤复发[15]。TDLN是第一个接受原发病灶淋巴引流的淋巴结，是启动抗肿瘤免疫的起始位点，但同时又是肿瘤发生早期转移的最常见部位，因此，手术切除时，往往选择将淋巴结进行一并切除，以降低复发可能。记忆CD8+ T细胞在持久的抗肿瘤免疫当中至关重要，当再次暴露于病原体时能迅速发挥效应功能，并且与临床肿瘤患者的预后改善和总生存期延长密切相关。研究表明，TDLN中存在一群表达TCF-1的真正的记忆CD8+ T细胞[8]，切除掉TDLN可能会损坏记忆性T细胞库，影响随后的疾病缓解和免疫治疗反应。因此对接受新辅助ICB治疗时是否切除TDLN产生了激烈讨论。本研究发现新辅助PD-L1抗体治疗在一定程度上增强了记忆CD8+ T细胞的产生(趋势)，但对肿瘤特异性的记忆CD8+ T细胞在体内各组织中的分布及表型没有显著影响。动物实验的结果证实，TDLN的切除虽然导致小鼠短期内对肿瘤生长抑制减弱，但并不会影响长期的肿瘤控制效果。
根据免疫学基础理论，在手术切除小鼠皮下肿瘤后，小鼠体内大多数活化的肿瘤特异性T细胞随着体内肿瘤抗原的缺失而逐渐凋亡，经历收缩期，剩下的约5%具有长期存活能力的记忆T细胞[16-17]。为了评估小鼠体内记忆T细胞的表达情况，将手术30 d以后作为记忆期，认为此时小鼠体内仅有肿瘤特异的记忆T细胞能够存活下来。在接受肿瘤切除术30 d后，以致死量的肿瘤细胞于左侧背侧皮下进行肿瘤再挑战，以评估新辅助PD-1抗体/PD-L1抗体是否导致延长的保护性T细胞免疫[14]。
记忆CD8+T细胞作为一个异质群体在机体内持续存在，根据其表面标记物、效应潜能等，可分为中枢记忆T细胞(Tcm)、效应记忆T细胞(Tem)和驻留记忆T细胞(Trm)[18-20]。记忆T细胞的异质性还体现在解剖位置的不同决定了作用时相的差异[21]。本研究发现，在接受肿瘤再挑战后，在7 d以内，接受新辅助ICB治疗的小鼠肿瘤生长显著受到抑制，猜测抗肿瘤免疫记忆可能得到一定程度的强化，进一步从细胞层面分析记忆T细胞亚群发现，Tcm有增加的趋势，但TDLN中Trm有减少的趋势。Trm在局部区域的保护中比较重要，这个结果可能提示，在新辅助免疫治疗条件下，TDLN中Trm的薄弱可能会使得TDLN成为复发肿瘤易累积器官。然而切除TDLN，肿瘤抑制减弱，猜测TDLN可能是记忆T细胞产生和维持的场所，TDLN的切除可能破坏了记忆T细胞库，导致肿瘤生长加快。在细胞层面，本研究发现TDLN中存在大量的Tcm和Trm。因此，我们在肿瘤再挑战早期观察到的肿瘤生长的差异，可能是由于TDLN的切除导致Tcm和Trm的减少而导致。新辅助PD-1抗体/PD-L1抗体疗法后手术切除残留肿瘤病灶时，常规进行TDLN的清扫。本研究结果表明新辅助PD-1抗体/PD-L1抗体治疗条件下TDLN对记忆CD8+ T细胞形成和维持很重要，但TDLN切除与否，并不会影响长期的肿瘤控制效果。
综上所述，本研究发现TDLN是抗肿瘤免疫的重要参与者，是肿瘤特异性CD8+ T细胞活化启动的起始位点，也是记忆T细胞产生和维持的主要场所，记忆CD8+ T细胞的比例数量显著高于脾脏等其他器官组织，并且新辅助ICB治疗在一定程度上对其有促进作用，能够促进肿瘤特异性CD8+ T细胞在各个组织中的分布，但TDLN切除与否，接受肿瘤再挑战小鼠最终全部消退，并不会对肿瘤的远期控制效果产生显著影响。
志谢 感谢陆军军医大学2021级硕士研究生朱恩健、侯俊雷、杨学智以及2018级八年制学生童单在实验中给予的帮助| [1] |
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