随着老龄化的加剧，瓣膜性心脏病(valvular heart disease，VHD)的患病率在世界范围内均逐渐升高^[1-2]。其中，钙化性主动脉瓣疾病(calcific aortic valve disease，CAVD)是最常见的瓣膜性心脏病之一，每年有超过1 000万患者，且大部分都是老年人群^[3]。CAVD早期通常无明显症状，但随着瓣叶的逐渐增厚、钙化以及主动脉开口狭窄的愈发严重而出现血流动力学异常、心力衰竭等并最终导致死亡。近年来，越来越多的证据表明，CAVD并非是一种被动性的退化性疾病，其进展与血脂异常、炎症反应等复杂因素紧密相关^[4-6]。但是具体的发病机制目前尚未完全阐明，暂无有效的药物可以预防和治疗，换瓣手术是唯一的有效治疗手段。因此，寻找CAVD发生发展过程中适合的药物干预靶点是当前急需解决的问题^[7]。

镁离子是人体重要的阳离子，大部分储存于细胞内，仅有少部分在细胞外。镁离子是多种酶促反应的重要辅酶因子，参与了多项生理活动，与许多疾病的发生发展密切相关。近年来，有临床研究发现低镁血症与血管钙化和心血管疾病有关^[8-9]。随着研究的深入，发现镁离子可以起到抗血管钙化的作用，但是其与瓣膜钙化间的联系研究较少^[10]。因此，本研究通过观察镁离子对体外诱导瓣膜间质细胞成骨分化的作用，试图明确镁离子在瓣膜钙化病程中所扮演的角色，为瓣膜钙化的治疗提供新的思路。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 猪瓣膜来源

选取4月龄家猪(上海五丰食品有限公司)，体质量约50 kg，获取主动脉瓣膜组织后，立即置放入含1%青-链霉素的预冷无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中，置于冰盒迅速返回实验室进行细胞的分离与培养。

1.1.2 试剂与仪器

DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、e酶、Ⅱ型胶原均购于美国Gibco公司；PBS缓冲液购于上海博蕴公司；SDS裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购于上海碧云天生物公司；PAGE蛋白上样量缓冲液、PAGE凝胶制备试剂盒购于上海雅酶生物医药科技有限公司，α-SMA购于Proteintech公司；Vimentin、CD31购于Abcam公司；OPN、RUNX2、ERK、P-ERK、AKT、P-AKT抗体均购于CST公司；兔抗、鼠抗购于武汉谷歌生物科技有限公司；DAPI染色液购于博士德生物工程有限公司，茜素红S染液购于索莱宝公司。多功能台式离心机购于德国Eppendorf公司；流式细胞仪购自美国BD公司；蛋白印记相关仪器购于Bio-Rad公司；电子显微镜购于德国Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 原代猪主动脉瓣间质细胞(aortic valve interstitial cells，AVICs)的分离与培养

在超净台中取出猪主动脉瓣膜，在含1%青-链霉素的预冷无菌PBS中漂洗至上清呈澄清状态，用医用无菌棉签轻拭瓣膜表面，每3片瓣膜组织放于一个无菌EP管中，加入Ⅱ型胶原1 mL，37 ℃恒温摇床消化15 min。取出瓣膜后用PBS涮洗3 min/3次，加入1 mL Ⅱ型胶原，将用眼科剪将瓣膜组织剪碎至糊状，37 ℃恒温摇床消化90 min。将EP管中所有内容物用直径200目的滤网过滤，收集滤出物并离心。弃上清后用10%DMEM将沉淀吹打均匀后接种在10 cm大皿中，及时观察细胞状态和形态，24 h后更换新鲜培养基。

取对数期生长的细胞，4%多聚甲醛固定后使用0.2% Triton X-100通透细胞15 min，山羊血清封闭细胞30 min；加入一抗工作液4 ℃孵育过夜，次日取出清洗后荧光二抗室温避光孵育30 min；孵育完毕后加入DAPI染液3 min，清洗后即可于荧光显微镜下观察拍照。取对数生长期的细胞，计数后重悬，使每管细胞量为1×10⁷/mL，加入5 μL一抗工作液，混匀后4 ℃孵育30 min；清洗2遍后用100 μL PBS缓冲液重悬，加入荧光二抗4 ℃避光孵育30 min，清洗后1 h内使用流式细胞仪进行检测。

1.2.2 AVICs的成骨分化诱导

配置成骨诱导培养基(osteogenic induction medium，OIM)，5 mL双蒸水中加入25 mg抗坏血酸、200 μL诺和灵和156 mg NaH₂PO₄-7H₂O，过滤后取5 mL加入500 mL含5%FBS和1%双抗的DMEM中，即配置成功。取3~7代AVICs接种于6孔板，细胞密度控制在50%左右，待细胞贴壁后加入OIM培养7 d。

1.2.3 Western blot检测镁对成骨标志物以及相关信号通路表达的影响

将细胞分为空白对照组(Blank组)、成骨诱导培养基组(OIM组)和镁处理组(浓度为1、2、3 mmol/L MgSO₄溶液)。各组细胞处理完成后弃上清，PBS清洗细胞3遍，置于冰盒中后加入SDS细胞裂解液30 min，刮取后收集并进行超声破碎处理。BCA法测各组蛋白浓度后配置样品，煮沸20 min后上样，恒压60V 30 min、120V 60 min进行电泳。电泳结束后切胶，恒流270 mA、90 min将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，TBST缓冲液洗膜后加入配制好的一抗，4 ℃过夜。次日TBST缓冲液清洗后加入相应二抗，室温孵育1 h，清洗后加入化学发光液进行曝光显影。采用Image J软件分析条带灰度值。

1.2.4 茜素红染色检测镁对钙盐沉积的影响

取3~7代AVICs接种于12孔板内，细胞密度控制在50%左右，待细胞贴壁后按照实验分组干预7 d，弃上清，PBS清洗3遍，4%多聚甲醛室温孵育30 min以固定细胞。PBS清洗3遍后加入茜素红S染液，约5 min观察钙盐呈现较深的橙红色时移除染液，并用无水乙醇清洗，观察染色结果并拍照。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism软件和SPSS 26.0软件进行数据处理。计量资料用x±s表示。组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 原代AVICs的形态及表型鉴定

将3~7代AVICs接种于6孔板，待细胞贴壁后可在镜下观察到细胞呈梭形、纺锤形或不规则多角形，均匀分布，单层生长。使用细胞免疫荧光染色的方法对AVICs进行鉴定(图 1、2)，几乎所有的细胞均表达间叶源性细胞标志物波形蛋白(Vimentin)；表达成纤维细胞和平滑肌细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的细胞较少；视野内几乎未见内皮细胞标志物CD31阳性的细胞。流式细胞术检测到AVICs的Vimentin表达率为96.4%；低表达α-SMA，表达率约为13.06%；不表达CD31，表达率约为0.08%(阳性率 < 5%)。因此，所分离出的细胞几乎都为间质细胞，且是处于静止型的VICs，纯度较为理想，无明显的瓣膜内皮细胞污染。

2.2 镁离子抑制OIM诱导的AVICs成骨样细胞表型转分化

各组细胞干预7 d后提取总蛋白，Western blot结果显示：OIM组成骨标志物RUNX2以及OPN表达量显著高于Blank组(P < 0.01)；与OIM组相比，镁处理组可显著降低RUNX2以及OPN的表达量(P < 0.01)，尤其是镁离子浓度3 mmol/L时更为明显，见图 3。

2.3 镁离子抑制OIM诱导的AVICs成骨分化能力

茜素红染色结果可见：OIM组较Blank组钙盐沉积显著增多；镁处理组虽然仍有少量钙结节存在，但相比较于OIM组，钙盐沉积明显减少，见图 4。

2.4 参与镁抑制钙化培养基诱导的AVICs成骨分化的信号通路

根据上述结果选取OIM+3 mmol/L Mg²⁺组，Western blot结果显示(图 5)，磷酸化的AKT在OIM中被显著激活(P < 0.01)，OIM+3 mmol/L Mg²⁺则使磷酸化失活(P < 0.01)，而各组总AKT基本保持稳定。ERK信号通路也是同样的表达情况。因此推测，高浓度的镁可能通过抑制OIM诱导的AKT和ERK激活来减缓成骨分化。

3 讨论

近年CAVD已被逐渐认为是一种涉及炎症、脂质沉积等多种过程的主动性疾病，是类似于骨发育等多因素综合调控的病理过程。心脏瓣膜主要由覆盖在瓣膜表面的内皮细胞、贯穿瓣膜整层结构的间质细胞以及间质细胞分泌的胶原蛋白、弹性纤维等细胞外基质成分共同组成^[11-12]。其中，间质细胞是瓣膜中数量最多的细胞成分，具有多种表型分化潜能。由于正常的人源VICs很难获取，AVICs与人类同源性相对较高，来源广泛易获取，所以自行分离培养原代AVICs进行实验研究^[13]。为了探讨镁与AVICs成骨分化之间的关系，本实验首先通过OIM诱导AVICs成骨分化，Western blot结果显示OPN和RUNX2表达增加，表明成功建立了体外AVICs成骨分化模型。

正常情况下，静止的VICs表现成纤维细胞样表型，当受到异常血流、机械应力或其他损伤刺激时，VICs会活化成肌成纤维细胞样表型^[14]。活化的VICs收缩性能增强，α-SMA表达增加，产生胶原的能力也大大增强，在完成组织修复后即恢复为静止型，或者直接发生凋亡以维持组织平衡稳态^[15-16]。若刺激因素继续存在，VICs有可能通过Wnt/β-catenin、MAPK/ERK、Notch等多条通路上调RUNX2、OPN等多种成骨细胞相关因子的表达，并向成骨细胞样表型转分化，导致瓣膜组织增厚变硬，最终发生钙化^[17-18]。

Mg²⁺作为人体必需的阳离子，有多项重要的生理功能，对血管内皮细胞和平滑肌细胞均有一定的调节作用，因此与血管钙化之间的关系备受关注^[19]。Mg²⁺和Ca²⁺是共价二价阳离子，Mg²⁺具有Ca²⁺的理化性质，可作为生理性钙拮抗剂，钙镁平衡对钙化的发生发展具有重要影响^[20]。近年研究发现，镁可以通过影响钙磷代谢、炎症反应、脂质沉积和成骨分化等过程对血管钙化起到抑制作用，但与瓣膜钙化之间的相关研究甚少^[21-23]。本实验发现在OIM处理的AVICs中加入Mg²⁺后，OPN和RUNX2的蛋白表达量显著降低，尤其是高浓度镁处理组效果尤为明显。茜素红染色结果发现，镁处理组的钙结节数量变少且体积变小，更加验证了Mg²⁺可以减轻体外OIM诱导的AVICs钙化发生。

大量研究证明，PI3K/AKT和MAPK/ERK1/2信号通路活化后磷酸化水平升高，在多种细胞的成骨分化过程中均起着至关重要的作用，且高镁在一定程度上参与PI3K/AKT和MAPK/ERK1/2信号通路的调节^[24-26]。为了阐明镁对AVICs成骨分化保护作用的潜在机制，本研究进一步对各个处理组的PI3K/AKT和MAPK/ERK1/2磷酸化水平进行检测。Western blot结果显示，高镁能显著降低OIM诱导的AKT和ERK1/2磷酸化，因此推测镁能够通过调节PI3K/AKT和MAPK/ERK1/2信号通路参与抑制钙化的进展。

综上所述，镁可以抑制体外OIM诱导的AVICs钙化，其可能是通过调节PI3K/AKT和MAPK/ERK1/2信号通路抑制AVICs成骨细胞表型转分化进而抑制钙化的发生发展。但本研究仅从体外实验方面进行了探究，缺乏体内实验，接下来拟通过动物实验进行体内验证，为CAVD的临床防治提供新靶点。