急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是急性肺损伤最严重的阶段，其平均病死率为30%~40%[1-2]。在ARDS的晚期，持续性肺泡损伤、修复、重建和过度的细胞外基质沉积导致肺纤维化[3]。有研究表明肺纤维化的程度与ARDS的预后和死亡率密切相关[4-6]。此外，内皮功能障碍导致内皮细胞(endothelial cells，EC)损伤和血管生成受损，也被认为是ARDS发病机制中的重要致病机制。然而，导致纤维增生性ARDS的因素以及这种病理反应的潜在机制仍不清楚。内皮-间质转化(endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT) 是成纤维细胞的来源之一[7-8]。内皮细胞在此过程中其细胞骨架开始变化，细胞间黏附力下降，最终转化为梭型的成纤维细胞[9]。抑制EndMT、恢复EC功能，可有效缓解ARDS的发病进程。
隐丹参酮(cryptotanshinone，CTS)是从丹参根中提取的一种脂溶性化合物，不仅具有抗氧化、抗炎症和抗纤维化等多种药理活性[10]，还能逆转上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程[11]。EndMT早于EMT发生[12]，我们推测CTS可以改善ARDS患者的早期肺纤维化。因此，本研究通过气管滴注脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)制作ARDS小鼠模型，以验证CTS是否可通过EndMT减轻ARDS小鼠的早期肺纤维化。
1 材料与方法 1.1 实验动物分组及ARDS模型构建8周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠，体质量18~25 g，购自重庆医科大学实验动物中心。将C57BL/6J小鼠适应性喂养7 d后随机分为①正常组(Control)：腹腔注射等量无菌磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)；②模型组(LPS)：气管滴注LPS(5 mg/kg)造模，7 d后处死小鼠；③处理组(CTS+LPS)：LPS建模前腹腔注射CTS(60 mg/kg)预处理3 d，建模完成后连续予以7 d；④CTS组(CTS)：腹腔注射等量CTS。每天记录1次每只小鼠的体质量及生存情况。末次给药24 h后处死小鼠，结束实验，并收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)和肺组织以备后续实验使用。
1.2 主要试剂隐丹参酮购于美国Med Chem Express公司；脂多糖、BCA试剂盒、羟脯氨酸试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、极超敏ECL化学发光试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG抗体购于武汉三鹰生物技术有限公司；甘油醛-3-磷酸脱氢(GAPDH)抗体购于南京巴傲得生物科技有限公司；兔抗CD31、波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)购于美国Cell Signaling Technology公司；兔抗VE-cadherin购于美国Invitrogen公司。
1.3 肺组织病理学检查末次给药24 h后，腹腔注射1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉小鼠，充分暴露胸腔，取各组右肺组织，利用4%多聚甲醛固定24 h后包埋在石蜡中，肺组织切片后用HE和Masson染色，显微镜下观察肺组织的病理变化。参照肺损伤评分和肺纤维化评分标准进行评分[13-14]。
1.4 肺组织湿/干质量(wet-to-dry，W/D) 比值取小鼠右肺称取湿质量，然后将肺组织置于干燥箱中，60 ℃干燥48 h，称取干质量。根据前后称量结果计算肺组织的W/D。
1.5 BALF中总细胞和蛋白浓度以及炎症相关细胞因子检测经气管注射1 mL冰磷酸盐缓冲液(PBS)灌洗左肺，30 s后缓慢回抽，重复3次，将收集到的BALF，在4 ℃下以1 500 r/min离心15 min，留取BALF离心后的沉淀用于总细胞计数，上清分别应用BCA试剂盒检测蛋白浓度和ELISA试剂盒测定BALF上清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、TGF-β1的含量。
1.6 羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)含量测定将肺组织称重并尽量剪碎以便消化。严格按照试剂盒说明书操作，读取各孔560 nm波长处光密度值D(560)，并通过公式计算出待测样品的含量。
1.7 免疫组化(immunocytochemistry，IHC)检测EndMT表达取肺组织石蜡切片，脱蜡、水化、抗原修复、阻断内源性过氧化酶，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育50 min，显色、复染、脱水、透明、封片，显微镜下观察，用Image J软件分析蛋白的相对表达量。
1.8 Western blot检测EndMT标志蛋白表达称取适量肺组织制备成组织匀浆，置于冰冷组织裂解液，在4℃下以12 000 r/min离心10 min，取上清液。采用BCA进行蛋白定量，调整蛋白浓度。配置浓缩胶和分离胶，电泳后转膜至PVDF膜，封闭1 h。一抗4 ℃孵育过夜，二抗常温孵育1 h。超敏发光液显影曝光，Image J软件系统对蛋白条带灰度值进行分析。
1.9 统计学方法应用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析，数据以x±s表示，各组间的比较采用单因素方差分析，样本均数间的比较采用LSD-t检验。P < 0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 CTS对ARDS小鼠生存曲线及体质量变化的影响与正常组比较，模型组小鼠的生存率和体质量均在气管滴注LPS后均明显下降(P < 0.05)；与模型组比较，处理组小鼠的生存率和体质量均明显上升(P < 0.05)。见图 1。
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a：P < 0.05，与正常组比较；b：P < 0.05，与模型组比较 A：CTS对ARDS小鼠生存率影响；B：CTS对ARDS小鼠体质量影响 图 1 小鼠7 d生存率和体质量分析 (n=3，x±s) |
2.2 CTS对ARDS小鼠肺损伤的影响
正常组小鼠肺组织保持正常组织结构，未见明确炎症细胞浸润。与正常组比较，模型组小鼠肺组织大量炎性细胞浸润，肺泡结构广泛破坏，肺泡毛细血管充血扩张，小鼠肺损伤评分、肺组织W/D、BALF中细胞总数及蛋白浓度明显升高(P < 0.05)；与模型组比较，处理组小鼠的肺组织病变较模型组明显减轻，肺泡结构有所恢复，炎症细胞浸润减少，小鼠肺损伤评分、肺组织W/D、BALF中细胞总数及蛋白浓度明显下降(P < 0.05)。见图 2。
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a：P < 0.05，与正常组比较；b：P < 0.05，与模型组比较; 1：正常组；2：模型组；3：处理组；4：CTS组 A：HE染色观察肺组织病理学改变；B：肺损伤评分；C：肺组织W/D比值；D：BALF中蛋白浓度；E：BALF中总细胞计数 图 2 CTS对ARDS小鼠肺损伤的影响 (n=3，x±s) |
2.3 CTS对ARDS小鼠BALF中炎性细胞因子和促纤维化细胞因子的影响
与正常组比较，模型组小鼠BALF中促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)和促纤维化因子TGF-β1分泌量显著升高，抗炎因子(IL-10)分泌量显著减少(P < 0.05)；与模型组比较，处理组可明显降低促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)和促纤维化因子(TGF-β1)，增加抗炎因子(IL-10)的分泌量(P < 0.05)。见图 3。
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a：P < 0.05，与正常组比较；b：P < 0.05，与模型组比较; 1：正常组；2：模型组；3：处理组；4：CTS组 A：TGF-β1水平；B：TNF-α水平；C：IL-1β水平；D：IL-6水平；E：IL-10水平 图 3 CTS对ARDS小鼠BALF中炎症因子和促纤维化因子的影响 (n=3，x±s) |
2.4 CTS对ARDS小鼠早期肺纤维化的影响
正常组小鼠肺组织保持正常组织结构，未见纤维组织增生性改变。模型组可见纤维组织增生；处理组小鼠的肺组织未见纤维组织增生。见图 4A。
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a：P < 0.05，与正常组比较；b：P < 0.05，与模型组比较 A：Masson染色观察小鼠肺组织病理学改变；B：肺纤维化程度评分；C：HYP含量 图 4 CTS对ARDS小鼠早期肺病理性纤维增生的影响 (n=3，x±s) |
与正常组比较，模型组小鼠纤维化严重程度评分显著升高(P < 0.05)；与模型组比较，处理组纤维化严重程度评分显著降低(P < 0.05)。见图 4B。
2.5 CTS对ARDS小鼠肺组织HYP含量的影响与正常组比较，模型组肺组织HYP水平均显著升高(P < 0.05)；与模型组比较，处理组HYP水平均明显下降(P < 0.05)。见图 4C。
2.6 CTS对ARDS小鼠肺组织中CD31、α-SMA蛋白表达的影响与正常组比较，模型组小鼠肺组织中CD31阳性表达显著减弱，α-SMA阳性表达显著增强(P < 0.05)；与模型组比较，处理组CD31阳性表达出现上调，α-SMA阳性表达出现下调(P < 0.05)，见图 5。
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| 图 5 IHC观察CTS对小鼠肺组织CD31和α-SMA表达的影响 |
2.7 CTS对ARDS小鼠肺组织中VE-cadherin、Vimentin、α-SMA蛋白表达的影响
与正常组比较，模型组小鼠肺组织中Vimentin、α-SMA蛋白水平均显著升高，VE-cadherin蛋白水平显著降低(P < 0.05)；与模型组比较，处理组均可明显抑制Vimentin、α-SMA蛋白水平的表达和减缓VE-cadherin蛋白水平的表达(P < 0.05)，见图 6。
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a：P < 0.05，与正常组比较；b：P < 0.05，与LPS模型组比较 A：各组小鼠肺组织Western blot检测结果；B：VE-cadherin蛋白相对表达量；C：Vimentin蛋白相对表达量；D：α-SMA蛋白相对表达量 图 6 隐丹参酮对内皮间质转化标志物相关蛋白的影响 (n=3，x±s) |
3 讨论
2019冠状病毒疾病(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)在全球范围内相继爆发，其感染人数不断上升，其中重症患者最终发展为ARDS[15]。尽管许多患者在ARDS的急性病程中幸存下来，但仍有部分患者死于进行性肺纤维化[16]。此外，ARDS患者早期出现肺纤维增生性改变已成为与患者预后不良、高死亡率和患者长期生命质量相关的关键因素[17]。然而，目前的研究中仍缺乏特异性治疗来减少ARDS肺部炎症反应和降低肺部病理性纤维化。
丹参及其有效成分在治疗间质性肺病方面已被广泛研究。例如，丹参酮ⅡA可减少小鼠因脂多糖诱导引起的炎症反应和胶原沉积[18]。除此之外，丹酚酸B可阻断TGF-β1诱导的成纤维细胞增殖和肌成纤维细胞分化[2]。但丹参及其有效成分是否在ARDS中发挥治疗作用，尚未见报道。CTS是从丹参根中提取的一种脂溶性化合物，在心血管疾病尤其是动脉粥样硬化[19]和心脏纤维化[20-21]中具有广泛的治疗作用。在本研究中，我们成功地在小鼠体内构建了LPS诱导的ARDS模型[22]，在LPS诱导后，肺组织充满大量炎症细胞，纤维组织增生，W/D重量比、BALF中蛋白质浓度和总细胞计数以及促炎因子分泌增加，抗炎因子分泌减少。本研究结果中促纤维化因子的增加和各实验组羟脯氨酸(HYP)浓度的显著差异也表明LPS诱导小鼠ARDS后出现早期肺纤维化。我们的研究结果进一步表明，CTS可以通过调节肺损伤、炎症反应、早期肺纤维化、羟脯氨酸(HYP)含量来改善LPS诱导的ARDS。因此，CTS对ARDS小鼠的炎症反应和早期肺纤维化具有一定的保护性作用。
ARDS的致病特点是内皮异常激活和损伤[23]。在ARDS的早期，肺微血管内皮细胞首先受到影响。ARDS的重要发病机制是内皮受损导致内皮修复和血管生成功能障碍[1]。新近研究认为ARDS急性病程中肺内皮细胞的抵抗力低于肺上皮细胞[24]，并且肺内皮细胞是成纤维细胞的主要来源之一[25-26]。因此，我们认为在ARDS早期进行修复肺血管内皮功能障碍的治疗对患者而言更有价值。本研究结果表明，经LPS诱导后，小鼠内皮细胞标志物(CD31、VE-cadherin)水平显著降低，间质细胞标志物(Vimentin、α-SMA)水平升高；而CTS的治疗有效改善了这一过程，提示CTS可以通过抑制EndMT过程以减轻ARDS后的肺纤维化。
综上所述，我们发现ARDS小鼠的体质量曲线和生存率在CTS治疗后有了显著的上升，其次CTS可以通过抑制EndMT过程减缓肺纤维化的进展，并显著降低ARDS小鼠早期的死亡率。这些发现可能为治疗ARDS和预防ARDS后早期肺纤维化提供新的治疗方法。
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