2. 400010 重庆,重庆医科大学附属第二医院消化内科;
3. 400016 重庆,重庆医科大学附属第一医院消化内科
2. Deppartment of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400010;
3. Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400016, China
肝纤维化是肝脏在各种有害刺激的作用下诱发的损伤修复反应,其实质为细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肝内的大量沉积,常见于大多数慢性肝病的病理过程[1]。肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)是肝组织中ECM的主要来源,并且HSCs激活并转化为肌成纤维母细胞(myofibroblast,MFB)是肝纤维化发生的中心环节[2]。HSCs是肝组织中的一种间质细胞,约占肝脏细胞总数的10%。HSCs激活是指其从非增殖的静止状态向有增殖能力、可表达α-平滑肌蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、ECM和多种细胞因子的MFB转变的过程[3]。HSCs的活化受TGF-β、IL-17、IL-22、hedgehog配体和CXCL10等多种细胞因子的调控,这些细胞因子主要来源于肝脏中肝细胞(hepatocyte,HC)、巨噬细胞、kuffer细胞等[4]。核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand,RANKL)是一种肿瘤坏死因子,与TNFSF成员TRAIL、FasL和TNF-α具有同源性[5]。在骨骼系统中,RANKL能够与功能受体RANK和OPG结合,是破骨细胞形成的关键调节因子[6-8]。在免疫系统中,活化的T细胞所表达的RANKL与树突状细胞表面的RANK相结合后可调控T细胞及树突状细胞的功能[9]。
目前,关于RANKL的研究主要集中在骨骼稳态、免疫耐受和癌症等方面,其在肝脏中的作用并不明确。近期有研究报道,原发性胆管炎患者的肝脏门脉区可能通过聚集大量高表达RANKL的免疫细胞进而促进固有免疫的发生[10]。另外,有报道发现患有骨质疏松症并伴有非酒精性脂肪肝的患者在使用RANKL抗体治疗后肝炎症状得到了改善[11]。在小鼠肝脏中,RANKL主要表达于HC,实验证明受损的肝细胞内能够快速产生大量RANKL细胞因子,并维持较长时间[12]。但RANKL在肝纤维化中的作用尚不清楚。本研究主要通过对比对照组小鼠和肝纤维化造模组小鼠肝脏组织和原代HC、HSCs中RANKL表达变化,并进一步研究RANKL对HSCs活化的影响,从而探讨RANKL通过调节HSCs影响肝纤维化的形成。
1 材料与方法 1.1 实验对象6~8周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠26只,体质量18~22 g,由重庆医科大学动物中心提供,饲养于重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所动物中心独立通气饲养笼中。所有小鼠以标准饲料,自由摄食、饮水。动物饲养条件符合实验动物管理条例,所有动物相关操作遵循国家及重庆医科大学动物中心有关动物伦理规定及条例。
1.2 主要试剂与仪器SP免疫组化试剂盒购自于武汉博士德生物技术有限公司,Ⅳ型胶原酶、DNA酶Ⅰ、链蛋白酶、天狼星红染色试剂购自于北京索莱宝公司,optiprep分离液购自于苏格兰Axis-shied公司,总RNA提取试剂盒购自于无锡百泰克生物技术有限公司,cDNA反转录试剂盒、荧光定量PCR检测试剂盒购自于宝生物医药科技有限公司,全蛋白提试剂盒购自于南京凯基生物科技有限公司,抗α-SMA抗体、抗Collagen-Ⅰ抗体均购自美国abcam公司,抗GAPDH抗体购自于美国BBI life science公司,抗RANKL抗体、重组sRANKL细胞因子购自于美国Proteintech公司;HRP标记山羊抗兔IgG抗体、HRP标记兔抗鼠IgG抗体购自于美国Cell Signaling Technology公司,激光共聚焦显微镜购自于日本尼康公司,光学显微镜、显微照相系统购自于日本Olympus公司。
1.3 肝纤维化小鼠造模本研究采用经典的四氯化碳(carbon tetracholoride,CCL4)诱导小鼠肝纤维化的模型进行实验:将小鼠随机分为对照组和造模组(n=13)。按照5 μL/g向造模组小鼠腹腔注射体积分数10%的CCL4油剂溶液,2次/周;同时向对照组小鼠注射等体积的无菌油剂。
1.4 原代HC的分离和原代HSCs分离及培养 1.4.1 HC的分离6周后,小鼠麻醉后处死,用含有Ⅳ型胶原酶的DMEM溶液消化肝脏,获得含有肝脏各种类型细胞的细胞悬液,在4 ℃,50 g,5 min条件下离心后弃上清,剩余细胞团块为质量较大的肝细胞,用DMEM重悬后备用。
1.4.2 HSCs的分离及培养按照1.4.1获得肝脏细胞悬液,再通过70% optiprep分离液梯度离心(24 ℃,1 600×g,20 min)和选择性黏附后得到纯度较高的原代HSCs。离心后培养基重悬细胞团块备用。细胞培养:将分离得到的原代HSCs使用含有2%胎牛血清、2%的100 μg/mL的青-链霉素的高糖DMEM培养基,在37 ℃,5%CO2条件下培养。静息状态的肝星状细胞是圆形的富含脂质小滴、并且有网状纤维包绕的细胞;而随着肝星状细胞的活化,细胞的胞体逐渐增大,胞突伸展。细胞质中脂滴消失,VitA含量减少。胞质内粗面内织网、高尔基体发达,并具有旺盛的蛋白质合成能力[13]。研究提取原代HSCs培养后,通过对其细胞形态进行观察,将原代HSCs体外培养1天为静息状态HSCs,培养3天为部分活化状态HSCs,培养5天为完全活化状态HSCs[14-15]。
1.5 天狼星红染色及免疫组化技术(immunohis-tochemistry,IHC)染色天狼星红染色:小鼠处死后分离肝脏,取肝脏相同部位以4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片后脱蜡水化,接着进行天狼星红-苦味酸饱和溶液染色、脱水,最后中性树脂封片后观察拍照。免疫组化染色:组织固定切片等步骤同前,在脱蜡水化后,进行高温下抗原修复、过氧化氢去除酶;接着山羊血清封闭孵育后滴加目的蛋白抗体4 ℃过夜,复温后滴加辣根过氧化物酶标记的二抗孵育。最后滴加DAB显色,苏木精复染后中性树胶封片后拍照观察。
1.6 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)检测RNA试剂盒提取组织或细胞的总RNA,按照反转录试剂盒说明书合成cDNA,以cDNA为模板进行PCR反应。扩增条件为:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性20 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 min,循环33次,72 ℃检测信号。设置3个复孔,记录每孔的CT值,以3个复孔的平均值作为最终结果。本研究中以GAPDH为内参,采用2-△△Ct法进行分析。引物序列如下:mRANKL: 5'-CAGCATCGCTCTGTTCCTGTA-3'(上游),5'-CTGCGTTTTCATGGAGTCTCA-3'(下游);Collagen-Ⅰ:5'-TGGCGGTTATGACTTCAGCTT-3'(上游),5'-CTCAAGGTCACGGTCACGAAC-3'(下游);α-SMA:5'-GATCTCTATGCTAACAACGTCCTG-3'(上游),5'-CTTCGTCGTATTCCTGTTTGC-3'(下游);GAPDH:5'-AACACGGAAGGCCATGCCAG-3'(上游),5'-TGCA-TCCTGCACCACCAACT-3'(下游)。
1.7 Western blot按照蛋白提取试剂盒说明书提取组织或细胞的总蛋白,采用BCA法测定蛋白浓度后,经凝胶电泳、硝酸纤维素膜印迹后,用含5% 脱脂奶粉的TBST封闭1 h。而后将膜转移至含目的蛋白抗体的稀释液(稀释比例均为1 ∶1 000)中,于4 ℃孵育过夜。再用TBST洗涤3次后,将膜置于相应的辣根过氧化物酶标记二抗稀释液中常温孵育2 h,TBST洗涤3次。最后用ECL化学发光试剂显影。
1.8 免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测提取原代HSCs于装有共聚焦玻片的培养皿中,在37 ℃,5% CO2条件下加入含有不同浓度RANKL的DMEM培养基进行培养72 h,固定后使用0.5% Triton X-100透膜10 min、PBS洗2次,5%牛血清白蛋白溶液常温封闭30 min;而后将玻片转移至含目的蛋白抗体的稀释液(稀释比例为1 ∶1 000)中,于4 ℃避光孵育过夜,PBS洗3次后,加入荧光二抗(稀释比例为1 ∶10 000)室温避光孵育60 min,DAPI染核室温避光孵育15 min,最后抗荧光淬灭剂封片在倒置荧光显微镜观察并收集图像。
1.9 统计学方法采用GraphPad Prism 8软件对研究数据进行统计分析,组间差别采用两独立样本t检验,以P < 0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 RANKL在肝纤维化过程中的表达天狼星红油染色可看到造模组小鼠肝组织中胶原纤维明显增多,发生了明显的肝纤维化(图 1A)。IHC染色显示小鼠肝组织中RANKL表达明显增强,且染色区弥散分布于肝组织中(图 1B)。RT-qPCR结果显示造模组肝组织中RANKL mRNA表达水平增高(P < 0.05,图 1C)。Western Blot结果显示:较之对照组,造模组小鼠肝组织中RANKL蛋白表达也显著增高(图 1D、E)。这提示RANKL在肝纤维化的发生发展中发挥了作用。
2.2 在小鼠肝纤维化过程中,肝细胞分泌大量RANKL
细胞因子RANKL在细胞中合成后可分泌至细胞外发挥功能,本研究免疫组化结果也显示在肝组织中RANKL呈弥散性分布。为明确肝组织中分泌RANKL的细胞类型,研究提取对照组小鼠原代HC和HSCs,RT-qPCR检测细胞中RANKL的mRNA表达显示:对照组小鼠体内RANKL的mRNA在HC中的表达量远高于其在HSCs中的表达水平,Western blot结果表明RANKL的蛋白表达水平呈现出同样的趋势(图 2A、B)。可见对照组小鼠的肝组织中RANKL主要由HC分泌。
研究提取2组小鼠的原代HC,通过RT-qPCR检测其mRANKL表达,结果显示造模组小鼠原代HC中RANKL的mRNA表达水平明显高于对照组(图 2B),Western blot检测HC中RANKL的蛋白表达变化也与其mRNA变化趋势一致(图 2C),表明与对照组小鼠相比,肝纤维化小鼠原代HC分泌的RANKL明显增加。Western blot结果还显示:与对照组小鼠相比,RANKL在肝纤维化小鼠的原代HSCs中的表达有下降的趋势。证明在对照组小鼠体内,与HSCs相比,RANKL主要由HC分泌,而肝纤维化病变会导致HC中的RANKL进一步增高,与此相反的是肝纤维化过程中HSCs表达RANKL的水平有下降趋势。
2.3 RANKL抑制原代HSCs的活化研究采用外源性RANKL刺激原代HSCs来模拟小鼠体内肝纤维化过程中大量RANKL对HSCs的影响。经不同浓度的RANKL重组细胞因子刺激原代HSCs,检测培养72 h后的HSCs中RANKL、α-SMA和Collagen-Ⅰ的表达水平。RT-qPCR结果显示,与对照组相比,RANKL刺激后的HSCs中RANKL、α-SMA和Collagen-Ⅰ的mRNA表达水平均下降,且具有剂量依赖性(图 3A),随着加入RANKL浓度增高HSCs中活化相关蛋白表达水平逐渐降低。同样,研究采用免疫荧光检测RANKL刺激原代HSCs 72 h后细胞中RANKL、α-SMA和Collagen-Ⅰ蛋白的表达,随着RANKL浓度增加,蛋白的荧光强度均显示出明显下降(图 3B),说明RANKL以剂量依赖的方式下调原代HSCs中RANKL、α-SMA和Collagen-ⅠmRNA和蛋白的表达水平;提示RANKL可抑制HSCs的活化。
3 讨论
肝纤维化是一个由慢性肝损伤引起的复杂的纤维化和炎症过程,代表了肝硬化进展的早期阶段。HSCs主要定位于肝窦内皮细胞和HC之间的窦周间隙,是启动纤维化过程的肌成纤维细胞和门脉成纤维细胞的主要来源。活化的HSCs可以分泌细胞外基质、金属蛋白酶组织抑制剂和基质金属蛋白酶等物质导致肝脏结构重塑[16]。目前认为肝移植是治疗肝硬化的理想方法,但这并不适用于绝大多数患者。因此,抗肝纤维化治疗仍需进一步研究。
近年来,越来越多的文献表明RANKL与肝纤维化之间存在着紧密联系。在我们前期研究中发现在非酒精性脂肪肝发生过程中,肝脏组织中RANKL的mRNA和蛋白表达增加,且与其疾病发展程度正相关[13],由此我们推测RANKL在肝纤维化过程中可能促进HSCs的活化。有文献报道,在小鼠肝脏缺血前或再灌注时给予RANKL治疗,其HC中核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)的活性明显增加[12],而NF-κB能通过TLR信号传导途径参与HSCs的激活而促进肝纤维化[17-18],同时也能募集肝脏kuffer细胞的聚集并释放炎症因子活化HSCs[13]。由此我们猜想RANKL可能通过参与HSCs活化影响肝纤维化形成。通过实验我们发现,用CCL4诱导的肝纤维化小鼠的肝脏组织中RANKL mRNA和蛋白表达水平均明显增加,这验证了我们的猜测RANKL参与了在肝纤维化的发生发展进程。有文献表明在对照组小鼠体内RANKL主要来源于肝组织中的HC [12],与此同时,我们还发现RANKL在纤维化模型小鼠肝脏的原代HC中表达会进一步增高,但在原代HSCs中却呈现下降趋势,二者变化的差异促使我们进一步探究HC大量表达的RANKL对于HSCs的活化是否有影响。因此,我们在体外刺激活化原代HSCs时加入大量的外源性重组RANKL,由此来模拟并研究体内肝纤维化进程中RANKL对HSCs的影响。我们发现不同浓度的体外RANKL重组细胞因子刺激均能够抑制HSCs的活化,并且随着体外刺激RANKL重组细胞因子浓度的增高,原代HSCs中RANKL的mRNA和蛋白表达水平逐渐下降,具有一定的浓度依赖性,这表明高浓度的RANKL抑制了HSCs中RANKL的表达。同时我们还发现HSCs活化的标志物α-SMA和Collagen-Ⅰ的mRNA和蛋白表达水平与RANKL具有相似的变化趋势,这表明大量的RANKL直接作用于HSCs将导致HSCs的活化受到阻碍,同时HSCs细胞本身RANKL的表达亦出现下降。
综上所述,在肝纤维化进程中RANKL在肝脏组织中表达增加且与纤维化程度正相关,而RANKL在HC中表达增高却在HSCs中表达下降,体外实验中外源性RANKL不仅能够抑制HSCs中RANKL的表达,还能在一定程度上抑制HSCs的活化进程。由此,我们认为在肝纤维化进程中,受损的HC既能够高表达TGF-β、IL-1A、hedgehog配体和CXCL10等这些促进肝纤维化进程的细胞因子[4],同时也能分泌如RANKL能够直接抑制肝星状细胞活化的细胞因子,这为我们进一步了解肝纤维化机制和肝纤维化的治疗提供了新的思路。
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