2. 100020 北京，北京协和医学院研究生院
2. Graduate School of Peking Union Medical College, Beijing, 100020, China
神经管畸形(neural tube defect，NTDs)是由于胚胎发育早期神经管闭合异常造成的一类先天性畸形，脊柱裂和无脑畸形是最常见的NTDs表型。导致NTDs发生的危险因素已有大量文献报道，如叶酸缺乏、药物等，其中叶酸缺乏是导致NTDs最重要的因素，可引起多种表观遗传修饰的改变，最终导致NTDs的发生[1-2]。
据统计，非编码RNA (non-coding RNA，ncRNA)占人类转录组的比例约为98%，而编码RNA所占比例不到2%[3]。其中长链非编码RNA (long noncoding RNA，lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，占人类非编码转录组的80%，大部分不编码蛋白质，但后续研究中逐步发现lncRNA在转录、转录后、翻译或翻译后阶段以各种机制与其他生物分子相互作用来影响基因活性[4]。异常的lncRNA表达可引起严重损害脑功能的疾病发生，如胶质瘤、精神分裂症、阿尔茨海默病、发育迟缓和自闭症。在胚胎发育、中枢神经系统发育和神经干细胞分化过程中，许多lncRNA存在显著动态变化的表达模式，参与调控发育、分化及细胞重编等过程，发育动态的lncRNA表现出发散型、反义转录本等的过度表达，使得与蛋白编码的基因更相似[5-6]。另有研究发现，lncRNA基因位点通常位于发育转录因子附近，lncRNA产物可作为转录因子调控远端基因，此外，包含DNA调控元件的lncRNA在某些情况下作用于邻近基因[7]。因此，lncRNA的发育动态表达反映了更复杂的转录调控。
lncRNA、circRNA等多种类型RNA可以通过miRNA应答元件(microRNA response elements，MREs)，吸附microRNA (miRNA)后产生“竞争”关系，间接参与调控mRNA的表达水平[8]。lncRNA与miRNA呈负调控关系，且miRNA和ceRNA呈现相互调控作用[9]。研究发现，lncRNA相关ceRNA在发育过程中起重要作用，尤其是在神经系统[10-15]。这些研究进一步说明了ceRNA在发育过程中参与了重要调控。在NTDs中，已有关于miRNA表达谱变化及miRNA对mRNA负调控的报道，但lncRNA通过ceRNA机制对低叶酸相关NTDs的调控作用未见报道[16]。因此，本研究通过构建NTDs小鼠模型，对lncRNA相关ceRNA网络进行深入探讨，筛选差异的lncRNA及靶向基因，为今后研究叶酸缺乏相关的NTDs发生机制及疾病的预防诊疗提供依据。
1 材料与方法 1.1 材料研究采用SPF级、7~8周龄的健康雌性C57BL/6J小鼠(体质量18~22 g)40只及健康雄性C57BL/6J小鼠(体质量20~22 g)20只，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。低叶酸饲料及正常饲料购自北京科澳协力饲料有限公司，MTX购自Sigma公司，生理盐水购自中国大冢制药有限公司，RNeasy® mini kit试剂盒购自QIAGEN公司，小鼠胚胎干细胞(Mouse embryonic stem cells，mESCs) Sv/129细胞系来自首都儿科研究所细胞库，磷酸盐缓冲溶液(PBS)、Dulbecco改良的Eagle培养基、胎牛血清购自Gibco公司，非必需氨基酸、谷氨酸、β-巯基乙醇、明胶购自Invitrogen公司，小鼠白血病抑制因子购自Millipore公司，T25细胞培养瓶购自Corning公司，琼脂糖购自Biosharp公司，TAE溶液购自北京索莱宝科技有限公司，BlasTaq 2X Qpcr MasterMix及5× All-In-One MasterMix购自ABM公司。
1.2 方法 1.2.1 动物分组选取上述40只雌性小鼠分为正常饲喂组与低叶酸联合MTX诱导NTDs组，20只/组，5只/笼，另选取20只雄性小鼠，5只/笼。实验饲养期间小鼠均处于SPF级环境中，温湿度、饲料及饮用水均符合国家标准饲养条件，全过程保证各组小鼠自由饮食。
1.2.2 NTDs胎鼠模型制备正常饲喂组的雌性小鼠及全部雄性小鼠均提供正常繁殖饲料喂养，低叶酸联合MTX诱导NTDs组小鼠采用特制低叶酸饲料，两组饮用水一致，无特殊处理，保证设施环境维持12 h光/暗循环。两组小鼠自由饮食4周后，选取成熟C57BL/6J雄鼠个体，按雌雄比例2 ∶1交配过夜，于次日8:00观察到阴道栓，指定为受孕0.5 d；受孕7.5 d时，以1.5 mg/kg用量对低叶酸联合MTX诱导NTDs组雌性小鼠腹腔注射MTX，正常饲喂组雌性小鼠使用等剂量生理盐水进行腹腔注射；至受孕13.5 d，对妊娠小鼠实施颈椎脱臼处死，取出胎鼠，其中正常饲喂组选取发育正常胎鼠、低叶酸联合MTX诱导NTDs组选取NTDs表型明显的胎鼠置预冷的PBS中取出胎脑，于液氮中保存。详细参考课题组前期NTDs胎鼠模型建立方法[17]。
1.2.3 叶酸缺乏的细胞模型制备制备叶酸缺乏组细胞的培养基：在Dulbecco改良的Eagle培养基中添加0.1 mmol/L β-巯基乙醇、0.1 mmol/L非必需氨基酸、0.1 mmol/L谷氨酸、15% 胎牛血清、1 000 U/mL小鼠白血病抑制因子。叶酸正常组细胞的培养基需额外添加浓度为4 mg/L叶酸。
将mESCs复苏后放入提前涂有浓度为0.2%明胶的T25细胞培养瓶，放置在37 ℃、5% CO2的加湿培养箱中，每2~3天传代1次，传至6代后收集细胞并提取RNA。具体实验方法可参考课题组既往报道[2]。
1.2.4 提取总RNA按照RNeasy® mini kit试剂盒说明书操作步骤提取胎鼠脑的总RNA，测定其浓度，并用Agilent2200检测质量，检测合格后，可进行后续文库制备与测序工作。
1.2.5 cDNA文库制备及RNA测序使用NEBNext® UltraTM Directional RNA Library Prep Kit for Illumina进行cDNA文库的制备，并用Agilent2200进行定量。标记的cDNA文库以相等的比例汇聚在一起，并在Illumina HiSeqXTen中进行测序，使用Fast-QC软件对原始测序数据的质量进行GC含量、质量值的位置分布等方面的整体评估，去除接头及低质量序列，得到clean reads文件。
1.2.6 筛选差异基因并构建ceRNA调控网络利用软件hisat2将clean reads与小鼠参考基因组进行比对，进一步统计得到染色体上分布及基因组结构分析情况，miRNA部分通过与小鼠的miRNA数据库进行比对得到miRNA表达情况。
用EBSeq对mRNA、miRNA、lncRNA进行差异基因筛选，筛选条件为：Log2FC>0.585或 < -0.585，FDR < 0.05。miranda及RNAhybrid软件对差异显著的miRNA分别进行差异靶基因lncRNA和差异靶基因mRNA的预测(miranda筛选条件：Score≥140且Energy < -15，RNAhybrid筛选条件：Energy < -20)；取两种算法的交集作为靶基因预测的最终结果；挑选出miRNA和lncRNA、miRNA和mRNA呈负相关的关系条目，令lncRNA、miRNA和mRNA三者的调控趋势分别为：up-down-up或down-up-down，构建lncRNA-miRNA-mRNA形式的ceRNA调控网络。
1.3 qPCR验证目标基因的相对表达量选择与神经发育关系密切的lncRNA Xist及预测靶基因Sema4f、Padi2进行qPCR验证。提取的胎鼠脑组织及细胞总RNA样本经浓度为1%的琼脂糖凝胶在TAE溶液中电泳，检测RNA质量合格后，用5× All-In-One MasterMix试剂盒反转录为cDNA，再以cDNA为模板进行qPCR反应，将小鼠管家基因GAPDH作为内参。引物序列如下所示：lncRNA Xist上游：5′-AGCCAGTTACGCCAAGAATTAGGAC-3′，下游：5′-CCCGCAAATGCTACCACAAATCAAG-3′；Sema4f上游：5′-AGCTAAAACATGACTGCAACAG-3′，下游：5′-TCTGAGATAGGCTGTATCCGTA-3′；Padi2上游：5′-AGGCAGGAGGATGACCAAGGTG-3′，下游：5′-AGTCAGCCAGTCGGAGTAGAGTTC-3′。实验独立重复3次，采用2 - ΔΔCt法计算相对表达量。
1.4 统计学方法应用GraphPad prism 8软件进行统计分析，计量资料进行方差齐性检验，数据用x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，P < 0.05认为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 NTDs胎鼠模型建造情况通过对适龄母鼠喂养低叶酸饲料，并在孕7.5 d时对母鼠进行腹腔注射MTX，可成功诱导出具有明显NTDs表型的胎鼠。通过体式显微镜观察，可见：正常饲喂组胎鼠外观上较为饱满圆润，各脑室发育良好，神经管已完全闭合；低叶酸联合MTX诱导NTDs组胎鼠整体体积小于对照组胎鼠，并表现出脊柱裂、脑膨出等提示NTDs的表型(图 1)。
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| 图 1 正常饲喂组及低叶酸联合MTX诱导NTDs组胎鼠背侧面观 |
2.2 lncRNA差异基因情况
通过高通量测序检测到具有显著差异的lncRNA共47个，有38个上调：LOC101056120、Gm20784、Gm8185、Gm4017、LOC102638475、LOC102637279、Gm6659、Mir103-2、Gm13136、Gm10421、LOC102632488等；9个下调：LOC102636519、Rpl19-ps1、LOC102636376、Xist、Gm4544、AK157302、LOC102634818、LOC102636563、LOC102638279(图 2)。
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| 图 2 正常饲喂组和低叶酸联合MTX诱导NTDs组胎鼠脑组织的差异lncRNA分布火山图 |
运用GraphPad 8.0对NTDs组和对照组中差异显著的lncRNA绘制热图(图 3)，红色表示相对高表达，绿色表示相对低表达。图中可直观地观察到lncRNAs在正常组织与NTDs疾病模型中表达差异情况，为后续研究lncRNAs调控NTDs发生发展提供依据。
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| 图 3 正常饲喂组和低叶酸联合MTX诱导NTDs组胎鼠脑组织中具有显著差异的lncRNA热图 |
2.3 差异lncRNA-mRNA关联分析及共表达关系网络构建
为进一步探究NTDs模型中lncRNA与mRNA的共表达情况，将具有显著差异的lncRNA和mRNA进行共表达分析，实验组共关联132个mRNA，46个lncRNA，对照组共关联143个mRNA，39个lncRNA，共关联919对。利用在线网站g: profiler (g: Profiler——a web server for functional enrichment analysis and conversions of gene lists (ut.ee))、DAVID (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)、KOBAS (http://kobas.cbi.pku.edu.cn/index.php)进行GO (表 1)及KEGG (图 4)分析，得到关联的mRNA功能富集情况，其中与神经及发育相关且具有显著差异的GO条目如表 1所示，KEGG通路富集情况如图 4所示。并基于lncRNA-mRNA分析结果，分别对正常饲喂组(图 5A)与低叶酸联合MTX诱导NTDs组(图 5B)构建lncRNA-mRNA共表达关系网络，实线表示正相关，虚线表示负相关。
| GO条目 | 编码 | P值 |
| 管道发育 | GO: 0035295 | < 0.001 |
| 胶原蛋白代谢过程 | GO: 0032963 | 0.002 |
| 系统发育 | GO: 0048731 | 0.002 |
| 多细胞生物发育 | GO: 0007275 | 0.003 |
| 心室心肌组织发育 | GO: 0003229 | 0.004 |
| 组织发育 | GO: 0009888 | 0.015 |
| 动物器官形态发生 | GO: 0009887 | 0.022 |
| 动物器官发育 | GO: 0048513 | 0.022 |
| 解剖结构形态发生 | GO: 0009653 | 0.025 |
| 解剖结构发育 | GO: 0048856 | 0.039 |
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| 图 4 胎鼠脑组织差异lncRNA-mRNA共表达分析中RNA的KEGG富集分析 |
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| A：正常饲喂组lncRNA-mRNA共表达网络图；B：低叶酸联合MTX诱导NTDs组lncRNA-mRNA共表达网络图 图 5 胎鼠脑组织差异lncRNA-mRNA共表达网络图 |
2.4 lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA网络构建
基于miRanda及RNAhybrid预测得到的结果，得到18对lncRNA-miRNA-mRNA调控关系，根据此构建lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA网络(图 6)。结果显示：Xist、LOC102633899、1700086L19Rik等lncRNA通过对mmu-miR-302d-5p、mmu-miR-98-5p、mmu-miR-196b-5p、mmu-miR-20b-5p、mmu-let-7i-5p、mmu-miR-28c产生负调控作用，靶向差异基因Sema4f、Padi2、Lin28a、Doc2a、Cngb3、Gas7、Nfic、Chmp4c、Scara5、Cygb、LOC102634126，提示NTDs可能受lncRNA相关ceRNA机制的网络调控。
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| 图 6 胎鼠脑组织差异lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA调控网络 |
2.5 lncRNA Xist、Padi2和Sema4f相对表达量的检测结果
经琼脂糖凝胶进行电泳检测RNA质量，胶图显示条带清晰、完整，质量合格，可进行后续qPCR验证(图 7)。对重点关注的lncRNA Xist及下游靶基因Padi2、Sema4f通过qPCR实验分别在NTDs胎鼠脑组织及叶酸缺乏的mESCs中验证高通量测序结果。实验结果显示，与对照组相比，NTDs胎鼠脑组织中，lncRNA Xist及下游靶基因Padi2、Sema4f均表现出明显的下调趋势(图 8)，在两组间的差异均具有统计学意义(P < 0.05)；在叶酸缺乏的mESCs中，上述基因也同样表现出显著下调趋势(P < 0.05)。实验结果显示lncRNA Xist及下游靶基因的相对表达水平变化与测序结果一致。
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A: 提取的胎鼠脑组织的RNA电泳图；B：提取的mESCs的RNA电泳图 CON-1、CON-2、CON-3:正常饲喂组样本，NTD-1、NTD-2、NTD-3: 低叶酸联合MTX诱导NTDs组样本；FA4-1、FA4-2、FA4-3：叶酸正常组样本，FA0-1、FA0-2、FA0-3：叶酸缺乏组样本 图 7 提取的胎鼠脑组织及mESCs的RNA电泳结果 |
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CON: 正常饲喂组，NTD：低叶酸联合MTX诱导NTDs组；FA4：叶酸正常组，FA0:叶酸缺乏组 A、B、C：qPCR检测胎鼠脑组织中lncRNA Xist、Sema4f、Padi2相对表达量；D、E、F：qPCR检测mESCs中lncRNA Xist、Sema4f、Padi2相对表达量 图 8 qPCR检测胎鼠脑组织及mESCs中lncRNA Xist、Sema4f、Padi2相对表达水平(n=3，x±s) |
3 讨论
NTDs是严重的先天性畸形。流行病学研究提示，全球每33名出生的婴儿中就有1名患有NTDs。近年来，由于我国人民生活水平明显改善，NTDs发病率大幅度下降[18]。NTDs是外界环境因素与遗传因素共同作用引起的疾病，但其发病的具体分子机制尚不明确。研究显示，叶酸、维甲酸、肌醇等摄入不足可通过相关基因，进而导致甲基化异常、翻译后修饰改变等表观遗传调控失常，这提示环境因素在NTDs发病机制中占据关键作用[2, 19-20]。叶酸缺乏是诱发NTDs最重要的环境因素，叶酸作为辅酶参与一碳代谢，可对重要生物分子(脂质、氨基酸、DNA)进行甲基化修饰。叶酸缺乏可导致贫血、生殖异常和胚胎发育障碍等问题[21]。多项随机对照试验表明，高剂量叶酸(4 mg)是预防同一母体孕育胎儿再次发生神经管缺陷的重要因素，并且，高剂量叶酸可显著预防低剂量叶酸(0.4 mg) 后神经管缺陷的首次发生[22]。lncRNA作为进化保守的非编码RNA，通过多种机制参与调控发育、分化、细胞重编等，其表达的改变与许多疾病有关，对脑发育的作用尤为重要[7]。因此，探究lncRNA在叶酸缺乏下对NTDs发生所产生的作用是十分有必要的。
3.1 构建低叶酸联合MTX诱导的NTDs胎鼠模型及叶酸缺乏的mESCs细胞模型MTX作为抗叶酸类抗代谢药，可抑制二氢叶酸还原酶，使二氢叶酸无法还原成有生理活性的四氢叶酸，从而使嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸生物合成过程中的一碳基团转移作用受阻，抑制DNA的生物合成[23]。课题组前期研究显示，在低叶酸饲料喂养4周后，选择在受孕7.5 d时按照1.5 mg/kg的剂量对小鼠进行腹腔注射MTX，发现NTDs发生率最高。因此，通过低叶酸联合MTX的方式成功诱导具有NTDs表型的胎鼠模型，对探究叶酸缺乏情况下NTDs的发生发展具有重要意义。此外，构建叶酸缺乏的mESCs细胞模型，有助于进一步从细胞层面上证实，叶酸缺乏对筛选到的相关基因表达存在调控关系。
3.2 构建低叶酸联合MTX诱导的NTDs胎鼠模型的lncRNA相关ceRNA网络本研究建立低叶酸联合MTX诱导的NTDs胎鼠模型，通过高通量测序，筛选差异lncRNA基因，构建lncRNA-mRNA共表达网络，并对共表达网络中的mRNA进行GO/KEGG功能富集分析。GO分析中显示，lncRNA-mRNA共表达网络中的mRNA参与了管道发育、胶原蛋白代谢过程、系统发育等生物学过程(P < 0.05)，提示该lncRNA-mRNA共表达网络可能与胚胎发育存在密切联系；KEGG通路富集分析显示，PI3K-Akt信号通路存在显著富集(P < 0.05)，该通路已被证实与NTDs发生有密切关系[24]；后续基于lncRNA-miRNA-mRNA调控关系，构建lncRNA相关ceRNA调控网络，结果显示Xist、LOC102633899、1700086L19Rik等lncRNA对Sema4f、Padi2、Lin28a、Gas7、Nfic等靶基因起调控作用。研究认为lncRNA Xist可以影响神经管的正常发育[25]；Lin28a耗竭可引起小头畸形的发生[26]；Gas7在神经系统中表达丰富，并在脊椎动物的神经发生过程中发挥重要作用[27]；在NTDs小鼠模型中，Nfic的异常升高可在神经管闭合期间破坏细胞稳态，引起NTDs的发生[28]。因此，在NTDs胎鼠模型中构建lncRNA相关ceRNA网络，预测相应的靶基因，对进一步探究lncRNA如何调控NTDs的发生发展至关重要。
3.3 lncRNA Xist及预测靶基因Sema4f、Padi2相对表达量上调与叶酸缺乏条件下的NTDs存在调控关系LncRNA Xist作为X染色体失活的主要调节者，在胚胎发育早期平衡对性染色体基因的剂量补偿。据报道，雌性胚胎NTDs样本中存在Xist基因的表达异常，p53基因通过调控Xist水平影响神经管闭合，提示Xist表达与神经管发育有密切关系[25]。ceRNA调控网络假说为lncRNA和mRNA之间的调控作用研究增加了更多的探索方向，还为后续发现新的诊断或预后生物标志物奠定了基础。许多研究表明，诸多lncRNA可作为癌症的生物标志物，如HOTAIR、THCAT126等[29]。既往研究中lncRNA Xist、Sema4f及Padi2亦因在乳腺癌及多形性胶质母细胞瘤中异常表达被认为是重要的潜在生物标志物[30-32]。本研究发现，叶酸缺乏的NTDs小鼠胎脑组织中lncRNA Xist及预测靶基因Sema4f、Padi2的表达均出现异常。Sema4f、Padi2或许可作为NTDs的潜在生物标志物，以供进一步研究。
既往NTDs相关研究中尚未发现构建lncRNA相关ceRNA网络的报道，本研究在低叶酸联合MTX诱导的NTDs胎鼠模型中构建了lncRNA相关ceRNA调控网络，有助于理解lncRNA相关ceRNA作用机制在低叶酸条件下NTDs中的作用，为后续进一步探明lncRNA在NTDs分子层面上的异常调控机制及临床诊疗提供重要依据。
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