2. 710077 西安，西安医学院第一附属医院妇产科
2. Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital of Xi'an Medical University, Xi'an, Shaanxi Province, 710077, China
胰腺癌(pancreatic cancer)发病率逐年增加，位列所有癌症致死原因第5位，是一种恶性程度极高的消化系统肿瘤。由于早期无明显症状、疾病进展快及化疗有效率低，患者预后极差，总体5年生存率仅有8%，又将其称为“癌中之王”[1]。胰腺癌治疗目前主要采取手术为主，并辅助放、化疗的综合治疗手段，但90%的胰腺癌患者经指南推荐的治疗后效果欠佳[2]。因此，深入阐明胰腺癌的发生机制结合分子靶向干预和放化疗，是提高胰腺癌疗效的重要手段[3]。Smad3是重要的细胞内分子，负责将细胞质膜受体信号传至细胞核[4-5]。Smad3作为重要的转录因子，是转移生长因子β(transforming growth factor β, TGF-β)下游的重要靶点。在细胞增殖[6]、损伤修复[7]、纤维化[8]、癌症发展等方面发挥着重要作用[9-10]。在肝癌后期Smad3通过诱导上皮-间质转化促进肿瘤转移[11]，然而Smad3在胰腺癌发生、发展中的作用目前仍不清楚。
分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)可将细胞外信息传递至细胞核中，在生理及病理过程中发挥重要的作用。其中p38是重要的应激激酶，能对外界刺激迅速做出反应[12]。p38在体内有α、β、γ和δ 4种亚型，且胰腺癌细胞均表达p38的4种亚型。研究发现降低胰腺癌细胞中p38 α和p38 β的表达能够抑制胰腺癌细胞的体外生长，同时发现p38 α能促进胰腺癌的迁移，而p38 β对胰腺癌的迁移无明显调控作用，由此可见p38/MAPK在胰腺癌中发挥亚型特异性功能[13]。此外，胰腺癌细胞分泌外泌体被T淋巴细胞摄取后激活p38/MAPK信号通路，进而诱导内质网应激介导细胞凋亡，促进胰腺癌发生、发展[14]。
自噬在生物体高度保守是维持机体稳态的重要机制[15-16]，依赖溶酶体对细胞组分的降解以维持逆境条件下机体的代谢平衡。自噬异常与胰腺癌等众多肿瘤的发生、发展密切相关[17]。早期研究表明，利用遗传和药理抑制自噬会导致活性氧(reactive oxygen species, ROS)产生，增加DNA损伤和代谢功能障碍，最终抑制胰腺癌的发展[18]。此外，自噬还可以通过降解MHC-I促进胰腺癌的免疫逃避，表明自噬增加有助于胰腺癌的进展[19]。
p38/MAPK信号通路不仅对自噬具有促进和抑制的双重性调控[20]，而且也是细胞凋亡的主要调控通路之一。胰腺癌细胞对细胞凋亡有抵抗力，从而促进其侵袭性和对常规治疗方式的抵抗力[21]。因此，靶向细胞凋亡途径是胰腺癌治疗的新思路。在生物体内细胞自噬与凋亡过程存在十分复杂的相互作用关系，过度自噬会诱导细胞凋亡。本研究通过干预Smad3的表达初步探讨Smad3对胰腺癌细胞Panc-1、BxPC-3自噬和凋亡的影响机制，进而初步验证Smad3表达水平在人胰腺癌诊断和进展中的价值；同时探究Smad3对胰腺癌细胞自噬的调控能力，以期为胰腺癌的治疗提供新的靶点和理论依据。
1 材料与方法 1.1 细胞、标本及试剂人的胰腺癌细胞系Panc-1、AsPC-1、BxPC-3购自美国ATCC细胞库(American Type Culture Collection)；胰腺正常导管上皮细胞HPDE购自武汉普诺赛公司。对照和胰腺癌患者组织标本来自2015-2020年西安医学院第一附属医院和咸阳人民医院。标本获取经捐赠者或亲属的书面知情同意，研究获得西安医学院第一附属医院伦理委员会的批准(XYL2022122)。主要试剂：胎牛血清、DMEM细胞培养基、胰蛋白酶购自HyClone公司；LipofectamineTM2000购自美国英杰生命技术有限公司；总蛋白提取试剂盒、PI-Annexin-V试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；抗体Smad3、p-Smad3购自爱博泰克生物有限公司；GAPDH购自康成生物技术有限公司；p-p38、p38、LC3、p62购自美国Cell Signaling Technology公司；SB203580购自北京索莱宝科技有限公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗购自美国Sigma公司；DAB检测试剂盒购自中杉金桥公司。对照组(Sh-Scramble)病毒及Smad3敲减序列(Sh-Smad3、CRISPR/Cas9-Smad3)由擎科生物公司合成，见表 1。
| 名称 | 序列(5′→3′) |
| ShScramble | 正义链：CCGGGAACTCGAGTTCACATGGTTCCTCGAGGAACCATGTGAACTCGAGTTCTTTTTG 反义链：AATTCAAAAAGAACTCGAGTTCACATGGTTCCTCGAGGAACCATGTGAACTCGAGTTC |
| shSmad3-1 | 正义链：CCGGGAGCCTGGTCAAGAAACTCAACTCGAGTTGAGTTTCTTGACCAGGCTCTTTTTG 反义链：AATTCAAAAAGAGCCTGGTCAAGAAACTCAACTCGAGTTGAGTTTCTTGACCAGGCTC |
| shSmad3-2 | 正义链：CCGGTGAGCAGAACAGGTAGTATTACTCGAGTAATACTACCTGTTCTGCTCATTTTTG 反义链：AATTCAAAAATGAGCAGAACAGGTAGTATTACTCGAGTAATACTACCTGTTCTGCTCA |
| gRNA-1 | 正义链：CACCGGCTGTAGTCGTCCAGTGGG 反义链：AAACCCCACTGGACGACTACAGCC |
| gRNA-2 | 正义链：CACCGCGCTCCGAATTGGAGGGGT 反义链：AAACACCCCTCCAATTCGGAGCGC |
1.2 生物信息学分析
利用GEPIA2数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/) 对Smad3在胰腺正常组织(n=171)及癌组织(n=179) 中的表达差异和存活相关性进行统计学分析。
1.3 免疫组化将临床标本组织切片放置60 ℃烘箱烘片1 h，将切片放入环保透明剂中脱蜡2次，每次20 min。之后依次放入100%、95%、70%、50%乙醇中各水化5 min，去离子水中浸泡5~10 min后置于10 mmol/L pH 6.0柠檬酸- 柠檬酸钠缓冲溶液中抗原修复3.5 min，室温自然冷却。PBS中浸泡5~10 min，3% H2O2室温放置10 min，0.1% TX-100室温孵育10 min，PBS洗2~3次，每次5 min，3% BSA室温封闭1 h。一抗Smad3(1 ∶500)溶于1% BSA，4 ℃过夜。1×PBS洗4次，每次5 min，二抗室温孵育1 h。PBS洗4次，每次5 min，DAB显色后，苏木精复染3~5 min后自来水充分冲洗显色。1% HCl(75% 乙醇中)水化5 s，自来水冲洗3~5 min，95%、100%乙醇各脱水5 min，最后用中性树胶封片保存。
1.4 细胞培养及分组胰腺癌细胞株Panc-1、BxPC-3生长于37 ℃、5% CO2以及饱和湿度的恒温培养箱中。细胞培养使用含10% FBS、1%双抗(链霉素、青霉素)的完全培养基，2 d进行一次传代。敲减实验分为对照组(Scr)和Smad3敲减组(ShSmad3-1、ShSmad3-2组：细胞分别转染ShSmad3-1、ShSmad3-2慢病毒)；敲除实验分为空白对照组(WT)和Smad3敲除组(Smad3 KO-1、Smad3 KO-2组：Panc-1细胞分别转入CRISPR/Cas9-Smad3质粒，经嘌呤霉素筛选后的单克隆细胞系1#、2#)。回复实验在敲减实验3组基础上再加入25、50 μmol/L羟氯喹(HCQ)；过表达实验在敲减实验3组基础上再加入外源过表达Smad3(pLVX- Smad3)；抑制实验在敲减实验3组基础上再加入p38抑制剂SB203580 20 μmol/L(SB203580)。处理细胞48 h后，收集各组细胞进行相关检测。
1.5 病毒包装当293T细胞生长至60%~70%时进行转染。将PMD2.G、PSPAX2、pLKO.1 sh-Smad3按1 ∶1 ∶1各8 μg及60 μL转染试剂PEI加入750 μL DMEM培养基(不含血清、双抗)，混合均匀，室温放置20 min后加入293T细胞转染4~6 h，换新鲜完全培养基，继续培养48 h可收集培养基上清，1 500×g离心10 min，取上清，再用0.45 μm滤膜过滤，所得液体即为包装后病毒。
1.6 慢病毒感染BxPC-3细胞在6孔板中长到融合度为50%~60%时，按培养基与病毒液体积比1 ∶1进行加液，同时加入1 μL (2 000×) polybrene混匀。2 d后，加入1.5 μg/mL嘌呤霉素筛选2 d，收样进行检测。
1.7 CRISPR/Cas9、ShSmad3质粒构建及CRISPR/Cas9-Smad3敲除细胞的筛选将合成的gRNA及ShRNA正义链与反义链进行退火，退火产物与经过双酶切的pLKO.1 (EcoRⅠ、AgeⅠ)、PX459(BbsⅠ)载体进行连接，小提质粒，并经测序验证。
将构建好的针对Smad3基因的CRISPR/Cas9敲除质粒纯化后转入胰腺癌细胞(Panc-1)中。经过稳定筛选挑单克隆，并通过提取基因组DNA和Western blot确定其表达情况。经过鉴定筛选2个独立的细胞系用于后续实验。基因组PCR上游引物序列：5′-GCCTTC-AATATGAAGAAGGAC-3′，下游引物序列：5′-CATTCG-GGTCAACTGGTA-3′。
1.8 细胞计数将生长良好的105个细胞铺在6孔板上，分别在生长0、3、5 d用血球计数板进行细胞计数，并用结晶紫进行染色。
1.9 蛋白提取及Western blot检测收好的细胞加入含有蛋白酶抑制剂的裂解溶液Lysis Buffer (DTT、mG132、Cocktail、DTT、PhosSTOP)置于冰上，每隔5 min剧烈涡旋1次，共裂解20 min后，12 500×g、4 ℃离心5 min，取上清进行BCA蛋白定量，加入对应体积的蛋白上样缓冲液(5×Loading buffer)，95 ℃加热5 min后进行蛋白电泳。10% SDS-PAGE电泳分离，转移至PVDF膜(使用前用甲醇浸泡激活30 s)，用含5%脱脂奶粉的PBST摇床封闭1 h。加入一抗p-p38、p38、LC3、p62(1 ∶1 000)、Smad、p-Smad3(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶10 000)，4 ℃孵育过夜，PBST洗膜4次，每次5 min，室温孵育二抗1 h，PBST洗膜4次，每次5 min，用ECL法发光后胶片曝光。
1.10 PI-Annexin V染色BxPC3、Panc-1胰腺癌细胞用PBS洗涤2次，用不含EDTA的胰酶进行完全消化，1 000×g离心5 min，弃上清收集细胞，并用PBS轻轻重悬细胞计数，然后再1 000×g离心5 min，加入195 μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC轻轻混匀，加入10 μL碘化丙啶染色液(PI)，然后在室温下避光孵育15 min，最后通过流式细胞仪检测分析。
1.11 统计学分析数据以x±s表示，使用Microsoft Excel 2003(Microsoft Corp)与GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software Inc.)软件进行数据采集、记录、运算与分析。两组间差异比较采用两独立样本t检验，多组间差异比较采用方差分析。P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 Smad3蛋白表达与胰腺癌的关系GEPIA2数据库分析结果显示，与正常胰腺组织相比，Smad3在胰腺癌组织中高表达(P < 0.05，图 1A)，同时在胰腺癌不同分期Smad3的表达差异有统计学意义(P=0.003 22，图 1B)。进一步将胰腺癌患者分为Smad3高表达组(n=45)和Smad3低表达组(n=45)，通过生存分析发现Smad3的表达与胰腺癌患者的生存率呈负相关(P=0.006 1，图 1C)。利用临床病理标本进行免疫组化染色，发现Smad3在胰腺癌组织中高表达(图 1D)。
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| A：GEPIA2数据库分析胰腺癌组织与正常组织中Smad3的表达 a：P < 0.05；B：GEPIA2数据库分析胰腺癌不同分期中Smad3的表达差异；C：Smad3表达与患者生存的相关性；D：免疫组化检测Smad3在胰腺病理切片中的表达 图 1 Smad3在正常组织及胰腺癌组织中的表达 |
2.2 胰腺癌细胞系中Smad3的表达
收集胰腺正常导管上皮细胞HPDE、胰腺癌细胞BxPC-3、AsPC-1、Panc-1。通过Western blot检测Smad3的表达情况。与胰腺正常导管上皮细胞相比，Smad3在胰腺癌细胞BxPC-3、Panc-1中表达较高(图 2)。因此，后续实验选择这2个细胞系进行。
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| A：Western blot检测Smad3的表达；B：半定量分析 a：P < 0.05，与HPDE比较；b：P < 0.05，与AsPC-1比较 图 2 Smad3在胰腺正常导管上皮细胞、胰腺癌细胞中的表达 |
2.3 胰腺癌细胞系BxPC-3、Panc-1中敲除(敲减)Smad3
分别利用ShRNA以及CRISPR/Cas9两种不同的体系干预Smad3的表达。BxPC-3细胞中转入ShSmad3-1、ShSmad3-2慢病毒72 h后，qPCR检测结果显示Smad3 mRNA水平下调明显(P < 0.05，图 3A)，同时利用Western blot从蛋白水平进行验证，发现2个ShRNA的敲减效果较好(图 3B)。进一步在Panc-1细胞中转入CRISPR/Cas9-Smad3质粒经嘌呤霉素筛选后挑取单克隆。利用Western blot和测序进行验证，发现单克隆细胞系1#、2#敲除较好(图 3C、D)，可以用于后续实验。
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Scr：对照组；ShSmad3-1、ShSmad3-2：Smad3敲减组；a：P < 0.05，与对照组(Scr)比较 A：qPCR检测转入ShSmad3后胰腺癌细胞Smad3 mRNA变化；B：Western blot检测Smad3的敲减效率 WT：空白对照组；Smad3-KO：Smad3敲除组；M：标准 C：Western blot检测Smad3敲除的单克隆细胞系；D：Smad3敲除单克隆细胞系基因组PCR产物 图 3 利用ShRNA、CRISPR/Cas9体系敲减及敲除Smad3的表达 |
2.4 在胰腺癌细胞中敲减Smad3影响细胞凋亡
利用构建好的Smad3敲减BxPC-3稳转细胞系铺板(105个细胞)绘制细胞的生长曲线(图 4A)，并进行结晶紫染色(图 4B)。敲减Smad3后，胰腺癌细胞BxPC-3、Panc-1的数目均显著减少。同时利用Smad3敲减的Panc-1、BxPC-3细胞进行PI-Annexin V标记并进行流式分析，发现敲减Smad3后凋亡细胞显著增加(P < 0.05，图 4C)，提示Smad3对胰腺癌的发生发展至关重要。
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| A：敲减Smad3后各组胰腺癌细胞计数分析 a：P < 0.05，与对照组(Scr)比较；B：结晶紫染色观察敲减Smad3后各组胰腺癌细胞生长情况；C：流式细胞仪检测敲减Smad3后胰腺癌细胞的凋亡情况 图 4 敲减Smad3后诱导胰腺癌细胞凋亡增加 |
2.5 敲除(敲减)Smad3后自噬蛋白LC3、p62蛋白水平降低
在敲除、敲减Smad3的Panc-1细胞中，LC3、p62均显著下调(图 5A、B)。同时在BxPC-3细胞中利用shRNA敲减Smad3后加入25、50 μmol/L羟氯喹(HCQ)，利用Western blot检测发现LC3、p62蛋白水平能回复(图 5C)。进一步说明降低Smad3的表达影响胰腺癌细胞的自噬过程。
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WT：空白对照组；Scr：对照组；Smad3 KO-1、Smad3 KO-2：Smad3敲除组；ShSmad3-1、ShSmad3-2：Smad3敲减组；a：P < 0.01，与对照组比较；b：P < 0.01，与Smad3敲减组比较 A：Western blot检测Smad3敲除胰腺癌细胞LC3、p62蛋白水平变化；B：Western blot检测Smad3敲减胰腺癌细胞LC3、p62蛋白水平变化；C：Western blot检测Smad3敲减胰腺癌细胞以及加HCQ后LC3、p62蛋白变化 图 5 干预Smad3表达后自噬蛋白LC3、p62蛋白水平降低 |
2.6 敲除(敲减)Smad3后通过p38/MAPK通路影响细胞凋亡
Western blot检测结果显示，与对照组相比，在敲减Smad3的BxPC-3细胞中p-p38显著上调(P < 0.05，图 6A)，同时在敲除Smad3的胰腺癌细胞中p-p38蛋白水平也升高(P < 0.05，图 6B)。为了进一步证明Smad3通过p38通路调控自噬诱导细胞凋亡进行了回补实验。外源过表达Smad3后发现LC3、p62蛋白水平能够回复(P < 0.01，图 6C)，同时利用p38抑制剂SB203580处理胰腺癌细胞同样发现LC3、p62蛋白水平增加(P < 0.01，图 6D)。提示下调Smad3后胰腺癌细胞生物学过程的改变，很有可能是通过p38/MAPK信号通路。
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a：P < 0.05，与对照组(Scr)比较；b：P < 0.01，与Smad3敲减组比较 A：Western blot检测胰腺癌细胞敲减Smad3后p-p38、p38的蛋白变化；B：Western blot检测胰腺癌细胞敲除Smad3后p-p38、p38的蛋白变化；C：Western blot检测外源过表达Smad3后检测p-p38、LC3、p62的蛋白变化 a：P < 0.05，与对照组(Scr)比较；b：P < 0.01，与Smad3敲减组比较 D：流式细胞仪检测外源过表达Smad3后胰腺癌细胞凋亡情况变化；E：Western blot检测p38抑制剂SB203580及ShSmad3慢病毒同时处理胰腺癌细胞48 h后p-p38、LC3、p62的蛋白变化 图 6 Smad3通过MAPK-p38信号通路影响细胞凋亡与自噬 |
3 讨论
胰腺癌是一种恶性消化道肿瘤。由于早期没有特别有效的诊断标志物，一经发现就已进入中晚期，5年存活率极低。因此，相关的靶向治疗研究亟待开展[22-23]。本研究发现Smad3在胰腺癌中高表达且与患者的生存呈负相关，同时敲减Smad3后导致胰腺癌细胞凋亡增加。结果提示Smad3对胰腺癌发生、发展有重要的调控作用。研究表明植物类黄酮化合物影响TGF-β1/Smad3和TGF-β1/p38 MAPK信号通路调控自噬，可以减轻肝脏纤维化[24-25]，同时发现Smad3能促进自噬失调调控细胞溶酶体缺失[26]，然而Smad3在胰腺癌中调控自噬与凋亡的机制尚不明确。本研究发现干扰Smad3通过激活p38/MAPK信号通路诱导细胞过度自噬，从而导致其凋亡增加。
自噬是维持细胞稳态的关键机制，也是一种高度保守的生物学过程。通过对自身蛋白质和细胞器的降解使细胞能够在极端环境下存活[27]。因此，自噬调控受阻将会导致许多疾病的发生[28]。随着研究的深入，发现自噬蛋白Beclin 1基因在小鼠和人体中具有肿瘤抑制作用，进一步说明自噬具有肿瘤抑制功能[29]。由于自噬在肿瘤的形成过程中具有双重作用，因此抑制或诱导自噬途径对肿瘤的预防和治疗具有很大优势。本研究发现Smad3能够增加自噬相关蛋白LC3、p62的表达，具有自噬抑制作用，进而促进胰腺癌的发生、发展。因此，针对Smad3的靶向研究将为胰腺癌治疗提供新的思路。
细胞自噬与凋亡存在复杂的作用关系。自噬是细胞凋亡所需的过程，然而过度自噬能够诱导细胞凋亡[30]。p38/MAPK是调控细胞自噬及凋亡过程的重要信号通路。本研究发现干预Smad3的表达，p-p38蛋白水平显著增加，而自噬蛋白LC3、p62下调，同时胰腺癌细胞凋亡也显著增加。结果提示靶向干预Smad3后，导致胰腺癌细胞过度自噬，进而诱导胰腺癌细胞凋亡。用p38抑制剂SB203580处理Smad3敲减胰腺癌细胞相关蛋白的变化又能回复，进一步提示可能通过p38/MAPK信号通路进行调节。
综上所述，本研究探讨了Smad3表达水平与胰腺癌发生、发展以及患者生存的关系，结果表明Smad3高表达与胰腺癌的发生、发展正相关，与患者生存负相关。此外，Smad3在胰腺癌细胞系中高表达，敲减(敲除)Smad3可明显促进胰腺癌细胞凋亡，且能上调p-p38蛋白的表达，同时下调LC3、p62的表达。提示Smad3在胰腺癌发生、发展中发挥重要的促进作用，为临床治疗胰腺癌提供新的靶点。Smad3可作为胰腺癌一个潜在的临床诊疗的生物标记物。
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