我校西南医院病理所卞修武院士团队在《Journal of Pathology》上发表研究成果
发布人:wuph 发布时间:2017/12/19 11:02:45  浏览次数:5164次
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肿瘤相关成纤维细胞通过自噬分泌调控乳腺癌细胞干性的研究

赵玺龙 孔祥复 姚小红 卞修武

 

 

 

乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤之一,其中luminal型乳腺癌是最多见的乳腺癌类型,在乳腺癌中的比例超过三分之二,尽管受益于内分泌治疗及综合治疗,仍有相当数量luminal型乳腺癌患者会复发并预后不良。新近的研究认为肿瘤是多种细胞构成的复合体,本质上不是单一的细胞系构成,其中某些肿瘤细胞类似于干细胞,具有自我更新、分化、抗治疗的特征,被称为肿瘤干细胞(Cancer stem/initiating cells, CSCs/CICs)。肿瘤干细胞需要一个特定的肿瘤干细胞微环境(niche),niche由肿瘤细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞等构成,CSCs的干性功能依赖于niche。就luminal型乳腺癌,内分泌治疗和化疗对乳腺癌细胞有杀伤力,但并不能有效杀伤肿瘤干细胞(CSCs)。CSCs是恶性肿瘤复发和转移的祸首,为有效控制复发和转移,CSCs及其赖以为生的niche成为恶性肿瘤治疗的重要靶点。由于CSCs本身的抗药性,主要由“非癌细胞”构成的niche越来越受到研究人员的重视。

乳腺癌组织中有大量的成纤维细胞,既往研究发现这些细胞与乳腺癌的发生、发展密不可分,这些癌细胞间的成纤维细胞被称为肿瘤相关成纤维细胞(Cancer associated fibroblasts,CAFs)。肿瘤相关成纤维细胞也是构成乳腺癌干细胞微环境(niche)的主要构成细胞,有研究报道肿瘤相关成纤维细胞可促进乳腺癌干细胞(BCSCs)的干性。本研究将乳腺癌新鲜组织中的肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)分离、培养,发现很多CAFs与乳腺癌细胞共培养并不能促进乳腺癌细胞干性,通过检测发现促进乳腺癌细胞干性的CAFs往往处于自噬激活的状态。该研究课题组推测自噬可能是CAFs调控BCSCs的一个关键环节?

自噬是非常重要的生物学现象,在外环境刺激下,细胞通过自噬体吞噬一些胞内受损、老化的蛋白或细胞器,并进行分解和再循环,来维持细胞的稳态。细胞发生自噬需要一定的外环境条件激活,乳腺癌组织中乳腺癌细胞及CAFs细胞可处在缺营养和乏氧的自噬激活环境中。该研究对分离的16例CAFs进行检测发现:来自不同乳腺癌组织中的CAFs的自噬活性不一致,CAFs的自噬调控基因(ATG,autophagy-related gene)存在差异,并且自噬活性高的CAFs的培养基处理乳腺癌细胞,可有效提高乳腺癌细胞的干性特征。随后该研究对431例乳腺癌组织样本检测了自噬相关蛋白LC3II、BECN1、ATG5的表达,结果显示乳腺癌干细胞标记(ALDH1,aldehyde dehydrogenase1)的高表达区域的CAFs细胞的自噬囊泡标记物LC3II高表达,并且CAFs的LC3II等自噬相关蛋白高表达组的luminal乳腺癌患者的复发率显著提高,整体成存期显著缩短。

为进一步说明CAFs自噬激活和乳腺癌细胞干性的相关性,构建了敲低自噬启动基因ATG5的CAFs(shATG5-CAFs),收集自噬激活条件下CAFs的条件培养基用于处理乳腺癌细胞。结果显示CAFs细胞自噬启动基因敲低后(shATG5-CAFs)对乳腺癌细胞的干性的促进能力显著减弱。流式实验显示自噬启动基因敲低后,shATG5-CAFs对乳腺癌干细胞(ALDH1+)细胞富集作用显著降低,对乳腺癌细胞成球能力的促进作用显著减低,对乳腺癌细胞干性相关蛋白(POU5F1/OCT4, SOX2 and NANOG)表达的上调作用显著下降。体内小鼠移植瘤实验显示:shATG5-CAFs和乳腺癌细胞(MCF-7)混合注射原位成瘤能力显著低于对照组(shctrl-CAFs和MCF-7)。根据以上结果,该研究提出自噬激活的CAFs可能释放某种分子到胞外,作用于乳腺癌细胞,从而上调了luminal乳腺癌细胞的自我更新和成瘤能力。

自噬囊泡具有蛋白运输和释放的功能,自噬囊泡包裹某些特定蛋白后,没有与溶酶体融合,而是通过囊泡的膜样结构与细胞膜融合,进而将胞内蛋白释放到胞外,这种蛋白分泌过程,被称为自噬性分泌(autosecretion)。该研究借助生物信息学和ELISA实验筛选出HMGB1可能就是CAFs通过自噬释放到胞外的效应蛋白。进一步的实验显示自噬激活后,CAFs细胞内的HMGB1蛋白发生转位;共聚焦显微镜下观察到CAFs细胞内HMGB1与自噬囊泡蛋白LC3II存在共定位;WB实验和ELISA实验显示,随着自噬激活,HMGB1蛋白在胞内减少,在胞外增加。CAFs自噬启动基因敲低后,HMGB1的泌出能力显著减弱。在人乳腺组织中的免疫组化检测显示:乳腺癌组织中CAFs的LC3II高表达时HMGB1低表达,HMGB1高表达时LC3II低表达。HMGB1重组蛋白处理乳腺癌细胞,乳腺癌细胞的干性相关蛋白(POU5F1/OCT4, SOX2 and NANOG)表达增高,成球能力增强,乳腺癌干细胞(ALDH1+)数量增加。以上结果说明, CAFs自噬激活时,HMGB1被分泌胞外, HMGB1是促进乳腺癌细胞干性的效应蛋白。

为探寻HMGB1影响乳腺癌细胞干性的机制,该研究随后对TCGA数据库中的641例的luminal型乳腺癌进行分析,分析显示HMGB1的4个受体(TLR2、TLR4、TLR9、RAGE)中,TLR4与乳腺癌干细胞标志物ALDH1A1的表达显著正相关(r2 = 0.586,p<0.001)。流式分选TLR4阳性的乳腺癌细胞,检测显示TLR4阳性的luminal乳腺癌细胞的干性特征显著增强。TLR4的抑制剂(TAK-242)处理后,CAFs自噬条件培养基对乳腺癌细胞的干性促进作用显著下降。小鼠移植瘤实验显示流式分选的TLR4阴性的luminal乳腺癌细胞不能成瘤,TLR4阳性的luminal乳腺癌细胞在低数量级可成瘤,并且成瘤能力可被自噬激活的CAFs细胞显著增强。以上实验显示:自噬激活CAFs通过 HMGB1-TLR4信号轴促进乳腺癌细胞干性。

   最后,该研究对临床大样本的免疫组化结果(LC3II、TLR4)进行分析,结果显示将CAFs的LC3II的表达和乳腺癌细胞的TLR4表达相结合后,可有效判断luminal型乳腺癌的预后,进一步验证了CAFs自噬分泌HMGB1激活乳腺癌细胞TLR4受体,从而促进乳腺癌细胞干性的机制及预后意义。本研究首次证实了CAFs自噬调控乳腺癌细胞干性,丰富了肿瘤干细胞调控机制。同时,本研究提出了HMGB1-TLR4信号轴在乳腺癌中的作用机制及临床意义,为预后不良型luminal乳腺癌的治疗和诊断提出了新的靶点。

   上述研究结果于2017年8月发表在病理学领域影响最高的SCI期刊《Journal of Pathology》(IF=6.894),中科院JCR分区1区。该论文通讯作者为第三军医大学病理学研究所(西南医院病理科、西南癌症中心)孔祥复院士、卞修武教授、姚小红教授。该论文由第一作者赵玺龙博士完成。

   赵玺龙,博士。现任成都军区昆明总医院病理实验科主治医师。2016年7月毕业于第三军医大学肿瘤学专业。多年从事病理学的临床和研究,副主编著书1本,参编行业标准1部,获省部级一等奖、二等奖各2项。近年来主要致力于肿瘤干细胞微环境调控的研究,主要采用细胞共培养、流式细胞术、自噬调控模型、原位移植瘤模型等技术研究自噬对肿瘤干细胞的调控机制和临床意义。近5年发表SCI论文10篇,第一作者单篇最高影响因子6.894。

  卞修武,中科院院士,主任医师、教授、博士生导师。第三军医大学西南医院病理科(国家重点临床专科中心)及西南癌症中心主任,全军临床病理学研究所所长,全军病理学重点实验室和教育部肿瘤免疫病理学重点实验室主任,国家973计划项目首席科学家和“干细胞及转化研究”国家重点研发计划项目负责人,“万人计划”科技领军人才,“新世纪百千万人才工程”国家级人选,军队高层次人才工程科技领军人才。被习近平主席签署命令授予个人二等功1次。

  孔祥复,生物化学与分子生物学家,中科院院士,现任第三军医大学第一附属医院病理科终身教授、西南癌症中心名誉主任。 主要从事功能基因组学、应用组学研究和人类基因治疗研究。发表论文被SCI收录500余篇,获美国专利19项。回国后,先后承担了香港RGC等重大课题10多项,为香港大学、香港中文大学、清华大学、第三军医大学等多所国内知名院校培养了一大批高层次人才。所参与的“肿瘤血管生成机制及其在抗血管生成治疗中的应用”项目获得2012年度“国家科技进步一等奖”。
 

 全文获取地址:http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/path.4958/abstract;jsessionid=0B3AB7426800B999F16FC6826F2D08BF.f03t03

 

HMGB1 released by autophagic cancer-associated fibroblasts maintains the stemness of luminal breast cancer cells

Running title: Cross-talk between autophagic CAFs and BCICs via HMGB1-TLR4 axis

 

Xi-Long Zhao1, Yong Lin1, Zhuo Tang1, Shuai Yang1, Lu Lu1, Yan Liang1, 2, Jun Jiang 2, Xue Liu1, Jiao Tan1, Xu-Gang Hu1, Qin Niu1, Wen-Juan Fu1, Ze-Xuan Yan1, De-Yu Guo1, Ji Ming Wang3, Xia Zhang1, Hsiang-Fu Kung1*, Xiao-Hong Yao1*, Xiu-Wu Bian1*

1 Institute of Pathology and Southwest Cancer Center, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, China

2 Breast Disease Center, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, China

3 Cancer and Inflammation Program, Center for Cancer Research, National Cancer Institute at Frederick, Frederick, Maryland, United States of America

*Correspondence to: Hsiang-Fu Kung, Xiao-Hong Yao and Xiu-Wu Bian. E-mails: hfkung@163.com, yxh15@hotmail.com and bianxiuwu@263.net

Abstract

Cancer stem/initiating cells (CICs/CSCs) and their niche play a vital role in malignant tumour recurrence and metastasis. Cancer associated fibroblasts (CAFs) are main components in the niche of breast cancer initiating cells (BCICs) and their interaction may profoundly affect breast cancer progression. Autophagy has been considered as a critical process for CIC maintenance but whether it is involved in the cross-talk between CAFs and CICs to affect tumorigenesis and pathological significance remains elusive. In this study, we found that in human breast cancer specimens, the presence of CAFs containing high levels of LC3II, a maker of autophagosome was associated with more progressive luminal human breast cancer. CAFs in human luminal breast cancer tissues with high autophagy activity enriched BCICs with increased tumourigenicity. Mechanistically, autophagic CAFs released high-mobility group box1 (HMGB1) that activated its receptor TLR4 expressed by luminal breast cancer cells to enhance their stemness and tumourigenicity. Thus, high LC3II/TLR4 levels in luminal breast cancer predicted an increased relapse rate and poorer prognosis of patients. Our findings demonstrate that autophagic CAFs play a critical role in promoting the progression of luminal breast cancer through a HMGB1/TLR4 axis and both autophagy in CAFs and TLR4 on breast cancer cells constitute potential therapeutic targets.

 

Keywords: autophagy; cancer-associated fibroblast (CAF); HMGB1; TLR4; breast cancer initiating cell (BCICs)


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