卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，其病死率位居妇科恶性肿瘤之首。2020年全球新发病例超过30万，20万患者病死^[1]。卵巢癌被称为“沉默杀手”，主要因为卵巢深居盆腔，早期卵巢癌症状隐匿，约70%的患者确诊时已为晚期。晚期卵巢癌患者预后差，5年生存率＜40%^[2]。肿瘤细胞减灭术和以紫杉醇、卡铂为主的化疗是卵巢癌的传统治疗方法，但是＞75%的患者会发生耐药^[3]。尽管靶向和免疫治疗已经兴起，然而近年卵巢癌患者5年生存率并无明显改善(仍在35%~40%之间)；无进展生存期(progression-free-survival，PFS) 仅12~18个月^[4-5]。居高不下的病死率促使研究人员不断探寻有效的卵巢癌治疗靶点。

WNK2是近20年才被发现的一个具有双螺旋、PXXP、SH3结构域的细胞质蛋白^[6]。人WNK2主要在心脏、大脑和结肠中表达。其异常可能涉及多种疾病的发生发展，如戈登综合征、颅内出血及肿瘤等疾病^[7-9]。近年来，WNK2被发现在多种肿瘤进展中起着重要调控作用。如启动子异常高甲基化导致人脑胶质瘤、脑膜瘤、胃癌和结肠癌中的WNK2水平显著降低，进而促进了肿瘤的增殖以及细胞的迁移和运动。研究进一步证明WNK2通过调控MEK1/ERK1/2，Rac1通路抑制胶质瘤细胞生长^[10-12]。在宫颈癌中，WNK2通过调控ERK通路抑制了肿瘤细胞的增殖和侵袭^[13]。然而不同于报道的其他肿瘤，我们前期研究证明WNK2在卵巢癌中高表达，并能促进卵巢癌细胞增殖、侵袭等恶性生物学行为。磷酸化质谱测序进一步发现WNK2调控卵巢癌细胞骨架形成等生物学过程。因此WNK2在卵巢癌发展中很可能扮演重要促癌角色^[14-15]。

RNA-Seq作为新兴测序技术，较其他测序技术具有明显的优势。其能检测所有的转录本，包括编码RNA (mRNA)和非编码RNA (ncRNA)，如microRNA、长链非编码RNA (lncRNA)、核糖体RNA (rRNA) 和转移RNA (tRNA)^[16]。转录组测序不仅能发现新的基因，其生成的数据加速了对可变剪接基因、融合基因、突变/SNP、等位基因特异性表达和生物标志物的了解，并且在研究导致卵巢癌耐药的新机制上发挥了充分的作用^[17]。

为了更全面地探究WNK2在卵巢癌中调控的分子机制。本研究通过RNA-Seq测序获取WNK2在体外培养卵巢癌细胞中调控的转录本信息，并通过DisGeNET、DO、GO、KEGG富集分析WNK2参与的生物和代谢等过程，为WNK2在卵巢癌中扮演的角色提供了更有力的证据。

1 材料与方法 1.1 实验试剂和实验仪器

人卵巢癌细胞株SKOV3、CAOV3购于ATCC官网；细胞培养试剂购于衍庆生物技术有限公司；RNA提取试剂TRIzol、RT-PCR试剂盒购于TaKaRa公司；ROS检测试剂盒购于索莱宝公司。研究中的转染试剂是赛默飞品牌的lipo3000。BX53荧光显微镜购自日本奥林巴斯公司；Bio-Rad PCR仪CFX96购自美国伯乐公司。si-WNK2由广州锐博生物公司设计，序列为：CAAGGACAATGGAGCCATA。WNK2过表达质粒由上海吉凯生物技术有限公司构建。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞株及细胞培养

人卵巢癌细胞SKOV3和CAOV3培养于湿润、37 ℃、5% CO₂的细胞培养箱中，培养基用DMEM(Gibico，美国)和10%的胎牛血清配制。

1.2.2 si-RNA

将SKOV3和CAOV3细胞铺板于6孔板中，24 h后细胞密度保持70%左右进行转染。两个EP管中分别加入500 μL optimem和20 μmol/L siRNA (5 μL si-WNK2或si-NC)或5 μL的lipo3000。轻轻摇晃混匀后，静置5 min。将EP管中的si-RNA和转染试剂混合，常温下静置20 min后加入细胞培养孔中。3个培养孔作为实验组转染si-WNK2，另外3个孔作为对照组转染si-NC。

1.2.3 质粒转染

将SKOV3和CAOV3细胞铺板于6孔板中，24 h后细胞密度大约保持70%左右进行质粒转染。转染前将培养基换成无血清培养基。两个EP管中分别加入500 μL optimem和3 μg质粒或5 μL lipo 3 000，轻轻摇晃混匀后，静置5 min。将EP管中的质粒和转染试剂混合，常温下静置20 min后加入细胞培养孔中，转染6 h后细胞换液。

1.2.4 RT-qPCR

细胞转染48 h后，6孔板中的细胞用PBS清洗2次，按照试剂使用说明书提取RNA。吸取部分WNK2敲降实验组和NC对照组的RNA进行RT-qPCR。取1 μg的RNA进行反转录，合成cDNA后，用无酶水稀释5倍。取4 μL cDNA，5 μL SYBG和1 μL引物进行RNA检测，验证WNK2的敲降效果以及差异基因的转录水平变化。本研究中的所有引物由擎科生物公司合成，引物序列如表 1所示。

1.2.5 RNA-seq测序

前期研究发现WNK2在卵巢癌细胞SKOV3中表达最高，因此SKOV3细胞中的WNK2被成功敲降后，将实验组和对照组的RNA送至诺和致源生物科技有限公司进行RNA-seq测序分析。公司在测序之前，通过琼脂糖凝胶电泳，D(260)/D(280)及D(260)/D(230)的比值等检测，确保RNA样品符合质检。通过文库构建和上机测序，对基因表达进行定量分析，再用DESeq2筛选WNK2干扰前后表达水平显著差异的基因。差异基因筛选标准是|log2(Fold Change)|>0且padj < 0.05。

1.2.6 富集分析及验证

为了得到WNK2在卵巢癌中调控的代谢过程，cluster Profiler软件对差异基因集进行DO通路富集分析和GO功能富集分析。根据富集分析结果进行验证。

1.2.7 ROS检测

WNK2敲降或过表达48 h后，检测卵巢癌细胞中的ROS水平。使用无血清培养基将荧光探针稀释1 000倍，再将孔板中的培养基换成荧光探针稀释液，37 ℃孵育30 min。使用无血清培养基充分清洗未进入细胞的荧光探针，荧光显微镜下拍照。

1.3 统计学方法

本研究的统计学分析借助于软件SPSS 22.0完成，t检验用于检测两组样品均值，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 主成分分析及聚类热图

为了评估样本组间差异及组内重复情况，本研究对所有样本的基因表达值(fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，FPKM)进行主成分分析(principal component analysis，PCA)。结果所示，组间样本分散，组内样本聚在一起(图 1A)。所有进行聚类分析的基因阈值为padj＜0.05。图 1B为差异表达基因聚类热图，图中横坐标为样品名，纵坐标为差异基因FPKM归一化后的数值，颜色越红，表达量越高；越绿，表达量越低。结果显示组内样品聚在一起，样品重复性较好。

2.2 富集分析

2.2.1 DisGeNET及DO富集分析

为了探究WNK2调控的基因与哪些疾病关系密切，本研究进行了DisGeNET和DO富集分析。DisGeNET富集分析表明WNK2影响的差异基因与子宫内膜癌、宫体癌、头颈癌、肝癌、胆道癌等恶性肿瘤相关(图 2A)，DO富集分析显示差异基因与结缔组织、生殖细胞、泌尿系统、肌肉骨骼系统等恶性肿瘤相关(图 2B)。

2.2.2 GO功能富集

本研究进一步将差异基因进行GO功能富集分析，结果显示WNK2的敲降引起多个代谢过程相关基因表达下降，其中ROS代谢、线粒体蛋白复合物、凋亡等过程是差异基因富集最明显的GO功能，并且ROS代谢是差异基因富集最为显著的过程(图 3)。表 2是ROS代谢相关过程中的差异基因信息。

2.2.3 GO功能富集

WNK2正调控的差异基因富集于ROS代谢过程、凋亡信号通路、内质网应激中RNA聚合酶Ⅱ的转录调控、细胞黏附调控等生物过程。细胞组成上参与泛素连接酶复合物、线粒体膜蛋白复合物、细胞色素复合物等的形成。并参与生长因子结合、转录激活因子活性、中性氨基酸跨膜转运蛋白活性等分子功能(图 4)。

2.2.4 差异基因的PPI网络图

String数据库构建差异蛋白互作网络图，如图 5所示，差异基因间有着丰富的相互作用，其中与ROS相关的CDKN1、GADD45A、KLF4、CYR61、ROMO1蛋白位于蛋白网络中心位置。

2.2.5 RT-qPCR验证转录组测序结果

GO功能分析表明差异基因富集最明显的是ROS代谢过程，并且PPI网络图显示ROS相关蛋白均位于核心位置。本研究组用RT-qPCR验证ROS代谢过程的基因SESN2、CYR61、GADD45A、KLF4、CDKN1、VAV1、PDGFB、ROMO1、DDAH2、DDIT4是否被WNK2调控，结果显示(图 6)，WNK2敲降引起大部分ROS代谢过程的基因如SESN2、CYR61、GADD45A、KLF4、CDKN1、VAV1、DDIT4的下调，推测WNK2极可能影响卵巢癌细胞的ROS代谢过程。

2.2.6 WNK2对卵巢癌细胞ROS代谢的影响

为了检测WNK2是否影响卵巢癌细胞的ROS生成，本研究组在卵巢癌细胞系CAOV3和SKOV3中过表达和敲降WNK2后检测ROS的变化(图 7、8)。结果显示WNK2过表达后，卵巢癌细胞SKOV3、CAOV3中的ROS生成增多；WNK2敲降后，卵巢癌细胞SKOV3、CAOV3中的ROS生成减少。

3 讨论

卵巢癌是病死率最高的妇科恶性肿瘤，目前治疗方法难以提高其5年生存率，寻找有效诊治卵巢癌的分子靶点是迫在眉睫的任务。作为近20余年新发现的蛋白，WNK2能调控多种肿瘤的恶性进展。本课题组前期证明WNK2促进卵巢癌细胞的恶性行为^[14-15]，为进一步挖掘该激酶在卵巢癌中扮演的角色，本研究利用转录组测序探究WNK2在卵巢癌中调控的生物和代谢过程。

转录组测序检测包括编码RNA (mRNA)和非编码RNA (ncRNA)在内的所有转录本信息，能更全面地了解WNK2在卵巢癌中调控的生物和代谢过程。鉴于SKOV3细胞中WNK2表达最高^[14]，因此用si-RNA将卵巢癌细胞系SKOV3中的WNK2敲降后，提取总的RNA进行转录组测序，并分析WNK2在卵巢癌细胞中调控的所有转录信息。通过对差异基因进行DisGeNET、DO和GO富集，获取WNK2在卵巢癌细胞中调控的生物功能和代谢过程。分析表明差异基因与子宫内膜癌、宫体癌、头颈癌、肝癌、胆道癌以及结缔组织、生殖细胞、泌尿系统、肌肉骨骼系统等恶性肿瘤密切相关。GO功能富集分析表明差异蛋白富集于ROS代谢过程、凋亡信号通路和细胞黏附等生物过程。细胞组成上WNK2调控的蛋白参与泛素连接酶复合物、线粒体膜蛋白复合物以及细胞色素复合物等的形成。众所周知，ROS代谢过程是促发肿瘤，引起肿瘤进展的一个重要因素^[18]。凋亡和细胞黏附也与肿瘤细胞生长和侵袭两大恶性行为密不可分。泛素连接酶影响各种蛋白酶解，在细胞各种生命活动中起着至关重要的调控作用^[19]。线粒体作为供能细胞器，影响细胞分化、生长、凋亡、信号传递等过程^[20]。线粒体膜蛋白复合物作为线粒体的重要组成成分，细胞色素复合物作为呼吸链的一部分，均调控包括细胞凋亡，细胞周期和细胞增殖在内的多种生物学过程^[21]。

ROS代谢是差异基因富集最为显著的过程，ROS相关蛋白均位于PPI蛋白网络中心位置。WNK2敲降后，该生物过程绝大部分差异基因转录水平下降，RNA-seq测序结果可信。其中PDGFB和ROMO1转录水平未下降。我们推测可能是因为检测方法不同造成的差异。RNA-seq测序是通过检测基因全长定量，而qPCR检测则是通过引物扩增基因特定区域，因此定量基因表达时，难以避免产生差异。此外，两株经典的卵巢癌细胞系SKOV3和CAOV3验证实验表明WNK2促进卵巢癌细胞ROS产生。ROS通过激活癌基因影响肿瘤发生发展中几乎所有过程，它通过损伤DNA，促使肿瘤发生，还通过影响血管生成、上皮间充质转变、细胞黏附等过程，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭^[22]。卵巢癌是由输卵管上皮细胞长期暴露于ROS演变而来的，高水平的ROS是导致卵巢癌恶性进程的重要原因^[23-24]。CYR61、VAV1、PDGFB、DDIT4促进ROS的产生和积聚，SESN2则抑制ROS的产生。KLF4在不同情况下既可促进也可抑制ROS的产生^[25-32]，这代表WNK2促进卵巢癌细胞ROS是多种因素共同促进ROS产生和积聚增加的结果。研究发现，ROS能促进GADD45A、CDKN1的表达^[33-34]，那么GADD45A、CDKN1的变化是由WNK2还是由ROS的改变引起的呢？后续需设计实验研究具体原因。

综上所述，本研究通过RNA-seq测序和活性氧检测证明了WNK2促进卵巢癌细胞SKOV3和CAOV3中ROS形成，为WNK2在卵巢癌中扮演的重要角色提供了更多的证据，也为下一步WNK2发展为卵巢癌新的治疗靶点提供了思路。