2. 400038 重庆，陆军军医大学(第三军医大学)军事预防医学系防原医学教研室;
3. 400037 重庆，陆军军医大学(第三军医大学)第二附属医院检验科;
4. 400042 重庆，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室
2. Department of Radiation Medicine, Faculty of Military Preventive Medicine, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400038;
3. Department of Clinical Laboratory, Second Affiliated Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400037;
4. State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury, Chongqing, 400042, China
随着核与辐射在国防、工业及医疗领域中的广泛应用，核事故、辐射突发事件及医疗照射相关损伤日益增加[1-2]。研究指出，放射治疗应用于超过70%实体肿瘤患者[3]，虽然肿瘤放射治疗技术迅速发展且日益成熟，但短时程、大剂量电离照射不可避免地造成人体正常组织损伤，对患者治疗效果和生存质量造成严重伤害。小肠黏膜细胞分裂旺盛、增殖周期短，对电离辐射极度敏感，因其特殊的解剖学位置，在临床上行盆、腹腔肿瘤放射治疗过程中，常引起严重的放射性肠损伤（radiation-induced intestinal injury，RII），诱发肠源性感染等毒副反应，甚至并发多器官功能障碍综合征[4]，患者因难以耐受电离辐射相关肠损伤而被迫延缓或中断肿瘤治疗进程[5]。人α-防御素5（human α-defensin 5，HD5）是由小肠隐窝底部潘氏细胞分泌的天然抗菌肽，在维持小肠功能稳态和抵御外源性致病菌侵袭中发挥关键作用[6]。研究指出，HD5功能异常与儿童乳糜泻等疾病发生、发展密切相关，HD5基因突变或拷贝数下降，人群罹患感染性肠炎综合征风险显著增加[7]。既往研究证实，肠潘氏细胞发育异常或功能障碍诱导的HD5表达降低与肠易激、胃肠道溃疡等消化道疾病的发生、发展密切相关[8]。新近报道指出，HD5通过阻断肠菌LPS诱导单核细胞释放炎症因子IL-1β释放，改善肠道炎性损伤[9]；HD5小鼠同源基因隐窝素4（Cypt4）能够抵御辐照诱导小鼠放射性肠炎损伤，改善小肠功能失调[10]。ZHAO等[11]学者发现广谱抗生素通过降低回肠LPS生成，抑制TLR4-MyD88-NF-κB信号通路介导的肠道炎性因子合成和释放。课题组前期研究证实，HD5干预可显著降低小鼠血清LPS含量[12]。因此推测HD5通过选择性杀伤肠道条件致病菌，中和LPS、适度阻断TLR4-MyD88-NF-κB炎症信号通路，减轻电离辐射诱导的肠道损伤。然而，HD5在辐照诱导肠道损伤中的机制目前仍未解析。本研究通过构建金属基质蛋白酶7（matrix metalloproteinase 7，MMP7）敲除小鼠阻断小鼠自身防御素活化[13-15]，同时在该敲除鼠基础上转入HD5基因，初步探讨HD5在小鼠辐照暴露损害中的作用和机制，为治疗和预防辐照损伤提供实验依据和研究方向。
1 材料与方法 1.1 试剂福尔马林-硫酸锌固定液、AB-PAS染色试剂盒购自索莱宝生物公司；蛋白酶K、TUNEL细胞凋亡试剂盒、FITC标记山羊抗兔IgG、DAPI染色液购自上海碧云天生物公司；Premix TaqTM、TB Green® Premix Ex TaqTM Ⅱ、Sample Protector for RNA/DNA购自TaKaRa公司；Olfm4、TLR4、MyD88、NF-κB一抗购自CST公司；基因引物设计合成于擎科生物公司。
1.2 实验动物及分组野生型C57小鼠（WT小鼠）购自陆军军医大学实验动物中心；杂合金属基质酶7敲除小鼠（MMP7+/-小鼠）购自美国The Jackson Laboratory，经繁育和鉴定，成功培育纯合子MMP7基因敲除小鼠（MMP7-/-小鼠）；进一步将人HD5基因转入MMP7-/-小鼠，构建、繁育MMP7-/-、HD5转基因小鼠（HD5tg小鼠），经鉴定HD5在不同周龄HD5tg小鼠回肠组织中呈持续表达状态；将各品系小鼠于SPF动物饲养室常规饲养。实验小鼠体质量18~20 g，6~8周龄，一般状态良好。实验小鼠分组如下：WT小鼠组、MMP7-/-小鼠组、HD5tg小鼠组。利用5 Gy X射线（1.26 Gy/min）辐照各组小鼠，观察小鼠饮食、进水及体质量变化，记录小鼠存活时间，并于辐照第0、2、10天取材小鼠回肠组织进行生物学检测。
1.3 HE染色取回肠组织，经过固定、脱水及石蜡包埋切片后，利用二甲苯脱蜡、酒精水合、苏木精染色、盐酸分化、伊红染色、酒精脱水、烤片、二甲苯透明切片后，利用中性树脂进行封片，显微镜下观察、全波片扫描。
1.4 TUNEL细胞凋亡检测及免疫荧光检测Olfm 4表达切片经脱蜡、水化、蛋白酶K修复后，利用TUNEL检测液在37℃恒温箱中进行孵育，孵育完成后加入含0.3% Triton PBS溶液通透切片30 min，切片封闭后加入Olfm4（1∶300）一抗，4℃孵育过夜。孵育结束后加入荧光FITC二抗，37℃避光孵育40 min，洗涤并滴加封片剂（含DAPI染色液）封片，荧光显微镜观察、摄片（摄片数＞10张），用Image J软件分析图像。
1.5 PAS染色切片经脱蜡、水化、阿利新蓝染色液染色（2 min）、氧化剂氧化（15 min）后，滴加Schiff染色液，孵育20 min，PBS洗涤切片5 min×3次，经梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封固、全波片扫描后，用ImageJ软件分析图像。
1.6 免疫蛋白印迹收集、提取回肠黏膜总蛋白。蛋白变性后进行SDS-PAGE凝胶电泳（40 μg/孔）；而后转印至PVDF膜，室温封闭PVDF膜1.5 h；分别加入TLR4、MyD88、NF-κB抗体稀释液4℃过夜孵育；洗膜并加入二抗稀释液室温孵育1.5 h；洗膜并ECL曝光成像。
1.7 RT- PCR检测炎症因子转录水平采集末段回肠（长度约1 cm），用预冷PBS洗涤后，放入装有Sample Protector for RNA/DNA的EP管中，剪碎后转移至装有TRIzol试剂的M管中，解离器匀浆后，用Premix TaqTM提取总mRNA。取1.0 μg mRNA进行逆转录。反应生成的cDNA作为模板，采用CFX荧光定量PCR仪进行扩增。反应体系为20 μL，TB Green® Premix Ex TaqTM Ⅱ 10 μL，上下游引物各0.8 μL，模板0.8 μL，灭菌蒸馏水7.6 μL。扩增程序：95℃预变性30 s，之后为95℃ 5 s，60℃ 30 s，共39个循环。引物序列见表 1。
| 基因 | 引物序列 |
| IL-1β | 上游5′-TCTCGCAGCAGCACATCA-3′ |
| 下游5′-CTACTCCGATGTTGGGTCTTCG-3′ | |
| IL-6 | 上游5′-GAGTCACAGAAGGAGTGGCTAAGGA-3′ |
| 下游5′-TCTAGATGAGCCGTTTGGATCACGC-3′ | |
| IL-10 | 上游5′-AGGATGCACATCAAAAGGCTT-3′ |
| 下游5′-CATAGGAAGGATTGGCTCCGG-3′ |
1.8 统计学分析
采用SPSS 25.0进行统学分析，计量资料用x±s表示。组间差异比较用单因素方差分析，两两比较采用Tukey检验，利用Kaplan-Meier生存曲线分析小鼠生存期，组间采用Log-rank检验。检验水准：α=0.05。
2 结果 2.1 HD5提高辐照暴露后小鼠的生存率基于C57小鼠成功构建并繁育MMP7-/-小鼠和HD5tg小鼠（图 1A）后，利用5 Gy X射线（1.26 Gy/min）辐照后，观察辐照对WT小鼠、MMP7-/-小鼠和HD5tg小鼠的30 d内损伤效应及生存的影响。如图 1B所示，辐照暴露后第7~8天，各组小鼠先后出现死亡，第17天后小鼠停止死亡；截至观察期结束，WT组、MMP7-/-组、HD5tg小鼠组小鼠生存率分别为50%（10/20）、35%（7/20）和55%（11/20）；生存分析发现，WT组和HD5tg组小鼠生存率显著高于MMP7-/-组（P<0.05），WT组和HD5tg组小鼠组间生存率无统计学差异。
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| A：构建、繁育MMP7-/-小鼠和HD5tg小鼠，红色箭头为繁育幼鼠；B：3组小鼠辐照后生存率 图 1 MMP7-/-小鼠、HD5tg小鼠培育及小鼠辐照暴露后生存曲线 |
2.2 HD5缓解辐照诱导的小鼠回肠组织损伤作用
利用HE染色观察小鼠回肠组织病理学改变（图 2A），结果显示：辐照前，各组小鼠回肠绒毛和隐窝结构完整、排列整齐，肠绒毛光滑、无脱落，固有层无充血、水肿。辐照后第2、10天，回肠黏膜出现不同程度的损伤，主要表现为肠绒毛扭曲倒伏、形态各异，细胞变性、坏死并脱落，绒毛上皮与固有层出现增宽的Gruenhagen’s间隙，隐窝数量减少，固有层毛细血管扩张、出血明显等。与WT组相比，MMP7-/-组Chiu’s小肠组织损伤评分高（P<0.05，图 2B），肠黏膜绒毛扭曲倒伏、坏死并缩短严重（P<0.05，图 2A、C），隐窝结构破坏、数目减少（P<0.05，图 2A、D）。与MMP7-/-组相比，HD5显著改善肠黏膜损伤，表现为Chiu’s小肠组织损伤评分低（P<0.05，图 2B），绒毛结构较完整，细胞变性、坏死、脱落少（P<0.05，图 2A、C）；隐窝深度、数目增加（P<0.05，图 2A、D）。
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a: P<0.05，与WT组比较；b: P<0.05，与MMP7-/-组比较 A：回肠组织HE染色；B：Chiu’s小肠组织损伤评分；C：回肠上皮绒毛长度；D：回肠上皮隐窝深度 图 2 HD5对辐照暴露小鼠回肠组织损伤的影响 |
2.3 HD5改善辐照诱导小鼠回肠细胞凋亡及肠道干细胞增殖、分化
采用TUNEL法检测回肠黏膜细胞凋亡，结果显示：辐照后第2、10天，与WT组相比，MMP7-/-组肠TUNEL+细胞明显增多（P<0.05），HD5tg组凋亡细胞数与WT组相比无统计学差异（图 3A、B）。Olfm4染色显示：辐照后第2天，隐窝Olfm4+细胞数量明显减少；辐照暴露后第10天，HD5tg组和WT组Olfm4+肠道干细胞数量高于辐照前水平，而MMP7-/-组仍低于正常水平（P<0.05，图 3C）。PAS染色显示：辐照后2、10 d，肠道杯状细胞数量呈下降-回升趋势（图 3D），HD5tg组和WT组与MMP7-/-组相比，下降幅度小，回升幅度大，甚至辐照后10 d，杯状细胞数量多于辐照前水平（P<0.05，图 3E）。
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a: P<0.05，与WT组比较；b: P<0.05，与MMP7-/-组比较 A、B：TUNEL法检测回肠上皮细胞凋亡 红色荧光: TUNEL染色标记肠凋亡细胞; 绿色荧光: Olfm4标记肠道干细胞；C：回肠上皮隐窝Olfm4+细胞统计；D、E：回肠上皮PAS染色杯状细胞 图 3 HD5对辐照暴露后小鼠小肠细胞凋亡及肠道干细胞增殖、分化的影响 |
2.4 HD5逆转辐照诱导的小鼠肠道TLR4-MyD88-NF-κB信号通路激活并降低炎症因子转录水平
辐照暴露各组小鼠第2、10天后，利用Western blot检测TLR4-MyD88-NF-κB信号通路蛋白表达。如图 4所示，与WT组相比，MMP7-/-组小鼠回肠黏膜TLR4、MyD88、NF-κB表达水平增加，HD5tg组小鼠显著逆转辐照对TLR4、MyD88、NF-κB表达的诱导效应。同时，利用qRT-PCR检测肠道组织中IL-1β和IL-6 mRNA转录水平。结果发现，与WT组相比，MMP7-/-组回肠组织中IL-1β、IL-6转录水平显著升高（P<0.05）；HD5tg组小鼠辐照后，肠道组织中IL-1β、IL-6水平显著低于MMP7-/-组（P<0.05）。进一步检测抑炎因子IL-10在各组肠道组织中的转录水平差异，发现在MMP7-/-组小鼠回肠组织中，IL-10转录水平显著低于WT组和HD5tg组，HD5转入后，显著逆转辐照诱导MMP7基因敲除后对IL-10功能的抑制效应。
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a: P<0.05，与WT组比较；b: P<0.05，与MMP7-/-组比较 A：Western blot检测辐照后2 d TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平；B：Western blot检测辐照后10 d TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平；C：qRT-PCR检测IL-1β mRNA水平；D：qRT-PCR检测IL-6 mRNA水平；E：qRT-PCR检测IL-10 mRNA水平 图 4 HD5对辐照暴露后小鼠肠道炎症通路及炎症介质表达的影响 |
3 讨论
电离辐射广泛存在于包括土壤、植物、水及食物等自然环境中，低背景辐射对机体健康维护发挥重要作用，但短时间、大剂量电离辐射暴露对机体造成严重的损伤。在临床医疗诊治中，放射治疗是肿瘤患者常见治疗手段。电离辐射在杀伤肿瘤细胞的同时，对机体正常组织的损害不可避免，尤其是对快速更新、增殖周期短的肠上皮细胞损害作用显著，严重的毒副反应限制了放射治疗杀伤肿瘤细胞的作用。本研究通过构建MMP7敲除鼠和HD5转基因鼠，观察辐照暴露对小鼠小肠组织的损伤效应，并初步探讨了HD5在改善辐照诱导小肠损伤中的作用和功能。
HD5作为人α-防御素家族主要成员，由小肠潘氏细胞合成和分泌，是肠道内重要的内源性防御肽，发挥抵御外源性致病菌侵袭、调节肠道先天免疫功能和维持肠道组织稳态等功能[16-17]。SALZMAN等[18]学者应用MMP7敲除小鼠和HD5转基因小鼠研究HD5对肠道微环境的影响，证实HD5在小肠微生物种群结构调节中发挥重要作用。已有研究提示HD5参与了肿瘤患者肠道放射治疗诱导的肠道菌群重塑及炎症调节[19-20]。新近研究发现，通过补充菊粉和/或丁酸钠诱导小鼠小肠潘氏细胞α-防御素和MMP7合成增加，改善食源性脂肪肝小鼠肠道屏障功能和代谢障碍[21]。ISHIKAWA等[22]研究指出，外源性注射HD5能够显著改善右旋糖酐硫酸钠诱导的小鼠肠炎症状，增加小鼠的存活率（P<0.05）。本研究应用MMP7敲除小鼠，并在MMP7敲除基础上杂交繁育HD5转基因小鼠。MMP7敲除后，小鼠潘氏细胞内隐窝素前体不能激活为具有功能性的成熟体，人肠道α防御素的加工处理过程与小鼠不同，人类潘氏细胞内缺乏MMP7，潘氏细胞释放未加工的HD5前体，在C端Arg62位点被胰蛋白酶剪切，产生成熟的HD5并发挥功能。本研究动物模型为排除小鼠自身肠道α防御素功能失活的干扰提供了条件，同时可以进一步研究HD5在肠道如何发挥效应，为探索HD5在宿主肠道黏膜防御中的作用建立平台。在本研究中，辐照暴露各品系小鼠后，小鼠组间生存率存在统计学差异，与WT小鼠相比，MMP7-/-小鼠抗辐照能力下降明显，MMP7-/-小鼠转入HD5基因后，HD5tg组小鼠生存率较MMP7-/-组显著增加，同时，HD5tg组小鼠与WT组生存率分析无统计学差异。以上研究结果表明，α-防御素是小鼠接受大剂量辐照后存活的关键要素，其中HD5在小鼠增强抗辐射损害中扮演重要角色。
HD5主要在空肠和回肠组织中发挥生物学功能。新近研究发现，在乙醇诱导小肠损伤模型中，HD5干预能够重塑肠道菌群组成、改善小肠上皮细胞损伤，逆转乙醇对肠绒毛结构和功能破坏[23]。WANG等[24]学者指出，HD5通过与肠上皮血管紧张素转换酶2（ACE2）结合，阻断SARS-CoV-2对小肠侵袭、感染能力，改善肠黏膜功能。上述研究表明，HD5对外源性刺激诱导小鼠小肠组织的损伤具有良好的保护作用。本研究利用HE染色观察辐照后小肠组织形态损伤修复、免疫荧光检测上皮细胞凋亡及干细胞增殖、PAS染色小肠杯状细胞检测肠道干细胞分化，探讨HD5对小鼠辐照后小肠损伤的保护效应。结果发现，与WT组相比，MMP7敲除后，小鼠对辐射致小肠损伤敏感性增加，表现为肠绒毛倒伏、脱落并缩短，上皮细胞变性、脱落、凋亡数量增加，同时，干细胞增殖、分化迟滞；HD5基因转入后上述病理改变得到显著改善。上述结果提示，HD5通过维持小肠上皮屏障功能，促进细胞更新和组织修复，进而改善辐照诱导小鼠小肠损伤。
本研究进一步探讨了HD5在改善辐照诱导小鼠炎性损伤中的作用。既往体内研究证实，HD5对所有菌株均有杀菌活性，同时趋化抗炎因子在肠道组织富集，抑制条件致病菌侵袭[22]。GAO等[19]证实Cypt4（HD5小鼠同源基因）对小肠条件致病菌杀伤作用优于肠道益生菌，抑制小鼠辐照后炎症因子的合成和释放。ZHAO等[25]研究人员利用二氧化硅纳米颗粒荷载T7E21R-HD5，增强HD5靶向传递和渗透细菌能力，提高其对多药耐药大肠杆菌的抗菌作用。本研究与上述研究结果相一致。实验发现，与WT组相比，MMP7-/-小鼠回肠黏膜TLR4、MyD88、NF-κB表达水平增加，HD5tg小鼠显著逆转辐照对TLR4、MyD88、NF-κB表达的诱导效应，与MMP7-/-小鼠相比，HD5tg小鼠在辐照暴露后促炎因子IL-1β、IL-6转录降低，抑炎因子IL-10转录上调。表明HD5可通过TLR4-MyD88-NF-κB信号通路抑制肠道黏膜炎症因子的合成，有效抑制辐照诱导小鼠肠道炎性损伤。HD5对肠上皮功能维持、抵御条件致病菌侵袭的具体分子机制仍待阐明，本课题组目前正开展相关机制研究。
综上所述，本研究基于C57小鼠成功构建并繁育MMP7-/-小鼠和HD5tg小鼠，初步证实HD5能够改善辐照诱导的小鼠小肠上皮屏障功能障碍，促进细胞更新和组织修复，抑制炎性损伤。该结果对于进一步研究HD5在辐照诱导小鼠损伤中的作用和功能具有重要的科学意义。同时，对于探索辐照诱导机体损伤防治新策略具有潜在的应用价值。
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